董菡，胡書(shū)宜，袁雨霞，杜戎，郭芷妮，郭亞輝，姚衛(wèi)蓉，錢(qián)和

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122）

抗生素是一類(lèi)由微生物產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的物質(zhì)，可以干擾其它生物細(xì)胞的發(fā)育功能，抑制細(xì)菌的繁殖和代謝，從而達(dá)到殺菌的目的?？股貫E用不僅會(huì)對(duì)水體和土壤等造成環(huán)境污染，還會(huì)提高抗性基因的頻率，殘留的抗生素會(huì)通過(guò)食物鏈的富集作用傳遞到人體［1］，破壞人體的正常菌群，降低人體的免疫能力，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害。適配體是一種對(duì)目標(biāo)物有特異性識(shí)別作用、并可成為獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA或RNA序列，它可利用體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)制作。適配體可以通過(guò)其特定的三維結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)高特異性、高親和力地結(jié)合。傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法基于抗原抗體結(jié)合，制備周期長(zhǎng)且成本高；儀器分析方法依賴(lài)于大型儀器設(shè)備，操作復(fù)雜且受空間限制。適配體作為新型的分子識(shí)別元件，具有熱穩(wěn)定性好、可長(zhǎng)期保存、無(wú)免疫原性、活性均一、變性后可復(fù)性、無(wú)需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)［2］，是抗生素殘留快速檢測(cè)的良好途徑。

適配體在抗生素殘留檢測(cè)中應(yīng)用十分廣泛，利用核酸適配體和目標(biāo)抗生素特異性的識(shí)別作用，通過(guò)熒光／比色信號(hào)強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗生素定量檢測(cè)［3］。根據(jù)信號(hào)基團(tuán)和適配體的作用方式，可分為標(biāo)記型適配體和免標(biāo)記型適配體。

標(biāo)記型適配體是對(duì)適配體DNA的一端或兩端標(biāo)記信號(hào)分子（通常為有機(jī)小分子熒光染料、熒光納米材料、納米金等）。靶標(biāo)與適配體結(jié)合后，適配體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響了信號(hào)分子之間的相互作用或信號(hào)分子與基底的相互作用，從而產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)。例如，通過(guò)貴金屬納米顆粒的等離子體效應(yīng)和催化底物顯色實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的輸出［4］，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，且可實(shí)時(shí)檢測(cè)。

免標(biāo)記適配體是將信號(hào)分子通過(guò)非共價(jià)的形式結(jié)合到特定的DNA結(jié)構(gòu)上，因?yàn)樾盘?hào)分子的結(jié)合對(duì)適配體結(jié)構(gòu)具有依賴(lài)性，使得適配體只有在與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合、形成特定的DNA結(jié)構(gòu)后，熒光／比色信號(hào)才會(huì)變化。相較于標(biāo)記型適配體，免標(biāo)記型適配體在構(gòu)筑中無(wú)需耗時(shí)的探針標(biāo)記和純化步驟，成本低廉，易于設(shè)計(jì)和操作，且降低了適配體傳感器制備的批間差異［3］，避免了信號(hào)標(biāo)記甚至有害放射性物質(zhì)的結(jié)合和純化［5］。免標(biāo)記適配體是目前適配體檢測(cè)技術(shù)的熱點(diǎn)研究方向之一。

1 標(biāo)記型適配體

標(biāo)記型適配體需在DNA上標(biāo)記信號(hào)分子，當(dāng)適配體與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合后，影響信號(hào)分子之間或信號(hào)分子與基底的相互作用，導(dǎo)致光信號(hào)產(chǎn)生變化。常用方法有比色法和熒光法兩類(lèi)。

1.1 比色法

在眾多分析檢測(cè)方法中，比色法以其肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)結(jié)果、無(wú)需復(fù)雜設(shè)備且易于實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。目前，基于比色適配體傳感器檢測(cè)抗生素主要通過(guò)貴金屬納米顆粒的等離子體效應(yīng)和催化底物顯色實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的輸出。

因?yàn)榱蚧鶊F(tuán)與金有較強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合力，故常用的比色法適配體多利用巰基對(duì)適配體或其互補(bǔ)鏈進(jìn)行修飾，通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)的方式固定到納米金表面（如圖1）［6］。適配體探針上的核苷酸序列分別與靶物質(zhì)配對(duì)，即可在金粒子上連接多條寡核苷酸鏈，當(dāng)金探針按序與靶DNA連接后，即能有序地形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而納米金顆粒將因此而發(fā)生顏色變化。劉麗紅等［7］設(shè)計(jì)了基于適配體比色法的霉菌毒素快速靈敏檢測(cè)試紙條，其中試紙條結(jié)合墊上固定的通過(guò)巰基連接的膠體金標(biāo)記適配體（Aptamer 1）探針，層析膜檢測(cè)線(xiàn)是通過(guò)鏈霉親和素固定的Aptamer 1識(shí)別序列的互補(bǔ)序列DNA 1，質(zhì)控線(xiàn)是通過(guò)鏈霉親和素固定的Aptamer 1非識(shí)別序列的互補(bǔ)序列DNA 2。結(jié)果顯示，該適配體試紙條可成功檢測(cè)霉菌毒素含量，檢出限為0.1 μg／mL。該類(lèi)抗生素檢測(cè)的適配體試紙條解決了免疫層析試紙條在抗體制備時(shí)價(jià)格高昂、不易保存、制備周期長(zhǎng)等問(wèn)題，在抗生素快速檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖1 納米金在DNA 識(shí)別與檢測(cè)中的變色過(guò)程

1.2 熒光法

構(gòu)建標(biāo)記型熒光適配體傳感器需對(duì)傳感器探針進(jìn)行熒光標(biāo)記。TAN等［8］利用氧化石墨烯(GO)的水溶性、優(yōu)異的熒光猝滅能力和易于合成等優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種基于GO水凝膠的熒光法測(cè)定氧四環(huán)素。該實(shí)驗(yàn)將GO片、腺苷和熒光素標(biāo)記的適配體物理混合在一起制備GO水凝膠，其中腺苷和適配體作為交聯(lián)劑來(lái)連接GO片，形成三維宏觀結(jié)構(gòu)。在最佳條件下，開(kāi)發(fā)的熒光生物傳感器具有25～1 000 μg／L的線(xiàn)性范圍，檢測(cè)限低至25 μg／L。但相較于熒光納米材料，熒光染料存在抗光漂白性差的缺點(diǎn)，其熒光性能易受外界因素影響。

量子點(diǎn)(QDs)又稱(chēng)為半導(dǎo)體納米顆粒，是由II～VI族或III～V族元素組成的新型熒光納米材料，是目前常用的新型熒光標(biāo)記物［9］。具有易于制備和修飾的性質(zhì)及良好的信號(hào)放大作用等優(yōu)點(diǎn)。Alibolandi等［10］建立了基于碲化鎘量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體（CdTe QDs-Apt）和GO的氯霉素檢測(cè)傳感器。適配體與氯霉素發(fā)生特異性結(jié)合，能量從QDs-Apt轉(zhuǎn)移到GO，有效地淬滅了CdTe QDs-Apt的熒光，通過(guò)回收淬滅熒光可以檢測(cè)出氯霉素。結(jié)果表明，向250 μg／mL GO溶液中添加CdTe QDs-Apt可得到較高的熒光猝滅效率，產(chǎn)生超過(guò)90%的熒光猝滅。使用0.1～10 nmol／L系列濃度氯霉素溶液的適配體傳感器，檢測(cè)限和定量限分別為98、987 pmol／L。

Shim等［11］開(kāi)發(fā)了基于黃曲霉毒素（AFB1）的核酸適配體半試紙條，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的半定量檢測(cè)。其思路是AFB1適配體用生物素標(biāo)記，在檢測(cè)線(xiàn)處固定的是鏈霉親和素，用來(lái)與生物素結(jié)合，控制線(xiàn)處固定的是抗Cy-5熒光染料的抗體，最后利用熒光進(jìn)行檢測(cè)。采用競(jìng)爭(zhēng)法，在生物素修飾的適配體、靶標(biāo)AFB1、Cy-5標(biāo)記的適配體互補(bǔ)序列探針混合物溶液中插入試紙條，適配體互補(bǔ)序列探針、靶標(biāo)AFB1兩者與適配體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，隨著溶液的滲移，在檢測(cè)線(xiàn)處結(jié)合的有生物素標(biāo)記的適配體與靶標(biāo)復(fù)合物，還有生物素標(biāo)記的適配體與Cy-5標(biāo)記的互補(bǔ)序列復(fù)合物，檢測(cè)線(xiàn)處熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)的含量呈負(fù)相關(guān)，檢測(cè)原理如圖2所示。這種試紙條利用熒光強(qiáng)度來(lái)確定AFB1的檢出限為0.1 ng／mL，在玉米樣品溶液中的檢出限為0.3 ng／g。

圖2 熒光染料標(biāo)記適配體檢測(cè)黃曲霉毒素原理圖

2 免標(biāo)記型適配體

免標(biāo)記型適配體不需要化學(xué)鍵合信號(hào)分子［12］，免去了染料和材料的結(jié)合和純化，且易于設(shè)計(jì)、操作簡(jiǎn)便，與標(biāo)記型適配體相比價(jià)格低廉，是理想的抗生素快檢途徑。

2.1 比色法

納米粒子由于具有極強(qiáng)的吸附力和較好的生物相容性而被廣泛應(yīng)用于適配體生物傳感器的構(gòu)建。其中金納米粒子（AuNPs）是迄今研究和使用最多的金屬納米粒子之一。AuNPs溶液也稱(chēng)膠體金溶液，是一種帶負(fù)電的膠體溶液，在靜電斥力作用下具有良好的穩(wěn)定性。但在高鹽溶液中，AuNPs的穩(wěn)定性會(huì)遭到破壞而發(fā)生聚集，該過(guò)程中溶液也會(huì)由酒紅色逐漸加深至藍(lán)色或灰色，從而被廣泛用于建立基于AuNPs的比色分析法（原理如圖3所示）［13］。該方法利用靈敏的顏色變化來(lái)檢測(cè)靶分子，具有可視化、簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 基于適配體和納米金的比色法檢測(cè)原理

Zhou等［14］提出了一種測(cè)定氧氟沙星（OFL）水溶液中抗生素含量的比色法，它是基于適配體和AuNPs結(jié)合原理。在沒(méi)有OFL的情況下，AuNPs被適配體包裹，即使在高NaCl濃度下也能保持分散。膠體分散AuNPs的溶液保持紅色，并在520 nm處出現(xiàn)吸收峰。在OFL存在的情況下，它將與適配體結(jié)合，然后從AuNPs中釋放適配體。因此，AuNPs會(huì)在鹽溶液中聚集，使顏色逐漸變藍(lán)，在650 nm處出現(xiàn)新的吸收峰。此方法在OFL濃度為20～400 nmol／L的范圍內(nèi)具有線(xiàn)性響應(yīng)，檢出限為3.4 nmol／L。

2.2 熒光法

非標(biāo)記型熒光適配體中使用的熒光染料原理與標(biāo)記型不同。非標(biāo)記熒光適配體是將熒光染料通過(guò)非共價(jià)的形式結(jié)合到特定的DNA結(jié)構(gòu)上，并且只有在與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合、形成特定的DNA結(jié)構(gòu)后，熒光才會(huì)增強(qiáng)。Yang等［15］建立了一種基于N-甲基嗎啡啉（NMM）／G–四鏈體結(jié)構(gòu)的卡那霉素檢測(cè)的免標(biāo)記熒光策略。在沒(méi)有卡那霉素的情況下，兩個(gè)ssDNA（如圖4）相互雜交，阻礙了P1（5’-GGGTTTTGGGTCGGCTTAGCCTCAACCCCC AGGGTTTTGGG-3’）形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。因此，即使添加了NMM，也無(wú)法檢測(cè)到熒光增強(qiáng)。當(dāng)添加卡那霉素時(shí)，它將以高親和力特異性結(jié)合P2（5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’），導(dǎo) 致P1從P1–P2復(fù)合物中釋放。處于游離單一狀態(tài)的P1可以通過(guò)自身折疊并結(jié)合NMM形成G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)，從而顯著增強(qiáng)熒光。實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)向P1–P2復(fù)合物中添加卡那霉素確實(shí)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度急劇增強(qiáng)。因此本策略對(duì)于檢測(cè)卡那霉素是切實(shí)可行的。

圖4 基于NMM／G–四鏈體結(jié)構(gòu)的卡那霉素檢測(cè)過(guò)程示意圖

納米銀簇(AgNCs)作為一種新型熒光納米材料吸引了廣泛關(guān)注［16］，尤其是以DNA為模板合成的銀納米簇，它可以同時(shí)具備發(fā)光功能和識(shí)別功能，避免了以往熒光探針制備中復(fù)雜的熒光分子標(biāo)記過(guò)程和識(shí)別分子修飾過(guò)程［17］。林碧霞等［18］建立了一種基于DNA模板合成的銀納米簇檢測(cè)卡那霉素的熒光方法（如圖5）。

圖5 銀納米簇檢測(cè)卡那霉素的原理圖

當(dāng)加入目標(biāo)物質(zhì)卡那霉素時(shí)，適配體DNA序列識(shí)別卡那霉素形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使更多的G、C堿基靠近銀簇序列，同時(shí)引起DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使銀納米粒子的粒徑變小，導(dǎo)致銀簇?zé)晒庠鰪?qiáng)。且增強(qiáng)的熒光比值與卡那霉素濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，可據(jù)此進(jìn)行卡那霉素的定性、定量檢測(cè)。此外，該方法雖比用羅丹明B、熒光素、CdTe 作為發(fā)光元件所建立的方法檢出限高，但本方法的線(xiàn)性范圍更寬，且試劑毒性更低。

目前最常見(jiàn)的dsDNA結(jié)合染料包括溴化乙錠，碘化丙啶、Hoechst染料SYBR Green I（SG I）花青染料等［19］。SG I于1994年開(kāi)發(fā)，用于凝膠中的DNA染色，此后一直被廣泛用于生物分析［20］，因?yàn)樗哂袃蓚€(gè)優(yōu)異的特性：可與dsDNA選擇性結(jié)合和信噪比較高［21］。Su等［22］開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記生物傳感器，將SG I作為信號(hào)輸出的熒光指示劑來(lái)擴(kuò)增檢測(cè)核酸。靶標(biāo)的存在釋放了探針DNA的引物結(jié)合部分，并觸發(fā)了聚合酶輔助的循環(huán)聚合反應(yīng)，從而產(chǎn)生了大量dsDNA產(chǎn)物，也使SG I的熒光強(qiáng)度得到大幅提高。該生物傳感器可用于靶標(biāo)抗生素的檢測(cè)。

Yang等［23］利用二維有機(jī)納米框架(Cu-TCPP納米片)對(duì)單、雙鏈DNA不同的吸附特性，開(kāi)發(fā)了一種基于信號(hào)放大技術(shù)的免標(biāo)記熒光適配體傳感器檢測(cè)氯霉素。氯霉素可打開(kāi)適配體探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在DNA聚合酶的輔助作用下通過(guò)循環(huán)鏈置換反應(yīng)產(chǎn)生大量的雙鏈DNA，雙鏈核酸染料SYBR Green I嵌入其中，可產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。未參與擴(kuò)增的發(fā)卡被吸附于Cu-TCPP 納米片上，有效地降低了方法的背景熒光信號(hào)，檢出限可低至0.3 pg／mL。

3 展望

隨著對(duì)適配體的不斷研究探索，利用其對(duì)抗生素進(jìn)行定性或者定量的分析方法取得了巨大的進(jìn)展，為食品中抗生素殘留的快速檢測(cè)提供了新的途徑。基于熒光法和比色法的適配體傳感器是目前應(yīng)用最廣泛的適配體傳感器之一，優(yōu)點(diǎn)在于適配體所用實(shí)驗(yàn)材料廉價(jià)易得，對(duì)大分子親和力強(qiáng)，篩選過(guò)程簡(jiǎn)單，靶標(biāo)范圍廣，穩(wěn)定性好，易被活性或指定基團(tuán)修飾。表1為兩類(lèi)型適配體的原理、優(yōu)缺點(diǎn)比較，表2為基于熒光法與比色法的適配體的原理、優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍比較。

表1 標(biāo)記型和免標(biāo)記型適配體的原理與優(yōu)缺點(diǎn)

表2 熒光法和比色法適配體原理與優(yōu)缺點(diǎn)

總之，標(biāo)記型適配體需結(jié)合信號(hào)分子，反應(yīng)快速，具有高辨別能力，但相較于免標(biāo)記適配體所需成本較高且應(yīng)用不夠靈活；免標(biāo)記型適配體是目前抗生素的快速檢測(cè)研究的熱門(mén)，因?yàn)槟軌蚴÷蕴结槝?biāo)記和純化步驟，使制作周期縮短，降低了標(biāo)記適配體探針的批間差異，避免了有害放射性物質(zhì)的結(jié)合和純化，但可能出現(xiàn)非特異性吸附而產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)的問(wèn)題，這也是檢測(cè)復(fù)雜樣品中抗生素殘留的重要挑戰(zhàn)。目前有研究顯示，采用雙信號(hào)模式的免標(biāo)記適配體可以很好地避免此類(lèi)問(wèn)題，依靠G-四鏈體與染料結(jié)合特性和DNA變構(gòu)原理，使用兩類(lèi)免標(biāo)記熒光染料，在抗生素目標(biāo)物出現(xiàn)和未出現(xiàn)時(shí)與不同染料結(jié)合，發(fā)出不同顏色熒光，據(jù)此建立針對(duì)抗生素的雙信號(hào)熒光適配體快速檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)［24］。