劉 靜，朱道仙，盧勁曄，張一多，盧 煒，陸 江*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，泰州 225300)

近年來，隨著寵物老齡化發(fā)展，寵物老年病在臨床上發(fā)病率越來越高，慢性腎衰竭 (chronic renal failure, CRF)便是其中之一。約有1/10的老年犬受到慢性腎衰竭的困擾[1]。該病治療成本高、周期長、并發(fā)癥多，對小動物診療業(yè)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，如何延緩CRF進(jìn)程，提高患犬的生活質(zhì)量，成為寵物臨床上一個難題。

短鏈脂肪酸(SCFAs)是腸中部分菌群分解膳食纖維而產(chǎn)生的碳原子小于6的脂肪酸，具有多種生物學(xué)功能。慢性腎病患者服用產(chǎn)SCFAs的益生菌或攝入SCFAs能降低尿毒素和氧化應(yīng)激水平、保護(hù)殘腎功能和提高生活質(zhì)量[2-3]，腸道菌群改變也可促進(jìn)慢性腎病的發(fā)展[4]。然而，在犬慢性腎衰過程中SCFAs的變化規(guī)律、SCFAs與腸道菌群相互關(guān)系以及SCFAs對腎功能影響等方面尚不清楚。本研究對CRF患犬短鏈脂肪酸水平進(jìn)行了評估，分析CRF犬腸道菌群特征，并探究短鏈脂肪酸與腸道菌群及腎功能指標(biāo)之間的關(guān)系，以期為寵物犬慢性腎衰竭的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床研究

本研究選取2017年9月—2019年12月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)寵物醫(yī)院就診并根據(jù)漸進(jìn)性消瘦病史、高氮血癥及B超檢查腎體積縮小等依據(jù)診斷為慢性腎衰竭的患犬51例。按照國際腎病研究協(xié)會(the International Renal Interest Society，IRIS)制定的犬慢性腎衰竭分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，將其分成輕度慢性腎衰組(M-CRF組，包括Ⅰ級和Ⅱ級)22例，重度慢性腎衰組(S-CRF組，包括Ⅲ級和Ⅳ級)29例。并且根據(jù)年齡、體重相近原則隨機(jī)選取來該寵物醫(yī)院體檢的健康犬26例作為對照組(HC組)，研究對象排除標(biāo)準(zhǔn)為采集樣本前4周使用過益生菌及抗生素等。所有納入研究對象，均向主人闡述了本研究實(shí)施過程，并在主人同意后進(jìn)行相關(guān)研究。

1.2 血液樣本采集及血液生化指標(biāo)測定

所有樣本在就診當(dāng)天采集靜脈血3 mL，1 500 r·min-1離心15 min，分離出血清。采用全自動血液生化分析儀(Catalyst Dx動物生化分析儀，美國愛德士生物科技公司生產(chǎn))檢測血清中血糖(Glu)、總蛋白(TP)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、胱抑素C(Cys-C)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、鈣(Ca)及磷(P)等指標(biāo)。

1.3 糞便樣本采集

就診第2天，無菌收集直腸中糞便，分裝于2個試管中，樣品采集完畢后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。一份用于檢測短鏈脂肪酸含量,另一份用于腸道菌群16S rDNA測序。

1.4 腸道菌群16S rDNA高通量測序

1.4.1 糞便總DNA提取與PCR 稱取無菌糞便樣100 mg，采用Qiagen DNA試劑盒按說明書提取總DNA，再以獲得的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)PCR擴(kuò)增，上游引物為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物為5′-GGACTGCACGGGTATCTAAT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；92 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，6個循環(huán)；92 ℃變性45 s，68 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；然后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，用于后續(xù)操作。

1.4.2 Illumina高通量測序及處理 使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后, 使用Illumina Miseq PE 300平臺對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Paired-end測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)QIIME(version 1.9.1)進(jìn)行去除接頭序列、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列的處理，得到高通量原始堿基序列，用RDF分類器將相似性大于97%的序列劃分為一個分類操作單元(OTU)，與GreenGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到物種注釋。

1.4.3 生物信息學(xué)分析 用QIIME 1.9.1[6]分析菌群α多樣性，用基于weighted UniFrac matrices的主坐標(biāo)分析[7](PCoA)進(jìn)行β多樣性分析，LEfSe分析[8]組間差異菌群，用CCA分析[9]環(huán)境因子與腸道菌群物種相互關(guān)系。

1.5 糞中短鏈脂肪酸測定

糞便中短鏈脂肪酸含量的測定采用氣相色譜法(Agilent 6890 N氣相色譜儀,美國)。準(zhǔn)確稱取200 mg 樣品，加4 mL超純水，振蕩混勻30 min，然后12 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移，重復(fù)以上步驟1次，合并上清液并定容到10 mL離心管中。取4.5 mL上清液，按9∶1體積比在樣品中加入25%偏磷酸，固定3 h以上。然后12 000 r·min-1離心10 min，45 μm濾膜過濾加入上機(jī)瓶。色譜條件：采用DB-1 ms毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，載氣為氮?dú)?，流? mL·min-1，輔助氣為氫氣，火焰離子檢測器(FID)溫度280 ℃,分流比50∶1，進(jìn)樣量2 μL。色譜溫度程序：初始溫度40 ℃，以5 ℃·min-1速度升至70 ℃，維持3 min，再以20 ℃·min-1速度升至160 ℃，維持3 min，最后以35 ℃·min-1速度升至280 ℃，維持3 min。用內(nèi)標(biāo)法計算各短鏈脂肪酸濃度。

1.6 動物試驗(yàn)

為了研究腸道菌群和丁酸鹽對慢性腎衰患犬腎功能的潛在作用，無菌收集上述臨床病例中3只S-CRF患犬的新鮮糞便，充分混勻，參考Zhao等[10]的方法制備糞菌液，并分裝在-80 ℃保存，用于動物試驗(yàn)。選取25只5歲左右，體重約5 kg,雄性中華田園犬飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物飼養(yǎng)房，一犬一籠，自由飲水，環(huán)境溫度為室溫25 ℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。然后將動物隨機(jī)等分為5組：對照組(Con組)、慢性腎衰模型組(5/6 Nx組)、移植CRF患犬腸道菌群組(5/6 Nx+Microbiota組)、補(bǔ)充0.5%丁酸鈉組(5/6 Nx+0.5% Butyrate組)和移植CRF患犬腸道菌群同時補(bǔ)充0.5%丁酸鈉組(5/6 Nx+Microbiota+0.5% Butyrate組)。Con組犬僅作雙側(cè)腎包膜摘除術(shù)，其余各組動物參考王寧等[11]的方法采取腎動脈結(jié)扎法制作慢性腎衰模型。從試驗(yàn)第4周開始，5/6 Nx+Microbiota組動物灌服5 mL CRF犬的糞菌液，5/6 Nx+0.5% Butyrate組動物按300 μg·kg-1體重灌服0.5%丁酸鈉，Nx+Microbiota+0.5% Butyrate組動物灌服5 mL CRF犬的糞菌液同時按300 μg·kg-1體重灌服0.5%丁酸鈉，Con組動物灌服5 mL 0.9%氯化鈉溶液。糞菌液每周灌服2次，0.5%丁酸鈉每天1次， 所有灌服操作均在上午8:00—10:00完成。整個試驗(yàn)過程所有犬飲水及飲食均不受限制。試驗(yàn)總周期為12周。采用“1.2”的方法檢測血中BUN、Cr等腎功能指標(biāo)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 納入研究病例的臨床基本特征

從表1可知，慢性腎衰患犬的腎功能指標(biāo)Cys-C、BUN、Cr及P的水平，炎癥生化標(biāo)志物CRP水平均顯著高于HC組(P<0.05)，且S-CRF組這些指標(biāo)均顯著高于M-CRF組(P<0.05)。而年齡、性別、血中Glu、TP、TG、TC及Ca水平等方面，在3組間無顯著差異。

表1 慢性腎衰竭患犬與健康犬臨床參數(shù)的比較

2.2 慢性腎衰竭患犬腸道菌群多樣性及組成的變化

豐富度和均勻度是衡量腸道菌群多樣性的兩個重要方面。從圖1a、b可以看出，S-CRF組豐富度指標(biāo)觀察物種數(shù)顯著低于M-CRF組及HC組，S-CRF組和M-CRF組均勻度指標(biāo)Simpson指數(shù)顯著低于HC組(P<0.05)。PCoA分析結(jié)果顯示，各組組內(nèi)樣本間距離較短，聚集程度較高；組間比較，HC組和M-CRF組樣本相互聚集，H-CRF組樣本與HC組、M-CRF組樣本間距離較大，呈分離趨勢(圖1c)。各組在門水平主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，二者占80%左右，其他豐度>1%的門主要為梭桿菌門(Fusobacteria)、變形桿菌門(Proteobacteria)及放線菌門(Actinobacteria)(圖1 d)；在屬水平，相對豐度比例≥1%的菌屬主要有普氏桿菌屬(Prevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)及梭桿菌屬(Fusobacterium)等19個屬。這些物種共同構(gòu)成了各組犬腸道核心菌群。

a.各組腸道菌群ɑ多樣性指標(biāo)(觀察物種數(shù))比較；b.各組腸道菌群ɑ多樣性指標(biāo)(Simpson指數(shù))比較；c.各組腸道菌群β多樣性比較(PCoA分析)；d.各組腸道菌群在門水平的比較；e.各組腸道菌群在屬水平比較a. Comparison of gut microflora ɑ diversity index (observed species) in each group; b. Comparison of gut microflora diversity index (simpson index) in each group; c. Comparison of gut microflora beta diversity index (PCoA analysis); d. Comparison of gut microflora abundance in different groups at phylum level; e. Comparison of gut microflora abundance in different groups at genus level圖1 CRF犬腸道菌群組成及多樣性的變化Fig.1 Changes of composition and diversity of gut microflora in dogs with CRF

2.3 慢性腎衰竭患犬腸道差異菌群及其與環(huán)境因子關(guān)系分析

經(jīng)過LEfSe分析(linear discriminant analysis effect size)發(fā)現(xiàn)，S-CRF組與HC組間存在大量差異菌群(LDA值>3.0)，擬桿菌科(Bacteroidaceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)及假單胞菌科(Pseudomonadaceae)等7個物種富集于S-CRF組，普氏桿菌科(Prevotellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、普氏桿菌屬(Prevotella)及普拉梭菌屬(Faecalibacterium)等11個物種富集于HC組(圖2a)；與HC組比較，M-CRF組普氏桿菌科、普氏桿菌屬、梭菌科及瘤胃球菌屬(Ruminococcus)等豐度降低，擬桿菌科、擬桿菌屬及產(chǎn)堿菌科(Alcaligenaceae)等豐度升高(圖2b)；與M-CRF組比較，S-CRF組普氏桿菌科及普氏桿菌屬豐度降低，而擬桿菌科、擬桿菌屬、假單胞菌科及假單胞菌屬(Pseudomonadales)豐度升高(圖2c)。為了進(jìn)一步了解腸道菌群對慢性腎衰內(nèi)環(huán)境變化的適用性，對腸道菌群與環(huán)境因子進(jìn)行典型相關(guān)分析(canonical correlation analyses，CCA)。從圖2 d可以看出，擬桿菌屬、假單胞桿菌屬及副擬桿菌屬等細(xì)菌與腎功能指標(biāo)Cr、BUN、Cys-C及P等呈正相關(guān)關(guān)系，說明這些細(xì)菌適應(yīng)了慢性腎衰的環(huán)境變化；而普氏桿菌屬、普拉桿菌屬及梭菌屬等細(xì)菌與相關(guān)腎功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明慢性腎衰引起的內(nèi)環(huán)境變化可以抑制這些細(xì)菌的生長繁殖。

a. HC組與S-CRF組菌群比較的LDA值；b. HC組與M-CRF組菌群比較的LDA值;c. M-CRF組與S-CRF組菌群比較的LDA值；d.腸道菌群與體內(nèi)環(huán)境參數(shù)間相互關(guān)系的CCA分析a. Comparison of LDA value of differential gut microflora between HC group and S-CRF group; b. Comparison of LDA value of differential gut microflora between HC group and M-CRF group; c. Comparison of LDA value of differential gut microflora between M-CRF group and S-CRF group; d. CCA analysis of the relationship between gut microflora and environmental factors in vivo圖2 差異菌群及其與環(huán)境因子關(guān)系分析Fig.2 Analysis of the relationship between differential gut microflora and environmental factors

2.4 慢性腎衰患犬糞中短鏈脂肪酸的變化

糞中主要短鏈脂肪酸隨著腎衰程度加重呈現(xiàn)降低趨勢(圖3a、b、c)，S-CRF組乙酸、丙酸及丁酸濃度均顯著低于HC組和M-CRF組(P<0.05)，M-CRF 組丁酸濃度顯著低于HC組(P<0.05)。進(jìn)一步分析產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群相對豐度發(fā)現(xiàn)，S-CRF組產(chǎn)乙酸菌及產(chǎn)丙酸菌的相對豐度也顯著低于HC組和M-CRF組(P<0.05)，且S-CRF組和M-CRF組產(chǎn)丁酸菌相對豐度均較HC組降低(圖3 d、e、f)。

2.5 短鏈脂肪酸與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性

從圖4可以看出，乙酸濃度與Cr、BUN及Cys-C水平之間無相關(guān)性(P>0.05，圖4a)；丙酸濃度與Cys-C、Cr和BUN水平之間亦呈較弱的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.312、-0.326和-0.231，P<0.05，圖4b)；丁酸濃度與Cys-C、Cr和BUN水平之間呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.451、-0.583和-0.514，P<0.01，圖4c)。

2.6 試驗(yàn)犬腎功能的變化

從圖5a、b可知，各組Cr、BUN水平在造模前(0周)無顯著性變化，而各試驗(yàn)組造模后(4周)Cr、BUN水平顯著高于Con組及生理閾值(P<0.05)，表明造模成功。與5/6 Nx組比較，在12周時，5/6 Nx+Microbiota組血清Cr顯著升高，5/6 Nx+0.5% Butyrate組和5/6 Nx+Microbiota+0.5% Butyrate組Cr顯著降低(P<0.05，圖5a)。與5/6 Nx組比較，在12周時，5/6 Nx+Microbiota組BUN顯著升高，5/6 Nx+0.5% Butyrate組BUN顯著降低(P<0.05，圖5b)。5/6 Nx+0.5% Butyrate組血清丁酸在第12周分別高于5/6 Nx組，5/6 Nx+Microbiota組(P<0.05，圖5c)。

3 討 論

SCFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸等，主要由腸道中細(xì)菌發(fā)酵不易消化的碳水化合物產(chǎn)生，主要有普拉桿菌屬、梭菌屬、糞球菌屬、多爾氏菌屬、瘤胃球菌屬及羅斯氏菌屬等，這些菌群的改變影響SCFAs產(chǎn)生[12]。本研究發(fā)現(xiàn)患犬SCFAs低于健康犬，且腸道菌群多樣性隨著CRF發(fā)展呈降低趨勢，雖然擬桿菌門和厚壁菌門是本研究中兩個豐度最高的門，但擬桿菌門中主要菌屬豐度卻發(fā)生了變化，表現(xiàn)為普氏桿菌屬富集于HC組，擬桿菌屬富集于S-CRF組。與相關(guān)研究結(jié)論一致[13]。對腎功能指標(biāo)與腸道菌群進(jìn)行CCA分析發(fā)現(xiàn)，腎功能指標(biāo)與擬桿菌屬、假單胞桿菌屬及副擬桿菌屬等細(xì)菌豐度呈正相關(guān)，與普氏桿菌屬、普拉桿菌屬及梭菌屬等細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。這可能是腸道菌群對CRF引起的腸道內(nèi)環(huán)境變化的適應(yīng)能力不同造成的，大量BUN、Cr進(jìn)入腸道為那些含有脲酶的細(xì)菌(如假單胞桿菌屬等)提供豐富的氮源，有利于其生長繁殖[14]。慢性腎衰患犬腸道中那些相對豐度降低的菌群大部分具有產(chǎn)SCFAs能力，LEfSe分析發(fā)現(xiàn)慢性腎衰患犬產(chǎn)SCFAs菌群及普氏桿菌科和普氏桿菌屬細(xì)菌富集較少，而普氏桿菌科相關(guān)成員含有形成丁酸的兩個關(guān)鍵酶，磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶和丁酸激酶，可促進(jìn)丁酸合成[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，5/6 Nx犬移植CRF犬糞菌液后血清丁酸水平降低。提示CRF患犬的SCFAs特別是丁酸濃度降低可能與慢性腎衰引起的腸道菌群改變有密切關(guān)系。

a.乙酸濃度；b.丙酸濃度;c.丁酸濃度；d.產(chǎn)乙酸菌相對豐度；e.產(chǎn)丙酸菌相對豐度；f.產(chǎn)丁酸菌相對豐度a. Acetic acid concentration; b. Propionic acid concentration; c. Butyric acid concentration; d. Relative abundance of acetogenic bacteria; e. Relative abundance of propionibacteria; f. Relative abundance of butyrate-producing bacteria圖3 糞中短鏈脂肪酸濃度變化Fig.3 Changes of short chain fatty acids concentration in feces

SCFAs除了可以直接為宿主提供能量外，還可進(jìn)入血液循環(huán)作為信號分子，參與宿主不同的生物過程，對動物生理病理發(fā)揮重要作用[16]。SCFAs可以通過抑制NF-κB通路和MAPK通路而發(fā)揮抗炎癥和氧化應(yīng)激作用以延緩慢性腎病進(jìn)展[17]。SCFAs也可通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)促進(jìn)自噬相關(guān)基因-7(ATG-7)和線粒體DNA水平增加，激活自噬，抑制凋亡而實(shí)現(xiàn)腎保護(hù)作用[18]。相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)[19]，由于糞便中短鏈脂肪酸的種類及其豐度較為穩(wěn)定,且糞便作為測定短鏈脂肪酸的生物樣品較其他種類物樣品有采樣簡單、樣品易獲得、方便儲存的優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測短鏈脂肪酸最為常用的生物樣品。因而在本研究主要測定了糞便中的SCFAs含量，結(jié)果表明，重度CRF患犬的乙酸、丙酸及丁酸濃度均低于對照組，且與腎功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5/6 Nx犬給與丁酸鈉后可降低Cr及BUN水平，然而5/6 Nx犬移植CRF患犬糞菌液后,可使Cr及BUN水平進(jìn)一步升高，丁酸鹽則可回調(diào)這些變化。這說明SCFAs減少可能加劇CRF患犬腎功能障礙，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

a.乙酸與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析；b.丙酸與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析;c.丁酸與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析a. Correlation analysis of acetic acid and renal function indexes; b. Correlation analysis of propionic acid and renal function indexes; c. Correlation analysis of butyric acid and renal function indexes圖4 短鏈脂肪酸與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of short chain fatty acids and renal function indexes

a.不同階段各組血清肌酐濃度的比較;b.不同階段各組血清尿素氮濃度的比較。c.不同階段各組血清丁酸濃度的比較。*.P<0.05a. Comparison of serum creatinine in different stages of chronic renal failure; b. Comparison of serum BUN in different stages of chronic renal failure; c. Comparison of serum butyric acid in different stages of chronic renal failure. *. P<0.05圖5 糞菌移植及丁酸鈉對慢性腎衰模型犬腎功能的影響Fig.5 Effect of fecal bacteria transplantation and sodium butyrate on renal function in chronic renal failure model in dogs

綜上所述，慢性腎衰竭可降低患犬糞中短鏈脂肪酸濃度，可能與腸道菌群改變有關(guān)，且短鏈脂肪酸與腎功能關(guān)系密切。重建腸道菌群平衡，提高短鏈脂肪酸水平以期成為延緩犬慢性腎衰竭的新方法。

4 結(jié) 論

慢性腎衰竭患犬腸道菌群多樣性降低，菌群結(jié)構(gòu)及豐度改變，糞中短鏈脂肪酸濃度降低，這些變化可加劇腎功能障礙。