宋 軍，周志新，付琳清，王晗晟，劉 夢，孫東波，鄭家三

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

偽中間葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)是一種凝固酶陽性條件致病菌[1]，經(jīng)常引起犬的膿皮病。這種常見的條件致病菌還能夠引起犬、貓等動物的外耳道炎、傷口感染、尿道感染及其他一些感染[2]。耐甲氧西林偽中間葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcuspseudintermedius，MRSP)及耐其他抗菌藥物菌株的出現(xiàn)，已經(jīng)超出獸醫(yī)臨床抗生素用藥范圍[3]，引起了越來越多的關(guān)注。特別是近年來，在犬的主人和獸醫(yī)身上也發(fā)現(xiàn)了偽中間葡萄球菌的定植，并相繼出現(xiàn)偽中間葡萄球菌感染人的報道[4-5]。因此，偽中間葡萄球菌作為一種潛在的重要動物傳染性病原菌，將會對人類公共健康造成嚴(yán)重威脅。

遏制動物源細(xì)菌耐藥是人類控制細(xì)菌耐藥的重要組成部分。針對目前細(xì)菌耐藥性問題，包括抗菌肽、噬菌體、益生菌、中草藥等抗菌劑或抗生素替代產(chǎn)品的研發(fā)逐步開展，其中，中草藥來源廣泛、安全性好，是綠色、有效的抗生素替代品，具有廣泛的應(yīng)用前景。大黃酸是一種活性蒽醌衍生物單體，主要從蓼科藥用植物大黃中提取。大黃酸廣泛存在于大黃、何首烏、虎杖等中藥中，具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒和降血糖作用[6-11]。

前期國內(nèi)外學(xué)者研究表明，大黃酸具有潛在的抗菌活性[12-14]，與抗生素聯(lián)用有增效或部分增效作用[15]，并且能夠抑制生物被膜形成，但對其作用機制研究較淺[16]。為此，本文以偽中間葡萄球菌為研究對象，探討大黃酸的抗菌活性及抗菌機制，為犬膿皮病及偽中間葡萄球菌感染的防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及藥品來源

偽中間葡萄球菌分離株來源于2018—2020年大慶市農(nóng)大動物醫(yī)院膿皮癥患犬，偽中間葡萄球菌ATCC 49444購自上海北諾生物科技有限公司；大黃酸(純度>98%)購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 培養(yǎng)基與試劑盒

LB液體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、亞碲酸鈉卵黃增菌液購自海博(青島)生物有限公司；β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)；超聲波振蕩儀(寧波新芝生物科技有限公司)；低溫冷離心機(德國艾本德股份公司)；酶標(biāo)儀Elx800(美國BioTek公司)；Infinite 200 pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)；Hitachi S-4800 掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.4 細(xì)菌分離鑒定

1.4.1 細(xì)菌分離 無菌采集膿皮病患犬皮屑或膿汁共計38份，分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃增菌培養(yǎng)8 h后，接種于Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h挑取平皿上黑色有透明帶或帶暈的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃，160 r·min-1純培養(yǎng)12 h，進行革蘭染色鏡檢。利用細(xì)菌DNA基因提取試劑盒提取分離株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 參考Bannoehr等[17]偽中間葡萄球菌特異性引物16S rRNA、mecA(甲氧西林耐藥基因)和hsp60(熱休克蛋白)對分離菌株進行PCR擴增、鑒定。PCR擴增體系(總體積為25 μL)：RNase-free 2×Taq PCR Mix12.5 μL，上、下游引物(表1)各1 μL，基因組DNA模板1 μL，H2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序參考Bannoehr等[17]的方法。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送吉林庫美生物科技有限公司進行測序、比對。

表1 16S rRNA, mecA和hsp60基因擴增引物[17]

1.5 大黃酸對偽中間葡萄球菌抗菌活性

1.5.1 最小抑菌濃度和最低殺菌濃度 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定參考Song等[18]的方法略作修改。大黃酸以DMSO(二甲基亞砜)為溶劑，配制成5 mg·mL-1備用。用TSB培養(yǎng)基對大黃酸進行倍比稀釋，每孔100 μL加至96孔微量培養(yǎng)板中，同時每孔加入100 μL 濃度約為105CFU·mL-1對數(shù)生長期菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h，每組3個重復(fù)。TSB培養(yǎng)基不加藥為陰性對照組。以沒有肉眼可見的細(xì)菌生長的最低濃度為大黃酸的MIC。最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)是指將MIC以上各孔培養(yǎng)物，分別吸取100 μL 接種在Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)，其菌落數(shù)少于5個的大黃酸濃度即為MBC[19]。

1.5.2 大黃酸對偽中間葡萄球菌生長的影響 將偽中間葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按1%接種不同濃度大黃酸(1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC與2×MIC)至無菌TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)8 h，每間隔30 min取樣測600 nm處吸光度，繪制時間-抑菌曲線。以未添加大黃酸的菌液作為對照組，每組3次重復(fù)。

1.6 溶血活性

參考Song等[18]的方法，采集健康犬血液在4 ℃ 下1 000×g離心5 min，得到犬紅細(xì)胞(cRBCs)用阿氏液洗滌3次，用PBS (pH=7.4)稀釋10倍。然后，將50 μL cRBCs與等量不同濃度的大黃酸(1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC)加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃孵育60 min 后測定上清液在450 nm處的吸光度。未經(jīng)處理cRBCs的分別用0.1% Triton X-100和阿氏液處理，分別作為陽性和陰性對照。每組3個重復(fù)，測試兩次。溶血活性按下式計算：溶血率(%)= [(樣品OD570-陰性O(shè)D570)/(陽性O(shè)D570-陰性O(shè)D570)]×100。

1.7 黏附試驗

參照李燕杰等[19]方法并進行適當(dāng)修改，將對數(shù)生長期的ATCC 49444稀釋到1×106CFU·mL-1。取含有不同濃度(1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC與2×MIC) 大黃酸的細(xì)菌懸液1 000 μL加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔含有無菌載玻片)，37 ℃培養(yǎng)120 min。用PBS洗去未黏附的細(xì)菌細(xì)胞，將載玻片轉(zhuǎn)入裝有10 mL PBS溶液試管中，于20 kHz、25 ℃ 條件下超聲處理60 s，平板計數(shù)評估細(xì)菌細(xì)胞的黏附率[19]。

1.8 大黃酸對偽中間葡萄球菌作用機制研究

1.8.1 細(xì)胞膜通透性測定 內(nèi)膜通透性通過測定細(xì)菌在ONPG(鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)為底物的培養(yǎng)基中，細(xì)胞質(zhì)β-半乳糖苷酶活性的釋放。將ATCC 49444培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并接種至含不同終濃度(1×MIC和2×MIC)的大黃酸液體培養(yǎng)基中，使含菌濃度為108CFU·mL-1，同時用PBS代替大黃酸藥液作為對照組，37 ℃ 160 r·min-1搖床培養(yǎng)。每60 min各取1.0 mL，用0.22 μm無菌濾器過濾，取濾液，參照試劑盒說明書測定β-半乳糖苷酶活性。

1.8.2 活性氧測定 使用活性氧(ROS)檢測試劑盒測定偽中間葡萄球菌內(nèi)ROS的水平。將對數(shù)生長期的ATCC 49444稀釋到OD600nm= 0.4和10 μmol·L-1DCFH-DA孵育20 min，PBS(pH 7.4)清洗和重懸菌體。100 μL細(xì)菌懸液與等體積不同濃度的大黃酸(1×MIC和2×MIC)混合后加入96孔熒光酶標(biāo)板中，37 ℃條件下，每隔10 min，利用Infinite 200 pro多功能酶標(biāo)儀(帝肯，中國)進行測定，其中激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。 每個樣品3個重復(fù)，測試兩次。

1.8.3 掃描電子顯微鏡觀察大黃酸對偽中間葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響 參照Wang等[20]方法處理掃描電鏡樣品，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期濃度為108CFU·mL-1菌懸液與大黃酸(終濃度1×MIC)混合，37 ℃作用6 h后，4 000 r·min-1離心10 min，用PBS清洗3遍，菌體用2.5% (w/v)戊二醛4 ℃條件下固定過夜。隨后，用乙醇(30%、50%、70%、85%、90%和100%)進行梯度脫水，用叔丁醇代替乙醇脫水2次，干燥樣品，噴金制樣，采用日立S-4800掃描電子顯微鏡觀察。

1.8.4 透射電子顯微鏡觀察大黃酸對偽中間葡萄球菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 前期菌體固定與掃描電鏡樣品制備方法一致，戊二醛固定后的菌體用1%鋨酸溶液固定1 h，用PBS清洗菌體3遍，丙酮梯度脫水。環(huán)氧樹脂包埋過夜，50 ℃烘干48 h。1%乙酸雙氧鈾染色，切片制樣后采用JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡觀察。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計學(xué)軟件分析，組間的差異比較采用t檢驗，差異性檢驗水準(zhǔn)設(shè)為P<0.05(*)差異顯著，P<0.01(**)差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 革蘭染色和生物學(xué)特性檢測

分離菌株在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，菌落呈黑色、濕潤、隆起、光亮、表面光滑，外層有明顯渾濁帶(圖1A)；革蘭染色鏡檢為陽性球菌(圖1B)，菌呈球形，大小均勻，葡萄串狀，革蘭染色呈藍(lán)紫色。

A. Baird-Parker瓊脂生長特征； B.革蘭染色結(jié)果(100×)A. Growth characteristics of Baird Parker Agar; B. Results of Gram staining(100×)圖1 分離菌株生物特征的檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of biological characteristics of isolated bacteria

2.2 分子生物學(xué)鑒定

分離菌株16S rRNA，mecA和hsp60基因均擴增出特異性條帶，與圖2所示基因片段大小相一致。利用Blast程序?qū)y序結(jié)果進行分析比對，共分離到20株偽中間葡萄球菌，分離率為52.63%(各菌株同源性均達(dá)98%以上)。

2.3 大黃酸對偽中間葡萄球菌的抗菌活性

通過測定大黃酸對偽中間葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株(20株)的抗菌活性，表明大黃酸對偽中間葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)為12.5 μg·mL-1，最小殺菌濃度(MBC)為25 μg·mL-1或50 μg·mL-1。

2.4 抑菌動力學(xué)曲線

向?qū)?shù)生長期菌液中加入不同濃度大黃酸后，偽中間葡萄球菌呈不同程度的抑制(圖3)。加入大黃酸的終濃度為2×MIC時，8 h內(nèi)偽中間葡萄球菌被完全抑制，菌液澄清；當(dāng)大黃酸在亞抑菌濃度(1/2×MIC)時，細(xì)菌生長緩慢，3 h內(nèi)能夠抑制細(xì)菌生長，但隨著作用時間延長，細(xì)菌逐漸增長。上述結(jié)果說明，大黃酸能明顯抑制偽中間葡萄球菌的生長。

A. 16S rRNA擴增結(jié)果； B. mecA擴增結(jié)果； C. hsp60擴增結(jié)果。 M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100～2 000 bp)；1.陰性對照；2.目的條帶A. Results of 16S rRNA amplification; B. Results of mecA amplification; C. Results of hsp60 amplification. M. DNA molecular weight standard (100-2 000 bp); 1. Negative control; 2. Target band圖2 標(biāo)準(zhǔn)株16S rRNA, mecA和hsp60基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA, mecA and hsp60 of standard strain

圖3 不同濃度大黃酸對偽中間葡萄球菌的抑菌活性曲線Fig.3 Antibacterial activity curve of different concentrations rhein against Staphylococcus pseudintermedius

2.5 溶血活性

為了進一步了解大黃酸對哺乳動物細(xì)胞膜的毒性，檢測了不同濃度大黃酸對犬血紅細(xì)胞的溶血活性。當(dāng)大黃酸濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC時，溶血活性分別為1.21%、1.86%、3.14%和5.14%。

2.6 黏附試驗

為觀察大黃酸對偽中間葡萄球菌早期生物膜形成的影響，評價生物膜形成的初始階段——黏附。結(jié)果如圖4，1/4×MIC的大黃酸能夠抑制偽中間葡萄球菌的黏附，和對照組相比，抑制率為18.91%。隨著大黃酸濃度的增加，大黃酸濃度為2× MIC時，抑制率為87.13%。說明大黃酸對黏附的抑制作用具有劑量依賴性。

圖4 大黃酸處理可減少偽中間葡萄球菌的黏附Fig.4 Rhein treatment reduces adhesion of Staphylococcus pseudintermedius

2.7 細(xì)胞膜通透性測定

在細(xì)胞遭受損傷通透性改變的情況下，β-半乳糖苷酶會泄漏至胞外，通過檢測胞外β-半乳糖苷酶活力的變化，也可反映細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷情況[21]。在培養(yǎng)期間，對照組胞外β-半乳糖苷酶活性變化不顯著，大黃酸(1×MIC和2×MIC)處理組胞外β-半乳糖苷酶活性隨著時間延長而增加(圖5)。

2.8 大黃酸對偽中間葡萄球菌ROS的影響

如圖6所示，大黃酸對偽中間葡萄球菌產(chǎn)生的ROS具有濃度依賴性作用。在濃度為1×MIC時產(chǎn)生的ROS是空白對照組的3.9倍。在濃度為2×MIC時，熒光強度比空白對照組增加了6.4倍。總之，和對照組(大黃酸未處理組)相比，大黃酸處理后使偽中間葡萄球菌細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS。

圖5 大黃酸作用前后偽中間葡萄球菌懸液中β-半乳糖苷酶活力變化Fig.5 Effect of rhein on β-galactosidase activity of Staphylococcus pseudintermedius

圖6 大黃酸對偽中間葡萄球菌ROS的影響Fig.6 Effect of rhein on ROS of Staphylococcus pseudintermedius

2.9 大黃酸對偽中間葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡直接的觀察偽中間葡萄球菌的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化[18,21]。SEM觀察結(jié)果顯示，未加大黃酸空白對照組(圖7A)偽中間葡萄球菌形態(tài)飽滿圓潤、表面光滑。大黃酸(1×MIC)處理組(圖7B)大部分細(xì)胞呈黏連狀態(tài)，細(xì)胞表面存在大量分泌物、細(xì)胞皺縮。TEM觀察結(jié)果(圖7C)顯示，未經(jīng)大黃酸處理的偽中間葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整，內(nèi)容物致密，分布均勻。大黃酸(1×MIC)處理的細(xì)胞，電子密度降低、細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物泄漏(圖7D)。說明大黃酸對偽中間葡萄球菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外部形態(tài)均造成了破壞性影響。

3 討 論

寵物源耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)被認(rèn)為是潛在的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著寵物主人和獸醫(yī)的健康[22]。偽中間葡萄球菌就是其中之一。偽中間葡萄球菌是一種凝固酶陽性條件致病菌，具有多重耐藥性，是引起犬膿皮病最主要的致病菌[23]。因此，迫切需要天然、安全、效果好的抗生素替代物，控制寵物源耐藥細(xì)菌的感染。

本研究從38份臨床樣本中分離得到20株耐甲氧西林偽中間葡萄球菌，說明偽中間葡萄球菌是犬膿皮癥最主要的致病菌之一。測得大黃酸對耐甲氧西林偽中間葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)為12.5 μg·mL-1。不同抗菌藥物、抗菌肽、天然產(chǎn)物等抑制細(xì)菌生長的機制較為復(fù)雜，包括針對細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的合成，核酸和蛋白質(zhì)的合成和抑制，干擾細(xì)菌代謝等[24]。本研究中，亞抑菌濃度的大黃酸能夠在3 h內(nèi)抑制偽中間葡萄球菌的生長，之后隨培養(yǎng)時間的延長緩慢增長(圖3)。說明大黃酸可能弱化了細(xì)胞壁對維持細(xì)胞形態(tài)的作用[25]，導(dǎo)致細(xì)菌被抑制。為評估藥物的安全性，本研究測定了大黃酸對犬紅細(xì)胞的毒性，當(dāng)大黃酸濃度高達(dá)8×MIC 時，對犬紅細(xì)胞幾乎沒有溶血活性，說明大黃酸具有治療犬膿皮病的潛力。黏附是細(xì)菌定植入侵及形成生物被膜的關(guān)鍵步驟[26]。本研究通過測定不同濃度的大黃酸對偽中間葡萄球菌黏附的影響，評價其抗生物膜作用，結(jié)果表明，在體外亞抑菌濃度下，大黃酸可以阻止偽中間葡萄球菌的黏附，減少細(xì)菌定植和影響生物被膜的形成。

A、C 空白對照組；B、D. 1×MIC大黃酸處理組A,C Blank control group; B,D. 1×MIC rhein treated group圖7 電鏡觀察大黃酸對偽中間葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 The effect of rhein on the cell morphology and ultrastructure of Staphylococus pseudintermedius by electron microscope

細(xì)菌的保護屏障細(xì)胞膜，在防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[27]。同時，細(xì)胞膜也是許多藥物、抗菌肽等作用的靶點之一[28]。前期，關(guān)于大黃酸抗菌機制的研究較少，國內(nèi)學(xué)者證明了大黃酸通過損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而抑制細(xì)菌的生長和繁殖[16]。本研究通過測定大黃酸作用后偽中間葡萄球菌細(xì)胞膜通透性和完整性，評價大黃酸的抑菌作用機制。結(jié)果顯示，大黃酸處理后，胞外β-半乳糖苷酶活性隨著時間延長而增加，表明大黃酸能改變偽中間葡萄球菌細(xì)胞膜通透性，而且能破壞細(xì)胞膜，使存在于細(xì)胞漿內(nèi)的核酸和酶等生物大分子外流，細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)丟失，從而發(fā)揮抑菌抗菌作用，與覃靜等[16]報道的大黃酸對金黃色葡萄球菌的作用結(jié)果相似。此外，有研究表明，抗菌藥物能夠通過刺激細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生高水ROS，發(fā)揮抗菌作用[29-30]。因此，本研究探討了不同濃度的大黃酸對偽中間葡萄球菌的ROS水平。當(dāng)大黃酸終濃度為1×MIC和2×MIC時，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于對照組。過量ROS的產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)菌氧化損傷，影響細(xì)菌活性，甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡[31]。最后，本研究結(jié)合掃描電鏡和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大黃酸處理后，細(xì)菌細(xì)胞表面存在大量分泌物呈黏連狀態(tài)，細(xì)胞表面褶皺、內(nèi)部電子密度降低、細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物外流，說明大黃酸對偽中間葡萄球菌的外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)均造成破壞性影響，與上述結(jié)果相吻合。

綜上所述，大黃酸通過多種途徑對偽中間葡萄球菌發(fā)揮抑菌和殺菌作用，為犬膿皮病及偽中間葡萄球菌感染的防治提供基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

大黃酸通過弱化偽中間葡萄球菌細(xì)胞壁對細(xì)胞形態(tài)的維持，破壞細(xì)胞膜的通透性、完整性，并誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，從而發(fā)揮抑菌和殺菌作用。這為研究中藥單體作為抗菌藥物治療犬膿皮病提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。