田洪民 王淑屏 王鴻雁 盧憲梅（濟南市第三人民醫(yī)院小兒科，濟南250132）

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一種多因素引起的嚴重威脅新生兒健康的消化系統(tǒng)疾病，能引起嚴重的腸道炎癥，其相關死亡率一直較高（20%～30%）［1］。NLRP3炎性小體（NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3）作為一種蛋白復合物，由上游NLRP3、凋亡相關斑點 樣 蛋 白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）以及下游半胱天冬酶-1（Caspase-1）組成。適度激活NLRP3能引起機體固有免疫反應，但過度激活將引發(fā)一系列炎癥性疾?。?］。研究表明，NLRP3參與NEC發(fā)展過程中的炎癥反應，因此有效抑制NLRP3炎性小體的活化或許可以為治療NEC新藥的研發(fā)提供思路［3］。柚皮素（naringenin，NAR）是一種具有抗炎抗氧化以及抗菌作用的黃酮類化合物，廣泛存在于柚、葡萄柚和酸橙中，具有預防心血管疾病、癌癥等多種疾病的生理活性［4］。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能通過抑制NLRP3炎性小體激活保護重癥急性胰腺炎相關的心肌損傷，但柚皮素是否能通過抑制NLRP3炎性小體介導的炎癥反應改善NEC腸道炎癥損傷目前尚不明確［5］。因此，本研究擬探討柚皮素對NEC腸道炎癥損傷的作用及其對腸道組織NLRP3炎性小體活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 柚皮素標準品（純度＞98%）和脂多糖均購自美國Sigma公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）購自上海碧云天生物技術公司；TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；逆轉錄試劑盒購自美國Promega生物公司；抗體兔抗NLRP3、ASC、Caspase-1和GAPDH均購自英國Abcam公司；?，擜R-8100氧氣濃度檢測儀購自深圳富蘭克電子有限公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；酶標儀購自美國Bio-Tek公司；切片機購自德國萊卡公司；聚合酶鏈式反應熱循環(huán)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 實驗動物 無特定病原體（SPF）級C57BL/6雄鼠和雌鼠均購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（粵）2018-002。飼養(yǎng)溫度20～26℃，濕度40%～70%，光照周期12 h/12 h，自由進食和飲水。每周更換一次飼育籠，交配比例雌雄2∶1。

1.2 方法

1.2.1 NEC模型建立及分組 雌鼠自然受孕分娩后，將68只出生3 d的新生小鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常對照組（Control），模型組（NEC），柚皮素低劑量組（L-NAR）和柚皮素高劑量組（H-NAR），每組17只。所有小鼠均母鼠母乳喂養(yǎng)，正常對照組小鼠僅給予等量生理鹽水腹腔注射，其他組均采用缺氧冷刺激+LPS腹腔注射法［6］建立NEC模型。柚皮素低、高劑量組小鼠分別予以腹腔注射5 mg/kg、20 mg/kg NAR，1次/d，持續(xù)3 d。第5天脫頸致死，取NEC癥狀最常發(fā)生的回腸遠端和結腸近端的回盲部腸組織進行后續(xù)檢測。

1.2.2 小鼠大體觀察、臨床癥狀積分以及體重變化 記錄新生小鼠的實驗前后的體重，并每天觀察各組小鼠一般情況并進行統(tǒng)計，一般情況包括：進食、精神活動狀態(tài)、大便性狀、有無腹瀉、刺激反應等。臨床癥狀積分從3方面進行評價：①精神活動狀態(tài)：不間斷活動為正常（0分），明顯活動減少（1分），在一定刺激下被動活動（2分），對被動活動不敏感（3分）。②大便性狀：球形黑便為正常（0分），水分增加成軟便（1分），不成形稀糊狀便（2分），水樣便（3分）。③便血情況：糞便潛血檢測陰性（0分），糞便潛血檢測陽性（1分），糞便上明顯附著血跡且肛門無血跡（2分），血便且肛門口現(xiàn)大量血跡（3分）。

1.2.3 HE染色觀察回盲部腸組織病理學變化并評分 取小鼠回盲部腸組織，固定于4%多聚甲醛中24 h，采用濃度梯度乙醇脫水，透明后石蠟包埋，切片機切片，厚度5μm，經(jīng)蘇木精、伊紅染色后，脫水封片，在顯微鏡下觀察各組小鼠腸組織病理學變化。參照改良的Nadler標準［7］行雙盲法評分，病理評分≥3分視為NEC。

1.2.4 ELISA檢測小鼠回盲部腸組織中IL-6、TNFα、IL-1β和IL-18含量 制備各組小鼠回盲部腸組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測量450 nm處光密度（OD）值，根據(jù)標準曲線計算腸組織勻漿中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的含量。

1.2.5 qRT-PCR檢測 用TRIzol試劑從各組小鼠回盲部腸組織中提取總RNA。利用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，再根據(jù)熒光定量PCR試劑盒，配制上樣混合物，以cDNA為模板，利用熒光定量PCR儀檢測分析NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA表達量。PCR反應條件：95℃10 min，接著95℃15 s，58℃40 s，72℃40 s，循環(huán)40次。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算基因的mRNA表達水平。引物序列：NLRP3上游5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游5′-GCTTCAGTCCCACACACAGA-3′；ASC上游5′-GTGTTTACTCTCTGGGATGTTTTTG-3′，下游5′-GTCTGTGGAATTTAGGTGTTGGA-3′；Caspase-1上游5′-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3′，下游5′-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3′；β-actin上游5′-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3′，下游5′-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3′。

1.2.6 Western blot檢測 將RIPA緩沖液加入剪碎的小鼠回盲部腸組織中，在勻漿器中研磨20 min后，12 000 r/min離心20 min，取上清液即為組織裂解液。再用BCA法測定蛋白質濃度。取適量蛋白煮沸5 min后上樣，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白后將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，TBST洗滌3次，加入一抗NLRP3（1∶200）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶500）和β-actin（1∶1 000），然后將含一抗的膜置于4℃中孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h。利用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒對PVDF膜進行顯影曝光后，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)均用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，多組中的兩兩比較采用LSD-t檢驗分析。P＜0.05表示組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠大體觀察、臨床癥狀積分以及造模前后體重比較 如表1所示，實驗前，4組小鼠一般情況和體重差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗后，Control組小鼠進食以及排便正常，精神狀態(tài)良好，體重（2.52±0.15）g，且全部存活，臨床癥狀積分（0.36±0.11）分；NEC組小鼠在NEC造模24 h后逐漸出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳，活動度降低，反應遲鈍，腹脹腹瀉，血便等情況，且逐漸加重，造模64 h后出現(xiàn)5只小鼠死亡，而NEC組小鼠實驗后體重（1.88±0.12）g，臨床癥狀積分為（7.71±1.18）分，較Control組體重明顯降低（P＜0.05），臨床癥狀積分明顯升高（P＜0.05）。L-NAR組小鼠在NEC造模30 h后逐漸開始出現(xiàn)NEC情況，沒有明顯改善，造模65 h后出現(xiàn)4只小鼠死亡，且實驗后體重為（1.96±0.11）g，臨床癥狀積分為（6.94±1.32）分，較NEC組體重和臨床癥狀積分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而H-NAR組小鼠在NEC造模45 h后也逐漸出現(xiàn)活動度降低，腹瀉腹脹，排黃綠色黏便，但程度較NEC組輕，實驗后體重為（2.28±0.18）g，臨床癥狀積分為（4.53±1.07）分，較NEC組的明顯升高（P＜0.05），臨床癥狀積分明顯降低（P＜0.05），且僅在造模70 h后出現(xiàn)1只死亡。

表1 比較各組小鼠造模前后體重（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass of mice in each group before and after modeling（±s，g）

表1 比較各組小鼠造模前后體重（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass of mice in each group before and after modeling（±s，g）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with NEC group，2）P＜0.05；compared with beforemodeling，3）P＜0.05.

Groups Control NEC L-NAR H-NAR n 17 17 17 17 Before modeling 1.79±0.10 1.81±0.12 1.78±0.10 1.80±0.11 After modeling 2.52±0.153）1.88±0.121）1.96±0.113）2.28±0.182）3）

2.2 NAR對小鼠腸組織病理變化以及評分的影響 如圖1所示，Control組可見完整清晰的回盲部腸組織結構，腸絨毛高聳，腸上皮排列整齊，黏膜層、黏膜下層及固有層均未斷裂或腫脹分離；NEC組和H-NAR組可見腸組織結構紊亂，絨毛結構雜亂、脫落甚至消失、肌層變薄甚至斷裂；H-NAR組腸組織結構較清晰，絨毛存在部分脫落或斷裂，整體較NEC組改善明顯；如圖2所示，與Control組比較，NEC組病理評分顯著升高（P＜0.05）；與NEC組比較，H-NAR組病理評分明顯降低（P＜0.05），而LNAR組病理評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 HE染色觀察小鼠回盲部結腸組織病理變化（×400）Fig.1 HE staining was used to observe pathological changes of ileocecal colon in mice（×400）

圖2 比較小鼠回盲部結腸組織病理評分Fig.2 Comparison of histopathological scores of ileocecal colon in mice

2.3 NAR對小鼠腸組織勻漿中炎癥因子水平的影響 如表2所示，與Control組比較，NEC組小鼠腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表達水平明顯升高（P＜0.05）；與NEC組比較，H-NAR組小鼠腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表達水平顯著降低（P＜0.05），而L-NAR組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠腸組織中炎癥細胞因子的表達水平（±s，pg/ml）Tab.2 Expressions of inflammatory cytokines in intestinal tissues of mice in each group（±s，pg/ml）

表2 各組小鼠腸組織中炎癥細胞因子的表達水平（±s，pg/ml）Tab.2 Expressions of inflammatory cytokines in intestinal tissues of mice in each group（±s，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with NECgroup，2）P＜0.05.

Groups Control NEC L-NAR H-NAR n 17 17 17 17 TNF-α 17.62±5.79 66.38±15.111）57.45±13.85 31.42±11.362）IL-6 46.53±17.55 167.31±32.301）144.25±31.40 81.54±22.352）IL-1β 97.55±25.86 352.61±59.701）304.22±67.52 188.52±34.662）IL-18 57.56±25.49 256.77±42.451）222.85±50.56 122.24±38.812）

2.4 NAR對小鼠腸組織NLRP3炎性小體表達的影響 如圖3所示，與Control組比較，NEC組小鼠腸組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白相對表達量均顯著上調（P＜0.05）；與NEC組比較，HNAR組小鼠腸組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.05），而L-NAR組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠腸組織NLRP3炎性小體表達檢測Fig.3 Expression of NLRP3 in intestinal tissue of mice in each group

3 討論

多年來，NEC的發(fā)病機制被認為是由早產(chǎn)、腸內喂養(yǎng)、腸缺血和細菌效應等幾個關鍵危險因素引起的。此外，在20世紀60年代和70年代有人提出，這些危險因素能刺激腸道或NEC并發(fā)其他部位的炎癥反應［8］。研究報道稱，細菌產(chǎn)物如內毒素（也稱脂多糖）與NEC有關，這些細胞膜配體引發(fā)炎癥反應，導致腸壞死［9］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，新生NEC小鼠的回盲部腸組織出現(xiàn)嚴重的炎癥反應損傷，并且腸組織炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表達水平明顯升高，其中促炎細胞因子IL-1β和IL-18的含量升高可能是由于NLRP3炎性小體活化并介導Caspase-1表達所致［10］。有研究表明，NLRP3炎性小體能激活Caspase-1，介導炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，可進一步募集和激活其他免疫細胞，增強局部和全身炎癥反應［11］。而NLRP3炎性小體的過度活化引起的炎性損傷廣泛參與2型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［12-14］。本研究結果表明，在新生NEC小鼠的腸組織中NLRP3炎性小體活化也異常增高，提示抑制NLRP3炎性小體活化或許能改善NEC小鼠腸道損傷。

眾所周知，自然界中廣泛存在的天然藥物已成為研發(fā)新型藥物的重要來源。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些天然藥物能夠通過抑制NLRP3炎性小體活化而發(fā)揮作用，比如梔子苷通過抑制壞死病介導的NLRP3炎性小體信號傳導，改善了d-半乳糖胺和LPS誘導的肝細胞損傷［15］；竹節(jié)參皂苷Ⅳa通過阻斷NLRP3/Caspase-1通路對七氟醚誘導的神經(jīng)炎癥具有神經(jīng)保護作用［16］；丹參酚酸A能抑制主動脈組織NLRP3炎性小體活性，減輕2型糖尿病并發(fā)動脈粥樣硬化大鼠體內慢性炎癥引起的損傷［17］。柚皮素，又稱4′，5，7-三羥黃酮，是一種柑橘黃烷酮，是現(xiàn)代社會消耗量最大的類黃酮之一，具有良好的生物利用和醫(yī)療應用。已有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能夠通過抑制NLRP3炎性小體活化改善重癥急性胰腺炎誘導的心肌損傷［5］。本研究結果顯示，柚皮素能夠下調NEC小鼠腸組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白表達水平，表明柚皮素也能夠抑制NEC小鼠腸組織中NLRP3炎性小體活化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素還能夠降低NEC小鼠腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18等炎癥因子表達水平，并且對NEC新生小鼠腸組織損傷具有保護作用，表明柚皮素可能通過抑制NLRP3炎性小體表達，降低腸組織炎癥水平，緩解NEC新生小鼠腸組織炎癥損傷。

綜上所述，柚皮素通過抑制NLRP3炎性小體表達，降低新生NEC小鼠腸組織炎癥因子的表達，發(fā)揮NEC腸道保護作用，為NEC的預防和治療提供了新思路。但本研究僅從動物水平探討柚皮素對NEC的影響，并且無藥物陽性組，無法評估柚皮素對NEC的影響程度。后期將進一步完善研究的局限性，并深入探討柚皮素調控NLRP3炎性小體表達的可能分子機制。