黃 濱 王麗萍 林振孟

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院麻醉科，福建福州 350025；2.福建省腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科，福建福州 350014

脊椎蛋白2（spondin2，SPON2）是分泌型細胞外基質(zhì)蛋白，屬于Mindin/F-pondin 家族的成員[1]。SPON2參與多種重要的細胞活動功能，比如促進神經(jīng)元生長和發(fā)育[2-3]。先前研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝癌、腎癌中SPON2 表達上升，并作為預后不良的重要指標[4-6]。本研究探討SPON2 與胃癌間的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞系、標本

胃癌細胞株BGC-823、MGC-803、SGC-7901 和正常胃黏膜細胞GES-1 購自上海中科院細胞庫。選取2013 年1 月至2015 年9 月聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科存檔的120 例胃癌及相應癌旁組織蠟塊。納入標準：①腺癌；②根治性手術(shù)；③臨床病理資料完整。排除標準：①術(shù)前新輔助化療；②急診手術(shù)。收集2019 年5 月至2020 年9月我院70 例胃癌患者、60 例慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）患者，60 例健康體檢者血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測SPON2 的表達水平，電化學發(fā)光法檢測癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）及糖類抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，Ca19-9）。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人SPON2 抗體購自廣州碧云天公司（批號：ab224645）。ELISA 儀器購自西門子（型號：ADVIA CENTAUR）。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)DMEM 進行細胞培養(yǎng)，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱進行傳代。

1.3.2 Western blot 檢測 培養(yǎng)細胞48 h，提取蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗（稀釋比例1:1000）過夜，加入二抗，顯影。

1.3.3 免疫組化 石蠟組織標本切片，修復抗原，封閉蛋白，加入一抗（稀釋比例1:1000）孵育過夜，加二抗，顯色，復染，封片。SPON2 主要定位于細胞漿。根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞比例進行分析。染色強度評分：不著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞百分比：陽性細胞百分比＜10%為0 分，10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。兩者相乘，0～3 分為陰性表達，≥4 分為陽性表達[7]。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗 抽取空腹靜脈血5 ml，離心，酶標儀（450 nm 波長）檢測吸光度值并繪制標準曲線，通過標準曲線計算SPON2 濃度。

1.3.5 電化學發(fā)光法 抽取空腹靜脈血5 ml，按照CEA、Ca19-9 試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 法。COX 回歸模型行單因素分析和多因素分析；多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗。受試者工作特征曲線（ROC）計算曲線下面積（area under curve，AUC）評價診斷價值，MedCalc 軟件比較AUC 的差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞及正常胃黏膜細胞中SPON2 的表達量比較

胃癌細胞株SPON2 的表達量均高于正常胃黏膜細胞GES-1（P ＜0.05），見圖1、表1。

圖1 胃癌細胞及正常胃黏膜細胞中SPON2 蛋白表達

表1 胃癌及正常胃黏膜細胞中SPON2 蛋白的表達量比較（，n=3）

表1 胃癌及正常胃黏膜細胞中SPON2 蛋白的表達量比較（，n=3）

注：與正常胃黏膜細胞比較，aP ＜0.05。SPON2：脊椎蛋白2

2.2 SPON2 在胃癌及癌旁組織中的表達情況比較

SPON2 在胃癌組織中陽性率為48.3%（58/120），高于癌旁正常組織的17.5%（21/120）（χ2=25.832，P ＜0.01），見圖2。胃癌組織中不同病理分期、不同浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否的SPON2 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表2。SPON2 陽性的5 年生存率為40.3%，低于陰性患者的60.9%（P ＜0.05），見圖3。單因素分析顯示SPON2 與患者預后有關（P ＜0.05）。多因素分析顯示，SPON2 是胃癌預后的影響因素（P ＜0.05），見表3。

圖3 脊髓蛋白2表達陽性和陰性的生存曲線

表2 胃癌組織中SPON2 的表達與臨床病理特征關系

表3 臨床病例特征與預后的關系

圖2 SPON2 在胃癌及癌旁正常組織表達（SP，400×）

2.3 胃癌、CAG 和健康體檢者血清中SPON2、CEA、CA19-9 的表達比較

胃癌、CAG 和健康體檢者年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病和體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見表4。胃癌患者血清SPON2、CEA、CA19-9 濃度均高于CAG、健康體檢者（P ＜0.05），見表5。

表4 胃癌、CAG 和健康體檢者一般資料比較

表5 胃癌、CAG 和健康體檢者血清中SPON2、CEA、Ca19-9 的表達量比較

2.4 SPON2、CEA、CA19-9 及三者聯(lián)合檢測對胃癌的診斷價值

血清SPON2、CEA、Ca19-9 三者聯(lián)合檢測AUC與單獨檢測比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.012、3.121、3.119，均P ＜0.05），見表6、圖4。

圖4 SPON2、CEA、Ca19-9 及三者聯(lián)合檢測診斷胃癌的ROC 曲線

表6 血清各指標對胃癌的診斷價值

3 討論

胃癌是世界第五大常見惡性腫瘤，60%～70%患者發(fā)現(xiàn)時處于中晚期[8-11]。檢測血液的腫瘤標志物具有簡便、經(jīng)濟的特點，是早期診斷和評估癌癥復發(fā)風險的理想方法[12-14]。CEA、Ca19-9 是廣泛用于胃癌早期診斷、評價預后和術(shù)后復查的生物標志物。然而，對胃癌早期診斷的敏感性及特異度均較差[15-16]。因此，尋找新的生物標志物提高胃癌的診斷具有至關重要的作用。

SPON2 是由331 個氨基酸殘基（36 kD）組成的保守分泌型細胞外基質(zhì)蛋白，在多種腫瘤中高表達[17-19]。血清SPON2 水平升高可作為前列腺癌和肺癌的標志物[20-21]。SPON2 在喉癌組織中表達明顯高于癌旁組織，通過PI3K/AKT 信號通路促進喉癌細胞增殖和侵襲[22]。SPON2 與結(jié)直腸癌患者的病理分期、浸潤深度、Dukes 分期顯著相關，表達陽性預示患者預后不良[23-24]。胃癌細胞中SPON2 基因的表達下調(diào)可顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲[25-26]。

本研究中，胃癌細胞株中SPON2 含量均高于正常胃黏膜細胞，在胃癌石蠟標本中SPON2 陽性率高于癌旁正常組織，胃癌血清中SPON2 含量高于CAG 及健康體檢者，提示SPON2 在胃癌的發(fā)生中起重要作用，可作為靶向治療的潛在靶點。胃癌組織中，SPON2 陽性患者5 年生存率低于陰性患者，因此，對于SPON2陽性患者術(shù)后需要采取更積極的輔助治療及復查。本研究中SPON2 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、病理分期有關，提示SPON2 與胃癌的進展有關。ROC 曲線分析顯示術(shù)前血清SPON2 對胃癌的預測效果良好，與CEA、Ca19-9 相結(jié)合，更有利于胃癌的早期診斷。

總之，本研究提示胃癌細胞、組織、血清中SPON2蛋白的表達上調(diào)，SPON2 參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展，可能是胃癌診斷、判斷預后的新指標，可作為胃癌治療新的靶點。