戴明明 廖 丹 程偉玲 王春鵬 林才志

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530000；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝病科，廣西南寧 530000

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種主要以結(jié)腸或直腸黏膜連續(xù)性、彌漫性的炎癥改變?yōu)樘卣鞯穆苑翘禺愋阅c道炎癥性疾病[1]，主要的臨床癥狀為腹瀉、大便伴有黏液或膿血、腹痛等。病情往往反復(fù)遷延，治療后容易復(fù)發(fā)，難以完全治愈，并存在一定的癌變風(fēng)險[2]。UC 發(fā)病機制尚未完全明確，目前研究認(rèn)為主要與遺傳易感性、自身免疫、外在環(huán)境的刺激及腸道黏膜屏障損傷有較大關(guān)聯(lián)[3]。因此，治療方法以控制炎癥、改善臨床癥狀、減少復(fù)發(fā)為主[4]，藥物選擇上主要選擇使用水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑類藥物[5-6]，但仍缺乏能夠徹底治愈UC 的方法，且長時間藥物治療帶來的不良反應(yīng)一直困擾著醫(yī)患雙方[7]。

中醫(yī)藥治療UC 是不可忽視的一種手段，UC 屬中醫(yī)“痢疾”“泄瀉”等范疇。白術(shù)、蒼術(shù)為中醫(yī)治療瀉痢之要藥，二者常作為藥對配伍使用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，二者的主要成分具有保護腸黏膜、抑制炎癥、增強免疫力等藥理作用，其水提物能糾正UC 大鼠模型的免疫紊亂，機制可能與其調(diào)節(jié)炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-17 的作用有關(guān)[8-10]。但目前UC 的臨床研究仍然多針對于近期療效，機制研究相對較少[11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討白術(shù)-蒼術(shù)干預(yù)UC 的作用機制，為后續(xù)進一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白術(shù)-蒼術(shù)藥對主要化學(xué)成分研究

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）與中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，Batman-TCM）收集白術(shù)-蒼術(shù)的主要化學(xué)成分，并使用PubChem 數(shù)據(jù)庫來核對這些化合物的名稱與分子結(jié)構(gòu)。設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[12]及類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選的條件來篩選這些化合物。

1.2 蒼術(shù)-白術(shù)藥對的靶點預(yù)測和UC 靶點及蒼術(shù)-白術(shù)藥對治病靶點研究

通過Batman-TCM 分析平臺，檢索白術(shù)-蒼術(shù)的主要化學(xué)成分可能作用靶點，靶點獲取設(shè)置條件Prediction Score cutoff＞20，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫校正靶點名稱。以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards 檢索并下載有關(guān)的基因。使用“Venny”將蒼術(shù)-白術(shù)藥對靶點與UC 作用靶點取交集。

1.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.2.1 將上述的預(yù)測和篩選結(jié)果，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 白術(shù)-蒼術(shù)藥對治病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein ineraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)

通過String 數(shù)據(jù)庫分別構(gòu)建白術(shù)-蒼術(shù)藥對治病靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)中蛋白的條形圖。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

運用R 語言軟件對“1.3”中的靶點蛋白進行GO功能富集分析與KEGG 通路富集分析。從富集分析來闡釋白術(shù)-蒼術(shù)藥對生物學(xué)角度的科學(xué)內(nèi)涵。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)-蒼術(shù)藥對主要成分及靶點

利用TCMSP 和Batman-TCM 收集白術(shù)-蒼術(shù)的主要化學(xué)成分，經(jīng)篩選后共獲取16 個有效活性成分，其中白術(shù)7 個、蒼術(shù)9 個。見表1。

表1 篩選出的白術(shù)-蒼術(shù)主要成分與靶點

2.2 UC 相關(guān)基因

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫共檢索出4209 個UC 相關(guān)基因，與白術(shù)和蒼術(shù)有效成分對應(yīng)的靶基因取交集，得到259 個共同基因。見圖1。

圖1 藥物成分靶點與疾病靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

運用Cytoscape 軟件來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，見圖2，可見白術(shù)-蒼術(shù)藥對通過259 種共同有效成分作用于與UC相關(guān)的31 個靶點。圖中八邊形表示白術(shù)-蒼術(shù)共同有效成分，圓形表示藥物-UC 共同靶點。

圖2 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)

把“2.3”中得到的共同靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫里面，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)互作圖，見圖3，圖中共含有31 個節(jié)點與1920 條邊。圖中的各個節(jié)點表示各基因蛋白，節(jié)點互相間的連接線代表所相接的2 個蛋白存在相互作用的關(guān)系，連接線越粗則代表這種關(guān)系越強。依據(jù)鄰接節(jié)點數(shù)，選出居于前30 位靶點，見圖4，左列是基因名，數(shù)字代表著相應(yīng)基因鄰接節(jié)點數(shù)目，例如，“MAPK1”鄰接節(jié)點的數(shù)目為41。每個基因鄰接的節(jié)點數(shù)目越多，則意味著其成為核心基因的概率就越大。分析出核心基因主要有E1A 結(jié)合蛋白P300（EP300）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activation protein kinase 1，MAPK1）等。

圖3 白術(shù)-蒼術(shù)藥對治病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 篩選出的前30 位核心基因

2.5 關(guān)鍵靶基因GO 功能與KEGG 通路富集分析

利用R 語言軟件進行GO 功能和KEGG 通路富集分析后，獲得GO 條目1038 個，其中生物過程有829 個，細胞組分有59 個，分子功能有150 個。分別選取前20 位，富集情況見圖5～7，主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、調(diào)控DNA 模板轉(zhuǎn)錄、細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶、細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、炎癥反應(yīng)、特異序列DNA 綁定、蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子活性等。KEGG 通路富集中（P ＜0.05）有122 條，選取前18 條通路，富集情況見圖8?？梢娭饕蠵I3K/Akt 信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、人類嗜T 細胞病毒1 型（human T-cell lymphotropic virus-1，HTLV-1）、TNF 信號通路、MAPK 信號通路等。

圖5 GO（生物過程）富集氣泡圖

圖6 GO（細胞組分）富集氣泡圖

圖7 GO（分子功能）富集氣泡圖

圖8 KEGG 富集氣泡圖

3 討論

UC 屬于慢性非特異性炎癥性腸病，相關(guān)炎癥信號通路在特定條件刺激下被激活，從而引起腸黏膜炎癥損傷。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出EP300、TNF-α等核心基因在腸黏膜的炎癥反應(yīng)過程中有重要作用，NF-κB、MAPK、PI3K/Akt 等通路屬于炎癥信號通路，與UC 的發(fā)病有密切聯(lián)系，具體闡述如下：

NF-κB 在UC 發(fā)病機制中的作用：研究表明，NF-κB 在調(diào)控與黏膜炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因中起核心作用，在炎癥信號刺激下，NF-κB 從細胞膜向細胞核轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)相關(guān)下游靶基因的釋放，調(diào)控細胞壞死、凋亡與癌變等。正常情況下，介導(dǎo)NF-κB 通路的激活信號在T 細胞及其他大多數(shù)細胞類型中都是短暫的，主要刺激典型NF-κB 通路，但NF-κB 在HTLV-1 轉(zhuǎn)化的T 細胞株和新近分離的T 細胞中均可被激活，導(dǎo)致HTLV-1 可對NF-κB 進行持續(xù)性激活[13]，使得結(jié)腸黏膜持續(xù)性損傷，而阻斷叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O 亞型3的表達，可使NF-κB 活性受到抑制，從而讓結(jié)腸黏膜損傷得到緩解[14-15]。

NF-κB 與MAPK、PI3K/Akt 信號通路在UC 發(fā)病機制中的關(guān)系：巨噬細胞特異性表達激活了許多炎癥反應(yīng)鏈，包括Toll 樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）、PI3K/Akt 及其下游NF-κB 和MAPK 信號通路等。這些通路在調(diào)節(jié)UC 患者細胞因子釋放和參與UC 腸道炎癥和免疫反應(yīng)中起著核心作用[16]。PI3K/Akt 信號通路在腸道通過大量的細胞因子介導(dǎo)異常炎癥反應(yīng)，其信號活化后，首要的功能就是激活NF-κB 并參與TNF-α、IL-1 等促炎性細胞因子釋放，誘導(dǎo)UC 發(fā)病[17-18]，而阻斷PI3K/Akt 信號通路可以緩解結(jié)腸黏膜的損傷[19-20]。在炎癥反應(yīng)過程中，巨噬細胞中MAPK 的磷酸化對NF-κB 的激活和隨后促炎癥介質(zhì)的釋放至關(guān)重要[21]。阻斷TLR4 及其下游的NF-κB/MAPK 通路，可降低TLR4、NF-κB、MAPK 信號相關(guān)蛋白的表達，同時下調(diào)體內(nèi)炎癥因子的釋放，從而減輕UC 的炎癥反應(yīng)[22]。

核心基因EP300、TNF-α 與UC 發(fā)病的關(guān)聯(lián)：P300 蛋白是一種多向共激活因子，參與結(jié)腸組織細胞的凋亡、分化和增殖，體細胞突變EP300 基因已在多種人類惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，包括結(jié)腸癌[23]，而EP300 表達水平與結(jié)腸癌淋巴結(jié)浸潤之間存在一定相關(guān)性，組織中腫瘤蛋白TP53 的表達水平也高于正常結(jié)腸組織[24]。通過巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥啟動因子TNF-α 可促使UC 的發(fā)生與進展[25]，其主要通過對中性粒細胞趨化作用，浸潤腸黏膜組織細胞，使其出現(xiàn)炎癥損傷[26-27]。研究表明，藥物可通過抑制TNF-α 的表達水平，并上調(diào)相關(guān)抗炎因子的表達，修復(fù)結(jié)腸組織，促進潰瘍的愈合，且與IL-22 聯(lián)合干預(yù)UC 的治療，具有一定靶向治療的意義[28]。

目前為止，UC 的發(fā)病原因與機制研究仍是一個瓶頸，一般認(rèn)為其主要與環(huán)境、感染、遺傳及免疫因素相關(guān)性較大[29]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對于白術(shù)-蒼術(shù)藥對通過多成分、多靶點、多通路來干預(yù)UC 的作用機制進行了闡釋，為下一步實驗性的藥理研究提供了一定線索，拓展了思路。然而目前對UC 的認(rèn)知仍處在不斷完善之中，其次，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也具有一定自身局限性，因此可能存在一定程度的偏倚風(fēng)險，仍需要后續(xù)的實驗性研究進一步佐證。