耿一萌，孟 軻，王一迪；楊珍珍，梅葉玲，張騰飛，馬 望

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，給人類生命健康帶來嚴(yán)重危害[1]。大約85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]，其中肺腺癌為NSCLC 中主要的亞型之一。在亞洲，近50% 晚期NSCLC 患者中存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變[3]，EGFR-酪 氨酸激酶抑制（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）靶向治療對該類患者具有顯著的療效，但耐藥性限制了靶向治療療效[4]。最常見的耐藥機(jī)制是在EGFR基因20 外顯子位點790中甲硫氨酸取代了蘇氨酸，即發(fā)生了T790M 突變[5]，然而目前臨床上仍有部分耐藥患者無法行二次基因檢測或因檢測結(jié)果假陰性，導(dǎo)致無法明確T790M 基因突變狀況。因此，探索影響患者接受EGFR-TKIs 治療療效的預(yù)后因素及耐藥性T790M 突變等生物標(biāo)志物，對指導(dǎo)臨床診療具有重要意義。

臨床上容易獲得的臨床病理特征是目前有潛力的疾病預(yù)測因子。較多研究發(fā)現(xiàn)臨床合并指數(shù)與腫瘤風(fēng)險和預(yù)后相關(guān)，如在一定程度上反映體內(nèi)炎性水平的中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）、血 小板與淋巴細(xì)胞比值（platelet lymphocyte ratio，PLR）以及單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（monocyte lymphocyte ratio，MLR）等[6-7]，但在接受EGFR-TKIs 靶向治療的NSCLC 患者中尚未有相關(guān)研究報道。同上有研究顯示，肝酶不僅能反映患者的肝功能，也在一定程度上參與患者代謝及免疫狀況，較多回顧性研究發(fā)現(xiàn)肝酶可以預(yù)測各種癌癥預(yù)后[8-9]，但在肺癌患者中的報道較少。目前已證實，臨床上攜帶敏感EGFR突變的NSCLC 大多具有以下特征：女性、從不吸煙、東亞人和病理類型為肺腺癌[10]，但在第一代EGFR-TKIs 耐藥的肺癌患者中，尚未有研究報道與T790M 耐藥突變相關(guān)的臨床特征。因此希望開展本研究，以探討簡單的臨床病理因素是否可作為肺腺癌患者EGFR-TKIs 靶向治療預(yù)后及EGFR-TKIs 耐藥后T790M 突變狀況的預(yù)測因子。

1 資料與方法

1.1 患者資料

收集2015 年1 月—2018 年12 月就診于本院的137例肺腺癌患者的資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理和組織學(xué)證實為肺腺癌，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，臨床TNM 分期為Ⅳ期；（2）根據(jù)下一代測序（next generation sequencing，NGS）結(jié)果提示，所有患者均為EGFR基因的19 外顯子缺失突變（19Del）或21 外顯子L858R 點突變（21L858R），無其他復(fù)雜突變及T790M 突變；（3）初治應(yīng)用第一代EGFR-TKIs 藥物[吉非替尼片（gefitinib）或者鹽酸?？颂婺崞╥cotinib）]治療；（4）至少有一個可評估的病變；（5）有足夠的骨髓、腎臟和肝臟功能；（6）臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦轉(zhuǎn)移患者、肝轉(zhuǎn)移患者、預(yù)計生存期＜3個月或臨床資料和隨訪資料不完整的患者。

1.2 收集的臨床病理特征

收集患者年齡、性別、吸煙史、器官轉(zhuǎn)移的數(shù)量、EGFR突變類型、EGFR-TKIs 藥物、Ki-67 增殖指數(shù)，淋巴細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)、血清白蛋白以及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamyl transferase，γ-GGT）等臨床指標(biāo)；以及由實驗室檢驗指標(biāo)計算出的臨床參數(shù)：PLR ＝外周血血小板計數(shù)（×109/L）/ 外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)（×109/L），NLR ＝外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)（×109/L）/ 外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)（×109/L），MLR ＝外周血單核細(xì)胞計數(shù)（×109/L）/ 外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)（×109/L），營養(yǎng)預(yù)后指數(shù)（prognostic nutritional index，PNI）＝血清白蛋白值（g/L）＋5×外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)（×109/L）。

1.3 外周血及病理組織檢測方法

在治療前1 周內(nèi)，清晨采集所有研究對象的空腹靜脈血，用真空采集管分別收集靜脈血2及4 mL。采用血細(xì)胞分析儀檢測淋巴細(xì)胞計數(shù)，血小板計數(shù)，中性粒細(xì)胞計數(shù)，單核細(xì)胞計數(shù)；雙縮脲法檢測血清白蛋白；采用IFCC 速率法檢測γ-GGT?；颊咝薪M織活檢術(shù)取得腫瘤組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測Ki-67 的表達(dá)水平。

1.4 治療方法

所有患者均接受第一代EGFR-TKIs 藥物治療，根據(jù)患者意愿選擇吉非替尼或者鹽酸?？颂婺醄 吉非替尼片（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20 100014；生產(chǎn)廠家為AstraZeneca UK Limited）；口服250 mg/次，1 次/d；鹽酸?？颂婺幔ㄅ鷾?zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20 110061；生產(chǎn)廠家為貝達(dá)藥業(yè)股份有限公司）；口服125 mg/次，3 次/d]。患者在治療期間可以根據(jù)病情給予止痛和營養(yǎng)等對癥支持治療，但不予其他抗腫瘤治療，用藥持續(xù)到無法耐受藥物不良反應(yīng)或病情進(jìn)展為止。4 周為1 個療程，前2 個療程每次結(jié)束后均行影像學(xué)復(fù)查，之后每2 個療程行影像學(xué)復(fù)查1 次。

1.5 療效評估與隨訪

基于實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）（版本1.1），應(yīng)用計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）評估病情。主要終點是無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS），即患者從接受治療開始，至疾病進(jìn)展或者發(fā)生因為任何原因的死亡之間的時間。通過調(diào)取患者CT 影像或打電話以獲取患者疾病進(jìn)展情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并計算生存率，采用logrank 法進(jìn)行組間生存率差異的比較；使用COX比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。Fisher確切概率法用于分類變量的相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者特征

137例患者中男性51例（37.2%），女性86例（62.8%）；中位年齡為59 歲（范圍：30～83歲）；EGFR基因19Del 突變者73例（53.3%），21L858R 突變者64例（46.7%）；Ki-67 增殖指數(shù)中位數(shù)為30%（范圍：5%～90%）。γ-GGT 中位值為22.00 U/L（范圍：4.93～155.00 U/L），正常值為0～58 U/L，本研究中以58 U/L 為臨界值，按γ-GGT 值將患者分為2組[即正常組121例（88.3%），異常組16例（11.7%）]。根據(jù)患者治療前血液學(xué)檢驗結(jié)果計算獲得指標(biāo)：中位PLR 值為146.5（范圍：51.9～723.0），中位NLR 值為2.62（范圍：0.12～25.00），中位MLR 值為0.34（范圍：0.02～3.55），中位PNI 值為48.4（范圍：29.5～61.9）。臨床病理特征詳見表1。

表1 137例肺腺癌患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological features of 137 patients with lung adenocarcinoma(N ＝137)

截至隨訪結(jié)束，有53例（38.7%）患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，84例（61.3%）患者病情穩(wěn)定或緩解，全組患者的中位PFS 時間為16.0 個月（1～51月），平均PFS 期為9.1 個月。

2.2 生存分析

2.2.1 單因素分析

應(yīng)用log-rank 法進(jìn)行單變量生存分析以確定與PFS 有關(guān)的臨床特征，結(jié)果（表2）提示患者吸煙與否、治療前轉(zhuǎn)移器官個數(shù)、Ki-67增殖指數(shù)及γ-GGT 水平與PFS 期有關(guān)（P值均＜0.05），然而EGFR突變類型、年齡、性別、TKIs 藥物類型及NLR、PLR、MLR、PNI 在預(yù)測PFS 方面，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。

表2 肺腺癌患者的單因素生存分析Table 2 The univariate analysis of PFS in the patients with lung adenocarcinoma(N ＝137)

Kaplan-Meier 法分析結(jié)果顯示，γ-GGT 值異常者的PFS 期為9.0 個月，短于γ-GGT 值正常者（17.0 個月）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.003）（圖1）；Ki-67 增殖指數(shù)≤50%患者的中位PFS期為7.0 個月，明顯短于Ki-67 增殖指數(shù)≥50%者（PFS 期為18.0 個月）（P＜0.001）（圖1B）；僅有1 個器官轉(zhuǎn)移與至少有2 個器官轉(zhuǎn)移者的中位PFS 期分別為17.5 和10.0 個月（P＝0.008）（圖1C）；不吸煙者的中位PFS 期為11.0 個月，不吸煙者的中位PFS 期為17.0 個月（P＝0.004），不吸煙者比吸煙者多6.0 個月（圖1D）。

Fig.1 The association of γ-GGT expression level (A),Ki-67 index (B),number of organ metastasis (C)and smoking status (D) with PFS in 137 patients with lung adenocarcinoma.PFS:Progression-free survival;γ-GGT:Gamma-glutamyl transferase.圖1 137例肺腺癌患者的γ-GGT 表達(dá)水平（A）、Ki-67 增殖指數(shù)（B）、器官轉(zhuǎn)移個數(shù)（C）和吸煙狀況（D）與PFS 的關(guān)系

2.2.2 多因素分析

把單因素生存分析結(jié)果里對患者PFS 有影響的指標(biāo)γ-GGT、Ki-67 增殖指數(shù)、器官轉(zhuǎn)移及吸煙史納入COX多因素分析。結(jié)果（表3）顯示，Ki-67 增殖指數(shù)、γ-GGT 和器官轉(zhuǎn)移個數(shù)為獨立的預(yù)后因素（P值均＜0.05）。

表3 137例肺腺癌患者預(yù)后的多因素分析Table 3 The multivariate analysis of progression-free survival (PFS) in 137 patients with lung adenocarcinoma

2.3 各指標(biāo)與進(jìn)展后T790M 的關(guān)系

137例患者中有53例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，其中有32例患者進(jìn)行了二次組織活檢行基因檢測，19例（59.4%）患者發(fā)生T790M 突變陽性，13例（40.6%）患者為T790M 突變陰性。根據(jù)Fisher 確切概率法分析顯示，年齡與T790M 突變狀態(tài)有關(guān)（P＝0.029），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表4）；這一結(jié)果提示，在一代EGFR-TKIs 靶向治療進(jìn)展后的患者中，年齡＜65 歲的患者更可能發(fā)生T790M 突變。

表4 53例肺腺癌患者的臨床病理特征與T790M 突變之間的關(guān)系Table 4 Relationship between clinicopathological features and T790M mutation in 53 patients with lung adenocarcinoma[n(%)]

3 討論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，最有效的治療方法是手術(shù)[1]，然而，約70%的肺癌患者在診斷時已是局部晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，不適合手術(shù)治療。近年來，靶向治療的進(jìn)展為晚期肺癌患者提供了新的治療方案，尤其EGFR-TKIs 已被推薦作為具有EGFR敏感突變患者的一線治療方案，與傳統(tǒng)放化療相比具有明顯的疾病緩解率和生存優(yōu)勢。然而，患者接受EGFR-TKIs 治療后往往出現(xiàn)耐藥，PFS 僅為9～14 個月[4]。因此，早期預(yù)測患者靶向治療預(yù)后，對于改善生存具有重要意義。在耐藥患者中，有超過50%患者的耐藥機(jī)制是因獲得了T790M 突變，但由于組織活檢為有創(chuàng)性操作，且T790M 檢測具有假陰性，部分耐藥患者因無足夠的臨床證據(jù)未能接受第三代EGFR-TKIs 靶向治療，預(yù)后較差，因此探索T790M 突變相關(guān)影響因素具有重要意義。

本文回顧性分析了137例接受第一代EGFRTKIs 藥物的晚期肺腺癌患者，單因素生存分析結(jié)果顯示不同吸煙狀況，治療前轉(zhuǎn)移器官數(shù)目，不同Ki-67 增殖指數(shù)和γ-GGT 水平均為患者預(yù)后的重要影響因素，其中吸煙、多發(fā)器官轉(zhuǎn)移、高水平Ki-67 增殖指數(shù)和高水平γ-GGT 的患者預(yù)后差，這與先前的研究一致。COX多因素生存分析結(jié)果顯示，器官轉(zhuǎn)移數(shù)目、Ki-67 增殖指數(shù)和γ-GGT 是接受第一代EGFR-TKIs 的肺腺癌患者PFS 的獨立預(yù)后因素。眾所周知，不吸煙患者較吸煙患者更易發(fā)生EGFR突變[11]，而在EGFR敏感突變的晚期NSCLC 患者中，一項薈萃分析結(jié)果表明不吸煙患者的PFS 長于吸煙患者[12]，最常見的原因是非吸煙患者具有較高的EGFR突變率，在本研究中吸煙患者和不吸煙患者的中位PFS 分別為11 和17 個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，再次驗證了EGFR-TKIs 靶向治療在吸煙和不吸煙患者中具有不同的療效，不吸煙患者在一線EGFR-TKIs 靶向治療中具有更長的PFS。一項韓國研究結(jié)果表明，對于接受EGFR-TKIs 靶向治療的晚期NSCLC 患者，非重度吸煙患者的PFS 比重度吸煙患者更好[13]，而本研究僅收集吸煙狀態(tài)的數(shù)據(jù)，在以后的研究中可進(jìn)一步收集吸煙時間和吸煙量來分析吸煙指數(shù)對預(yù)后的影響。Ki-67 增殖指數(shù)是目前評價腫瘤細(xì)胞增殖最可靠的免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，其蛋白表達(dá)水平和腫瘤惡性程度有關(guān)，在判斷癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后方面具有重要作用，有研究顯示在亞洲早期肺腺癌患者中，Ki-67 高表達(dá)與總生存率及PFS 呈負(fù)相關(guān)[14]；ZHANG 等[15]研究結(jié)果提示，在接受EGFR-TKIs 靶向治療的晚期肺腺癌患者中，較低的Ki-67 指數(shù)提示預(yù)后良好。本研究中發(fā)現(xiàn)，Ki-67 指數(shù)是晚期肺腺癌患者EGFR-TKIs 靶向治療的獨立預(yù)后因素，Ki-67 表達(dá)水平≥50%與表達(dá)水平＜50%患者的中位PFS 分別為7 和18 個月，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，Ki-67 高表達(dá)者預(yù)后較差，這與先前研究結(jié)論一致。γ-GGT 是一種膜依賴性酶，主要來自肝臟，參與抗氧化劑谷胱甘肽的分解代謝，其促氧化和促炎特性被認(rèn)為是導(dǎo)致不良疾病結(jié)局的病因機(jī)制。有研究表明，γ-GGT 與多種癌癥患者生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，如胰腺癌[16]、直腸癌[17]和卵巢癌[18]等。γ-GGT 在肺癌中的研究較少，BOZKAYA 等[19]發(fā)現(xiàn)，高血清γ-GGT 水平是轉(zhuǎn)移性NSCLC 患者總生存期和PFS 的獨立不良預(yù)后因素，但在該研究中排除了接受EGFR-TKIs 靶向治療的患者。本研究中分析了γ-GGT 水平對晚期肺腺癌患者EGFRTKIs 靶向治療療效的影響，結(jié)果表明高水平γ-GGT 患者與低水平γ-GGT 患者的中位PFS 分別為9和17個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.003），COX多因素分析結(jié)果提示，γ-GGT 水平是患者的獨立預(yù)后因素（HR＝3.938，P＝0.001）。臨床上常以58 U/L 來作為血清γ-GGT 正常水平的臨界值，本研究以此為截斷點，發(fā)現(xiàn)具有異常γ-GGT 水平的患者預(yù)后差，由于本研究在納入患者時已排除肝轉(zhuǎn)移者，因此結(jié)果具有較低偏差；且由于血清γ-GGT 是氧化應(yīng)激的標(biāo)志，一定程度上反映了腫瘤細(xì)胞的代謝狀況，在預(yù)后癌癥預(yù)后方面具有重要價值。

對第一代或第二代EGFR-TKIs 靶向治療耐藥的NSCLC 患者有半數(shù)發(fā)生耐藥性T790M 突變[20]這一研究結(jié)果，本研究中對137例患者中有53例發(fā)生疾病進(jìn)展，其中32例患者進(jìn)行了二次基因測序，結(jié)果顯示19例患者為T790M 突變陽性，突變率為59.4%，這與先前結(jié)果基本相符。另有研究表明，T790M 突變狀態(tài)與L858R具有關(guān)聯(lián)性[21]，而在本研究中，可能樣本較少的原因，未發(fā)現(xiàn)T790M 突變狀態(tài)與患者原突變類型的差異。但本研究中發(fā)現(xiàn)，患者年齡與T790M 突變狀態(tài)相關(guān)（P＝0.029），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。DAL MASO 等[22]針對高加索人群的研究發(fā)現(xiàn)，患者年齡與繼發(fā)性T790M 突變陽性相關(guān)，年齡＜65 歲者更易發(fā)生T790M 突變。本研究中，基于中國人群得出了相同結(jié)論，即患者年齡與T790M 突變狀況相關(guān)，年齡＜65 歲的患者T790M 突變率高于年齡≥65 歲的患者。然而一項基于日本人的研究結(jié)果表明，≥75 歲患者的耐藥性T790M 突變率高于年輕患者[23]，該研究人群中位年齡為70 歲，而本研究人群中位年齡為59 歲，可能由于人群年齡的差異導(dǎo)致結(jié)果的不一致，這需要后續(xù)大樣本量研究來探索年齡與耐藥性T790M 突變的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，年齡與T790M 突變狀況相關(guān)，對于此類患者可推薦行第二次基因檢測，或基因檢測結(jié)果不理想的情況下推薦患者應(yīng)用第三代TKIs 治療。

盡管本研究結(jié)果表明，吸煙狀態(tài)、Ki-67 增殖指數(shù)及γ-GGT 水平在接受一線EGFR-TKIs 靶向治療的EGFR突變型肺腺癌患者中的預(yù)后價值，以及年齡與T790M 的相關(guān)性，但仍存在一定的局限性。首先，這是一個單中心回顧性研究，樣本量相對較小，各組之間的不平衡可能會給結(jié)果帶來一些偏差；其次，臨界值與以前的研究不同，這使得很難將本研究結(jié)果與其他研究進(jìn)行比較；研究僅收集了患者的PFS 資料，由于失訪率較高，限制了本研究對總生存期資料的收集，在今后的研究中會擴(kuò)大樣本量，補(bǔ)充多總生存期影響的研究。由于該領(lǐng)域大多數(shù)研究為回顧性，因此仍需要更大樣本量的多中心前瞻性研究來進(jìn)一步驗證吸煙狀態(tài)、Ki-67 增殖指數(shù)及γ-GGT 水平在接受一線EGFR-TKIs 靶向治療的肺腺癌患者中的預(yù)后價值，以及年齡對T790M 突變狀況的影響。