肖 劍，陳亦龍，譚國(guó)林，宋業(yè)勛

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是我國(guó)南方各個(gè)省份及東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一。大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是中晚期[1]，單純放療效果欠佳，以放療為主、化療為輔的綜合治療是中晚期鼻咽癌患者的首選治療策略[2]。然而，臨床上往往出現(xiàn)的化療耐藥現(xiàn)象，顯著降低了鼻咽癌患者的總體生存率。紫杉醇（Taxol）在鼻咽癌的治療中應(yīng)用最為廣泛，因此深入闡明紫杉醇的耐藥機(jī)制具有重要意義。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類短的、高度保守的內(nèi)源非編碼 RNA（長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸），通過(guò)與靶標(biāo)基因mRNA 的3’-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）結(jié)合而參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。miRNA 已被證明是解決不同惡性腫瘤中化學(xué)耐藥機(jī)制的有前途的治療靶點(diǎn)[4]。此外，研究表明特定miRNA的表達(dá)與抗癌藥物耐藥性的發(fā)展有關(guān)[5]。已有研究表明，miR-409-3p 在不同的腫瘤組織中既可能發(fā)揮抑癌作用，又可能發(fā)揮促癌作用，甚至當(dāng)同一腫瘤處于生長(zhǎng)期的不同階段時(shí)，miR-409-3p 在其中發(fā)揮的作用可能相反[6-9]。

目前有關(guān)miR-409-3p 在鼻咽癌耐藥中可能發(fā)揮的作用尚不清楚，因此本研究旨在探討miR-409-3p 與其靶基因MTF2 的調(diào)控關(guān)系，以及在鼻咽癌紫杉醇耐藥中的作用機(jī)制，以期為鼻咽癌化療耐藥逆轉(zhuǎn)提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

鼻咽癌親本細(xì)胞株CNE-1 和5-8F 由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所惠贈(zèng)，對(duì)紫杉醇耐藥的細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 由本科室研究團(tuán)隊(duì)前期用紫杉醇作為誘導(dǎo)劑，在體外以藥物大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法作用于人鼻咽癌細(xì)胞株構(gòu)建獲得[10]。

胎牛血清及RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，紫杉醇注射液購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol 試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。miR-409-3p-抑制子（miR-409-3p-inhibitor）和陰性對(duì)照（negative control，NC）-inhibitor 以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒qRT-PCR Starter Kit 購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。miR-409-3p-模擬物（miR-409-3p-mimics）和NC-mimics、攜帶有MTF2 全基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MTF2 和陰性對(duì)照pcDNA3.1-NC 購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司；攜帶有野生型（wild type，WT）MTF2-3’-UTR（MTF2-WT）和突變型（mutant type，MUT）MTF2-3’-UTR（MTF2-MUT）的腎素?zé)晒馑孛笀?bào)告質(zhì)粒購(gòu)自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。兔抗人MTF2 單克隆抗體和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自美國(guó)Licor 公司，蛋白預(yù)染指示劑Marker 購(gòu)自美國(guó)Fermentas 公司，一抗和二抗稀釋液購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司，Lipofect AMINE 3000 購(gòu)自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。

倒置光學(xué)顯微鏡為日本Olympus 公司產(chǎn)品，Novo-Cyte 流式細(xì)胞儀為美國(guó)ACEA 公司產(chǎn)品，電泳儀為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品，Mastercycle gradient PCR 儀為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

鼻咽癌親本細(xì)胞（CNE-1 和5-8F）和鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞（CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部或細(xì)胞融合度＞80%后傳代，取對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 平板克隆實(shí)驗(yàn)及CCK-8 法檢測(cè)鼻咽癌親本細(xì)胞及紫杉醇耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性

平板克隆實(shí)驗(yàn)：收集鼻咽癌親本細(xì)胞株CNE-1 和5-8F 以及紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為333 個(gè)/mL，6 孔板中每孔均勻接種1.5 mL 細(xì)胞懸液；待細(xì)胞貼壁后每組細(xì)胞中加入不同濃度梯度的紫杉醇溶液（0、0.5、1、2、3、4、8 和12 nmol/L）進(jìn)行處理，24 h 后撤掉紫杉醇溶液，加入新的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周左右；最后每孔中加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，再加入適量的結(jié)晶紫染色液將細(xì)胞染色10～15 min。將6 孔板置于低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)＞10 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。計(jì)算克隆形成率并繪制平板克隆折線圖，克隆形成率（%）＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

CCK-8 法檢測(cè)：收集4組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液的密度調(diào)整為4×104個(gè)/mL，以每孔100 μL的細(xì)胞數(shù)均勻加入96 孔板中（其中空白組不接種細(xì)胞）；每個(gè)孔中加入不同濃度的紫杉醇溶液（0、0.5、1、2、3、4、8 和12 nmol/L）（其 中空白組和對(duì)照組不加紫杉醇溶液，每個(gè)濃度梯度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔），將96 孔培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，吸除舊培養(yǎng)液；每孔中加入100 μL CCK-8 溶液（按1 ∶10 的體積比例配制），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)40～60 min，最后在免疫酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔細(xì)胞的D值，使用Graphpad Prism 7 軟件計(jì)算細(xì)胞存活率和紫杉醇對(duì)各株細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)miR-409-3p 在鼻咽癌親本細(xì)胞株及紫杉醇耐藥細(xì)胞株之間的表達(dá)差異

收集鼻咽癌親本細(xì)胞株CNE-1 和5-8F 及紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol，加入TRIzol 試劑，裂解提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；取2 μL 制備獲得的cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性10 min，之后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性2 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s）。引物序列：miR-409-3p 上游引物序列為5’-GCGAATGTTGCTCGGTGAG-3’，下 游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參照U6 上游引物序列為5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，下游引物序列為5’-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3’；MTF2 基因上游引物序列為5’-CTGGGATAGATTGCACCCTG-3’，下游引物序列為5’-ATTCGCAACCCAAACAAATGC-3’；內(nèi)參照GAPDH基因上游引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 接種于6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用LipofectAMINE 3000 轉(zhuǎn)染試劑將miR-409-3p-inhibitor 和對(duì)照NC-inhibitor 分別轉(zhuǎn)入紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中，轉(zhuǎn)染流程見(jiàn)試劑盒提供的操作說(shuō)明；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)流程同1.2.3 節(jié)，并用平板克隆實(shí)驗(yàn)及CCK-8 法檢測(cè)抑制miR-409-3p 表達(dá)后的耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的變化，實(shí)驗(yàn)流程同1.2.2 節(jié)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-409-3p和MTF2 基因的相關(guān)性

通 過(guò)Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk 數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)miR-409-3p 可能的下游靶基因，初步篩選miR-409-3p 的下游靶基因可能是MTF2。

將miR-409-3p-mimics、NC-mimics 與攜帶有MTF2-WT 和MTF2-MUT 的重組腎素?zé)晒馑孛笀?bào)告質(zhì)粒兩兩組合后共轉(zhuǎn)染5-8F 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同1.2.4 節(jié)；轉(zhuǎn)染48 h 后使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，然后記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)。采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析熒光素酶活性，以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性作為內(nèi)控參照。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)抑制miR-409-3p 表達(dá)后對(duì)MTF2 mRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，及MTF2 在鼻咽癌親本細(xì)胞株及紫杉醇耐藥細(xì)胞株的表達(dá)差異

將miR-409-3p-inhibitor 和NC-inhibitor分別轉(zhuǎn)入紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol中，轉(zhuǎn)染流程見(jiàn)試劑盒提供的操作說(shuō)明；實(shí)驗(yàn)分為4組：5-8F/Taxol ＋miR-409-3p-inhibitor組、5-8F/Taxol ＋NC-inhibitor組、CNE-1/Taxol ＋miR-409-3p-inhibitor組、CNE-1/Taxol ＋NC-inhibitor組，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)抑制miR-409-3p對(duì)靶基因MTF2 mRNA 表達(dá)水平的影響，并檢測(cè)MTF2 mRNA 在鼻咽癌親本細(xì)胞和紫杉醇耐藥細(xì)胞中的表達(dá)差異，實(shí)驗(yàn)流程同1.2.3 節(jié)。

同時(shí)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。收集上述各組細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化后，用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞3 次；加入RIPA 裂解液，收集細(xì)胞上清液，行SDS-PAGE 分離蛋白；電泳結(jié)束后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；將轉(zhuǎn)移膜置于搖床上用含5%牛血清白蛋白的封閉液封閉處理1 h；加入一抗[兔抗人MTF2 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶3000）]，4 ℃輕搖過(guò)夜；加入二抗[HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶15 000）]，室溫孵育1 h。二抗孵育完成后行熒光成像。

1.2.7 集落形成實(shí)驗(yàn)及CCK-8 法檢測(cè)過(guò)表達(dá)MTF2 后的耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol對(duì)紫杉醇敏感性的變化

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F/Taxol 細(xì)胞和CNE-1/Taxol 細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中（500/孔），24 h 后分別 將pcDNA3.1-MTF2 和pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)入5-8F/Taxol 細(xì)胞和CNE-1/Taxol 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒提供的操作說(shuō)明。采用平板克隆實(shí)驗(yàn)及CCK-8 法檢測(cè)過(guò)表達(dá)MTF2 后的耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的變化，實(shí)驗(yàn)流程同1.2.2 節(jié)。

1.2.8 FCM 法檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染6 h 后的5-8F/Taxol 細(xì)胞和過(guò)表達(dá)MTF2 的5-8F/Taxol 細(xì)胞，加入終濃度為2 nmol/L 的紫杉醇溶液處理48 h。采用AnnexinⅤ-FITC/PI 試劑盒染色5～15 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用± s表示。對(duì)于兩組間的均數(shù)的差異性檢驗(yàn)應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者是兩配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌親本細(xì)胞及紫杉醇耐藥細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性

分別采用CCK-8 法和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的紫杉醇對(duì)鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 及其對(duì)紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 增殖能力的影響，并計(jì)算IC50值。結(jié)果（圖1）顯示，紫杉醇對(duì)親本細(xì)胞5-8F 和CNE-1 的IC50值分別為（0.54±0.63）nmol/L和（1.02±0.41）nmol/L，對(duì)耐藥細(xì)胞5-8F/Taxol 和CNE-1/Taxol 的IC50值分別為（7.04±0.43）nmol/L 和（8.52±0.56）nmol/L；與親本細(xì)胞相比，紫杉醇耐藥細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的IC50值均明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。

有學(xué)者對(duì)無(wú)人駕駛時(shí)代進(jìn)行了展望，“從長(zhǎng)遠(yuǎn)趨勢(shì)來(lái)看，無(wú)人駕駛普及后，交通擁堵的現(xiàn)象會(huì)大幅下降，車禍等問(wèn)題也會(huì)相應(yīng)緩解——有研究表明，當(dāng)前90%以上的車禍都是人為因素引起的?！盵10]谷歌研制無(wú)人駕駛汽車的動(dòng)機(jī)與出發(fā)點(diǎn)就是降低交通事故的發(fā)生率，至于無(wú)人駕駛時(shí)代，是否就消滅了道路交通違法犯罪，難以預(yù)料。2016年2月14日谷歌無(wú)人駕駛汽車發(fā)生交通事故，2016年5月7日美國(guó)特斯拉汽車自動(dòng)駕駛汽車發(fā)生事故并造成駕駛員死亡，2017年3月24日優(yōu)步無(wú)人駕駛汽車發(fā)生交通事故。這些案例將無(wú)人駕駛推上了風(fēng)口浪尖，在無(wú)人駕駛時(shí)代，現(xiàn)行刑法的交通肇事罪的適用值得研究。

2.2 miR-409-3p 在鼻咽癌親本細(xì)胞株及紫杉醇耐藥細(xì)胞株之間的表達(dá)差異及miR-409-3p 與鼻咽癌紫杉醇耐藥性之間的關(guān)系

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-409-3p在鼻咽癌親本細(xì)胞株CNE-1 和5-8F 及紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 之間的表達(dá)水平的差異。結(jié)果（圖2A）顯示，鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p 的表達(dá)水平明顯高于親本細(xì)胞株CNE-1和5-8F，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）。

為進(jìn)一步明確miR-409-3p 可能參與鼻咽癌的紫杉醇耐藥過(guò)程，在鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中轉(zhuǎn)染miR-409-3pinhibitor，并行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果（圖2B）顯示，耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol中miR-409-3p-inhibitor組的miR-409-3p 的表達(dá)水平均明顯低于NC-inhibitor組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）。

行CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性的變化。結(jié)果（圖2C）顯示，NC-inhibitor組中紫杉醇對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（6.92±0.45）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（7.51±0.21）nmol/L；miR-409-3p-inhibitor組中紫杉醇 對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（1.85±0.33）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（2.52±0.31）nmol/L。

行集落形成實(shí)驗(yàn)再次檢測(cè)抑制miR-409-3p表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性的變化。結(jié)果（圖2D）顯示，NC-inhibitor組中紫杉醇對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（7.23±0.25）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（7.72±0.39）nmol/L；miR-409-3p-inhibitor組中紫杉醇 對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（1.30±0.37）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞r 的IC50值為（2.20±0.45）nmol/L。

上述結(jié)果表明，抑制紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性明顯降低。

Fig.1 The cell viability of nasopharyngeal carcinoma parental cells (5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells(5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) treated with different concentrations of taxol for 48 h was detected by CCK-8 assay(A) and colony formation assay (B) (n=3).圖1 分別采用CCK-8 法（A）和集落形成實(shí)驗(yàn)（B）檢測(cè)不同濃度紫杉醇對(duì)鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 以及紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 存活能力的影響

Fig.2 The expression level of microRNA (miR)-409-3p in nasopharyngeal carcinoma parental cells (5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (A).The expression level of miR-409-3p in CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with miR-409-3pinhibitor was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (B).The change in sensitivity to taxol was detected by CCK-8 assay (C) and colony formation assay (D).CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC)-inhibitor were taken as the controls.***P<0.001 (n=3).圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-409-3p 在鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表達(dá)水平（A）、轉(zhuǎn)入miR-409-3p-inhibitor 對(duì)細(xì)胞中miR-409-3p 表達(dá)水平的影響（B）以及CCK-8 法（C）和集落形成實(shí)驗(yàn)（D）檢測(cè)沉默miR-409-3p 表達(dá)對(duì)紫杉醇耐藥細(xì)胞耐藥性的影響

2.3 miR-409-3p 靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

前期研究提示，miR-409-3p 在鼻咽癌耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表達(dá)水平明顯高于鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F。通過(guò)Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)miR-409-3p 可能的下游靶基因，共預(yù)測(cè)得出10 個(gè)共同靶基因（ATXN3、ELF2、GAB1、GNAL、MTF2、NUFIP2、RDX、SEC62、ZEB1 和ZFHX4）（圖3A）。鑒于此，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 初步篩選miR-409-3p 的下游靶基因在鼻咽癌親本與耐藥細(xì)胞中的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MTF2 mRNA 在鼻咽癌耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中低表達(dá)，與miR-409-3p 的表達(dá)水平呈相反趨勢(shì)。因此，本研究選擇MTF2 作為miR-409-3p 的靶基因進(jìn)行后續(xù)研究。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中抑制miR-409-3p表達(dá)后對(duì)靶基因MTF2 表達(dá)水平的影響。結(jié)果（圖3B）顯示，miR-409-3p-inhibitor組中MTF2 mRNA 的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P值均＜0.01）。

采用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步檢測(cè)耐藥細(xì)胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中抑制miR-409-3p表達(dá)后MTF2 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果（圖3C）顯示，miR-409-3p-inhibitor組5-8F/Taxol 細(xì)胞中MTF2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.791±0.131，CNE-1/Taxol 細(xì)胞中為0.402±0.115；NCinhibitor組5-8F/Taxol 細(xì)胞中MTF2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.113±0.102，CNE-1/Taxol 細(xì)胞中為0.192±0.124；這一結(jié)果表明，與NC-inhibitor組相比，miR-409-3p-inhibitor組細(xì)胞中MTF2 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P＜0.01 和P＜0.05）。

2.4 MTF2 與鼻咽癌紫杉醇耐藥性之間的關(guān)系

Fig.3 Targetscan,miRDB,miRTarBase and miRWalk databases were used to analyze the target gene of microRNA(miR)-409-3p (A).The expression levels of MTF2 mRNA (B) and protein (C) in taxol-resistant nasopharyngeal carcinoma cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) transfected with miR-409-3p-inhibitor were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.Luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miR-409-3p and MTF2 gene (D).*P<0.05,**P<0.01 (n=3).圖3 利用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-409-3p 的靶基因（A），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（B）和蛋白質(zhì)印跡法（C）檢測(cè)沉默miR-409-3 表達(dá)后對(duì)耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中MTF2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-409-3p 與MTF2 之間的靶向關(guān)系（D）

Fig.4 The expression levels of MTF2 mRNA (A) and protein (B) in nasopharyngeal carcinoma parental cells(5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.The expression level of MTF2 mRNA in 5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol cells transfected with pcDNA3.1-MTF2 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (C).The change in sensitivity to taxol in 5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol cells with MTF2 overexpression was detected by CCK-8 assay (D) and colony formation assay (E).CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC)(pcDNA3.1-NC) were taken as the controls.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.圖4 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測(cè)MTF2 mRNA 及蛋白在鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)入重組載體pcDNA3.1-MTF2 對(duì)CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 細(xì)胞中MTF2 mRNA 表達(dá)水平的影響（C），CCK-8 法（D）和集落形成實(shí)驗(yàn)（E）檢測(cè)MTF2 過(guò)表達(dá)后CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的變化

分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和蛋白印跡法檢測(cè)MTF2 mRNA 和蛋白在鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 中的表達(dá)差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，MTF2 mRNA 在親本細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯高于紫杉醇耐藥細(xì)胞（P＜值均0.01）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，MTF2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，在親本CNE-1 細(xì)胞中為0.91±0.11，耐藥CNE-1/Taxol 細(xì)胞中為0.41±0.21，親本5-8F 細(xì)胞中為0.59±0.24，耐藥5-8F/Taxol 細(xì)胞中為0.2±0.12；MTF2 蛋白在親本細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯高于紫杉醇耐藥細(xì)胞（P值均＜0.05）。上述結(jié)果表明，MTF2 可能參與了鼻咽癌對(duì)紫杉醇的耐藥。

將pcDNA3.1-MTF2 和陰性對(duì)照pcDNA3.1-NC 分別轉(zhuǎn)入耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)對(duì)耐藥細(xì)胞中的MTF2 mRNA 表達(dá)水平的影響。結(jié)果（圖4C）顯示，pcDNA3.1-MTF2組耐藥細(xì)胞中MTF2 mRNA 的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯上調(diào)（P值均＜0.001）。進(jìn)一步行CCK-8 法檢測(cè)耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 中過(guò)表達(dá)MTF2 后細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物敏感性的變化，結(jié)果（圖4D）顯示，對(duì)照組（pcDNA3.1-NC組）中紫杉醇對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（6.75±0.42）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（8.82±0.23）nmol/L；pcDNA3.1-MTF2組中紫杉醇對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（1.84±0.29）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（1.53±0.47）nmol/L。相應(yīng)的集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4E）顯示，對(duì)照組（pcDNA3.1-NC組）中紫杉醇對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（6.93±0.52）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（7.93±0.51）nmol/L；pcDNA3.1-MTF2組中紫杉醇對(duì)5-8F/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（1.92±0.48）nmol/L，對(duì)CNE-1/Taxol 細(xì)胞的IC50值為（1.21±0.44）nmol/L。與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MTF2 后，紫杉醇5-8F/Taxol 和CNE-1/Taxol細(xì)胞的IC50值均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。

上述結(jié)果提示，MTF2 參與了鼻咽癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥，鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中上調(diào)MTF2 的表達(dá)水平后其紫杉醇的耐藥性被降低。

2.5 MTF2 與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系

用紫杉醇（2 nmol/L）分別處理轉(zhuǎn)入重組載體pcDNA3.1-MTF2組和陰性對(duì)照pcDNA3.1-NC 的5-8F/Taxol細(xì)胞，48 h 后采用FCM 檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果（圖5）顯示，細(xì)胞的凋亡率由MTF2 陰性對(duì)照組的3.05% 提高到MTF2 過(guò)表達(dá)組的8.47%，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)MTF2 可以促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。

Fig.5 The apoptosis rate of taxol-resistant 5-8F/Taxol cells transfected with pcDNA3.1-MTF2 was detected by FCM.5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC) (pcDNA3.1-NC) were taken as the control.圖5 FCM 檢測(cè)紫杉醇對(duì)MTF2 過(guò)表達(dá)的紫杉醇耐藥細(xì)胞5-8F/Taxol 凋亡率的影響

3 討論

鼻咽癌治療中出現(xiàn)紫杉醇耐藥是一個(gè)長(zhǎng)期存在的臨床問(wèn)題，而獲得性耐藥的發(fā)生是患者化療療效欠佳的重要原因[11-12]。有報(bào)道提示，miRNAs 能改變腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的敏感性，miRNA 上調(diào)或者miRNA 沉默都可能增加化療的效果[13]，考慮到紫杉醇在鼻咽癌治療方面的廣泛應(yīng)用，尋找紫杉醇耐藥的治療靶點(diǎn)對(duì)提高臨床療效具有重要意義，因此本文重點(diǎn)探討了miR-409-3p 在鼻咽癌紫杉醇耐藥中的作用。

既往研究表明，miR-409-3p 可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞的遷移和侵襲等[14-18]。BAI 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-409-3p 在結(jié)腸癌癌組織中的表達(dá)較正常組織低，其靶基因GRB2 相關(guān)結(jié)合蛋白可介導(dǎo)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和抗原受體等多種受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。然而關(guān)于miR-409-3p 在鼻咽癌中的發(fā)揮的作用目前尚不清楚，本課題組以鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 以及耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 為研究對(duì)象，驗(yàn)證耐藥細(xì)胞有足夠的耐藥性，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p 的表達(dá)水平明顯高于親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F；隨后通過(guò)抑制耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性降低，表明miR-409-3p 在鼻咽癌的耐藥過(guò)程中可能發(fā)揮一定的作用。但是miR-409-3p 影響鼻咽癌紫杉醇耐藥性的機(jī)制尚不清楚。

為了進(jìn)一步研究miR-409-3p 的潛在靶點(diǎn)和其分子作用機(jī)制，本研究中通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了MTF2 是miR-409-3p 的直接功能靶點(diǎn)。SEKYERE 等[20]的研究表明，MTF2 在各種疾病患者的血清中存在，但是其生物學(xué)功能仍有待研究。MAGANTI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MTF2 可調(diào)節(jié)白血病化療的耐藥性。本研究中發(fā)現(xiàn)，MTF2 在鼻咽癌親本細(xì)胞CNE-1 和5-8F 中的表達(dá)水平明顯高于耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol；過(guò)表達(dá)耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中MTF2 的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞耐藥性降低。本研究中發(fā)現(xiàn)，MTF2 與miR-409-3p 在mRNA 及蛋白的表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明在鼻咽癌細(xì)胞中miR-409-3p 可能抑制MTF2 的表達(dá)，MTF2 是miR-409-3p 的潛在靶基因。

化療藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的重要機(jī)制之一[22]。腫瘤細(xì)胞耐藥的主要機(jī)制與跨膜蛋白的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)，這些蛋白質(zhì)可以直接降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度[23]。放化療主要是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)跨膜蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[24]。此外，MAGANTI 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MTF2 可調(diào)節(jié)p53 信號(hào)通路改變細(xì)胞生長(zhǎng)周期和凋亡水平而改變化療的敏感性，使白血病對(duì)誘導(dǎo)化療藥物敏感。為進(jìn)一步探索鼻咽癌紫杉醇耐藥與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，本研究中構(gòu)建了MTF2 過(guò)表達(dá)的耐藥細(xì)胞5-8F/Taxol，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)MTF2 后5-8F/Taxol 細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯提高，表明上調(diào)MTF2 表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-409-3p 靶向負(fù)調(diào)控MTF2 的表達(dá)，抑制此信號(hào)軸可以促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可作為逆轉(zhuǎn)鼻咽癌化療耐藥的靶分子，為鼻咽癌患者建立新的治療策略提供了前期理論基礎(chǔ)。