王嘉琳，高維強(qiáng), ，方煜翔

WANG Jialin1 ,GAO Weiqiang1,2,FANG Yuxiang1

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其世界范圍內(nèi)的發(fā)病率及死亡率分別位居第1 和第2位[1]；在中國，其發(fā)病率及死亡率分別位居第2和第5 位[2]，并且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。

近年來，由于治療方案的改進(jìn)，如輔助化療的推行，乳腺癌死亡率有所下降，但具有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的晚期乳腺癌仍被認(rèn)為是使用目前已知的治療方法所難以治愈的[3]。因此，探索針對乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移能力的有效治療靶點對于疾病的診治具有重要的意義。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種長度約為19～24 個核苷酸的非編碼RNA，其通過與靶基因mRNA 的3’-端非翻譯區(qū)（3’-untranslated regions，3’-UTR）進(jìn)行完全或者不完全匹配在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的表達(dá)。已有的研究表明，在腫瘤中miRNA 可以通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[4]、凋亡[5]、侵襲及轉(zhuǎn)移[6]，起到促進(jìn)或者抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。

目前為止，發(fā)生了他處器官轉(zhuǎn)移的晚期乳腺癌仍然缺乏有效治療方案。已有多項研究表明，miR-378a 在多種腫瘤（卵巢癌[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、黑素瘤[10]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[11]和前列腺癌[12]等）的發(fā)生與發(fā)展過程中，發(fā)揮著異質(zhì)性的調(diào)控作用。YIN 等[13]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者組織樣本中miR-24 和miR-378 均呈過表達(dá)，提示miR-378 可能對于乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展同樣具有一定的調(diào)控作用；EICHNER 等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-378-5p 在小鼠乳腺和人類乳腺癌細(xì)胞中能誘導(dǎo)“Warburg 效應(yīng)”，指出miR-378-5p 表達(dá)與人類乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)。但在中國乳腺癌患者中miR-378a-3p 表達(dá)量與乳腺癌進(jìn)展和預(yù)后等相關(guān)性鮮少有報道，因此探究miR-378a-3p 與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性，以及分子機(jī)制對于治療中國乳腺癌患者具有重要的臨床意義。

本研究中首先構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)miR-378a-3p 或拮抗miR-378a-3p 表達(dá)的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231 細(xì)胞亞克?。浑S后觀察miR-378a-3p 表達(dá)量改變，對乳腺癌細(xì)胞增殖、抗凋亡及遷移能力的影響，并初步探究miR-378a-3p發(fā)揮促癌作用可能的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 從公共數(shù)據(jù)庫中獲取乳腺癌基因表達(dá)情況進(jìn)行分析

通過使用在線軟件Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot.com）獲取GEO（Gene Expression Omnibus）（GSE19783）數(shù)據(jù)集（包括乳腺癌病例93例），利用Kaplan-Meier 法分析miR-378a 高表達(dá)（46例）和低表達(dá)組（47例）之間乳腺癌患者的生存情況并繪制生存曲線。使用在線軟件Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）分析在乳腺癌樣本中hsa-miR-378a-3p 與SUFU Hedgehog信號通路負(fù)調(diào)控子（SUFU negative regulator of Hedgehog signaling，SUFU）基因表達(dá)量的關(guān)系。

1.2 試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Life Technologies 公司，TaqmanTMMiR Assay 試劑盒、RIPA Lysis and Extraction Buffer、PierceTMBCA Protein Assay試劑盒以及TRIzolTMReagent 試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR SYBRGreen 試劑及Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。CCK-8 試劑盒購自大連美侖生物科技有限公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司。兔抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自美國Abclonal Technology 公司，兔抗人SUFU 多克隆抗體購自英國Abcam 公司，鼠抗人GLI 家族鋅指1（GLI family zinc finger 1，GLI1）單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology 公司，鼠抗人PTCH1 單克隆抗體購自美國GeneTex 公司；PVDF 膜以及電化學(xué)發(fā)光液購自美國Millipore 公司。限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ和NheⅠ購自美國New England Biolabs 公司。miR-378a-3p-模擬物（miR-378a-3p-mimics）和陰性對照（negative control，NC）-mimics，miR-378a-3p-抑制子（miR-378a-3pinhibitor）和NC-inhibitor 以及相應(yīng)的重組慢病毒均購自吉滿生物科技（上海）有限公司；miR-378a-3p-mimics 和NC-mimics 的序列分別為5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’和5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，miR-378a-3p-inhibitor 和NC-inhibitor 的序列分別 為5’-CCUUCUGACUCCAAGUCCAGU-3’和5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。轉(zhuǎn)染試劑 LipofectAMINE 3000 購自美國Invitrogen 公司，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega 公司，凋亡以及周期檢測試劑購自翊圣生物科技（上海）有限公司，核質(zhì)分離試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。雙熒光素酶報告系統(tǒng)載體phEW-luc 由本實驗室前期構(gòu)建完成[15]，載體雙酶切位點為EcoR Ⅴ和NheⅠ。Hedgehog 通路抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine）購自美國Selleck 公司[溶于乙醇溶液配制成儲存液（濃度為5 mmol/L），工作液濃度為20 μmol/L]，Hedgehog 通路激活劑SAG（Smoothened Agonist）-HCl 購自美國Selleck公司[ 溶于DMSO 配制成儲存液（濃度為10 mmol/L，工作液濃度為250 nmol/L）]。miR-378a-3p 的上游引物序列為5’-ACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC-3’，下游引物序列為5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA-3’；以人U6 基因為內(nèi)參照，U6 基因的上游引物序列為5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-378a-3p 以及U6 基因的引物購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。SUFU基因的上游引物序列 為5’-CACGCCATCTACGGAGAGTG-3’，下游引物序列為5’-GTACTTGACGATAGCGGTAACC-3’；以GAPDH基因內(nèi)參照，GAPDH基因上游引物序列為5’-GGAAAGGAGGCACAAAGAAGC-3’，下游引物序列為5’-CCCCTTAGGCACTAGGAGC-3’；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

實時熒光定量PCR 儀為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀（FACSAria Ⅱ）為美國BD 公司產(chǎn)品；ChemiDocTM成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀Synergy HT 為美國BioTek 儀器有限公司產(chǎn)品；TS100倒置光學(xué)顯微鏡為日本Nikon 公司產(chǎn)品；雙熒光素酶報告基因檢測儀Junior LB 9509 為德國Berthold 公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞及其培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231、BT549、SKBR3、T47D、MDA-MB-453、MCF-7 細(xì)胞和正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，以及人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T 均購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

所有細(xì)胞均用含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的具有飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；待細(xì)胞密度達(dá)到90%時按照細(xì)胞與培養(yǎng)液的體積比為1 ∶（2～4）進(jìn)行常規(guī)傳代，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)功能實驗。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測乳腺癌細(xì)胞中miR-378a-3p 的表達(dá)水平

收集乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、BT549、SK-BR3、T47D、MDA-MB-453 和MCF-7 以及乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，使用TaqMan MiR Assay 試劑盒將得到的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以此cDNA 為模板；加 入Premix ExTaqTM（Probe qPCR）試劑以及引物（miR-378a-3p 和內(nèi)參照U6）進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增；以2－ΔΔCt方法分析細(xì)胞內(nèi)源性miR-378a-3p 的相對表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系包括Premix Ex Taq 試劑10 μL、cDNA 模板 2 μL、miR-378a-3p 和U6 引物1 μL 以及無核酶的雙蒸水7 μL。PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)。

1.5 miR-378a-3p 過表達(dá)或抑制表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的構(gòu)建

MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞分別以1.5×105個的細(xì)胞數(shù)接種在6 孔板中，培養(yǎng)液中加入相關(guān)的慢病毒[感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）＝10] 和10 μg/mL 的聚凝胺（polybrene）。在MCF-7 細(xì)胞中感染攜帶有miR-378a-3p-mimics 的重組慢病毒以及陰性對照NCmimics 重組慢病毒；在MDA-MB-231 細(xì)胞中感染攜帶有miR-378a-3p-inhibitor 的重組慢病毒以及陰性對照NC-inhibitor 重組慢病毒。病毒感染后24 h，將培養(yǎng)上清液替換為含10% FBS 的新鮮培養(yǎng)液，隨后分別采用實時熒光定量PCR 檢測miR-378a-3p 的表達(dá)水平。

1.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 及其對照組細(xì)胞，抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 及其對照組細(xì)胞）分別接種于96 孔板中（2 000 個/孔），并設(shè)置只加培養(yǎng)液不接種細(xì)胞的空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別在細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 和120 h 時加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm 處檢測各孔的D值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 FCM 法檢測細(xì)胞的凋亡率

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞（分組同1.6節(jié)），以1×106個細(xì)胞的密度接種在6 孔板中，隔天待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后消化細(xì)胞并使用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次。加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC-Annexin Ⅴ和5 μL碘化丙錠（propidium iodide，PI），室溫下避光染色15 min。最后，在每個離心管中加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況，利用FlowJo10 軟件分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.8 Transwell 小室法檢測細(xì)胞的遷移能力

收集處于對數(shù)生長期的抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞。將Transwell 小室置于24 孔培養(yǎng)板中，上層小室中接種150 μL 無血清細(xì)胞懸液（含5×104個細(xì)胞），下室加入500 μL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液；將小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，用棉簽輕輕拭去微孔膜上未穿過小室膜的細(xì)胞；室溫條件下用4%多聚甲醛溶液處理細(xì)胞15 min，PBS 洗滌3 次；隨后用結(jié)晶紫染色液室溫染色15 min，在光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并計數(shù)穿過Transwell 小室膜的細(xì)胞數(shù)。

1.9 miR-378a-3p 靶基因雙熒光素酶報告基因檢測

使用在線軟件TargetScan（htp:/www.targetscan.org）以及Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）檢索人miR-378a-3p 的潛在靶基因。收集miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR 法檢測和SUFU mRNA 的表達(dá)水平。細(xì)胞處理及實時熒光定量PCR 法檢測流程同1.4 節(jié)。

采用SnapGene 軟件與相關(guān)序列（SUFU mRNA 3’-UTR 的序列）進(jìn)行比對，預(yù)測針對SUFU基因的2 個結(jié)合位點，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成SUFU基因-野生型（wild type，WT）以及突變型（mutant type，MUT）片段。WT 片段包括2 個miR-378a-3p的結(jié)合位點T1 和T2，MUT 片段即對SUFU mRNA 的3’-UTR WT 與miR-378a-3p 的結(jié)合位點進(jìn)行突變，分別命名為SUFU-WT1、SUFUWT2、SUFU-MUT1 和SUFU-MUT2。將合成的產(chǎn)物克隆到雙熒光素酶報告系統(tǒng)載體上，分別命名為SUFU-T1WT、SUFU-T1MUT、SUFUT2WT 和SUFU-T2MUT。

采 用LipofectAMINE 3000 將miR-378a-3p-mimics、NC-mimics、SUFU-T1WT、SUFUT1MUT、SUFU-T2WT 和SUFU-T2MUT 經(jīng)組合分別轉(zhuǎn)入HEK-293T 細(xì)胞，行雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測。具體流程：在24 孔板中接種HEK-293T 細(xì)胞（5×104個/孔），待細(xì)胞完全貼壁后，取miR-378a-3p-mimics 和NC-mimics 各80 ng，Renilla質(zhì)粒20 ng以及SUFU-T1WT、SUFUT1MUT、SUFU-T2WT、SUFU-T2MUT 質(zhì)粒 各200 ng，分別與1 μL LipofectAMINE 3000TM和100 μL Opti-MEM 培養(yǎng)液混均 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分組如下：SUFU-T1WT組（miR-378a-3p-mimics ＋Renilla ＋SUFU-T1WT）、SUFU-T1MUT組（NC-mimics ＋Renilla ＋SUFU-T1MUT）、SUFU-T2WT組（miR-378a-3p-mimics ＋Renilla ＋SUFU-T2WT）和SUFU-T2MUT（NC-mimics ＋Renilla+SUFUT2MUT）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的合適濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用PBS 清洗細(xì)胞2 次，再每孔加入100 μL Passive Lysis Buffer（PLB）置于室溫?fù)u床上裂解細(xì)胞15 min，裂解完成后在試管中加入熒光素酶檢測試劑Luciferase Assay Reagent Ⅱ（LAR Ⅱ）100 μL，再加入裂解液20 μL，吹打5～10 次后，放入雙熒光素酶報告基因檢測儀器內(nèi)產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop &Glo?試劑100 μL，輕柔混勻后，進(jìn)行第2 次測量，定量海腎熒光強(qiáng)度。

1.10 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）法檢測靶基因與下游目標(biāo)分子的相互作用

收集處于對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞（miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 及其對照組細(xì)胞，抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 及其對照組細(xì)胞），每組細(xì)胞數(shù)為1×107個。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2 次，隨后加入1 mL 預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞；收集細(xì)胞裂解液，14 000×g離心15 min，提取上清液。取100 μL 細(xì)胞裂解液作為Input（lysate）以備蛋白質(zhì)印跡法檢測，另取800 μL 上清液加入1 μg相應(yīng)的抗體，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜；次日每組樣品取20 μL protein A/G 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次5 000×g離心3 min；然后將預(yù)處理后的20 μL protein A/G 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與proteinA/G 瓊脂糖珠耦連；免疫沉淀反應(yīng)之后，在4 ℃ 5 000×g離心3 min，除去上清液收集瓊脂糖珠，用4 ℃預(yù)冷的1 mL 裂解緩沖液沖洗瓊脂糖珠3～4 次；離心后吸去上清液，沉淀中加入20 μL 的2×SDS 上樣緩沖液，置于100 ℃水浴中處理10 min 后即可進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.11 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的抽提

收集處于對數(shù)生長期的抑制miR-378a-3p表達(dá)的MDA-MB-231 及其對照組細(xì)胞（1×107個），將消化后的細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中，4 ℃ 500×g離心10 min，除去培養(yǎng)液，再向離心管中加入10 mL 預(yù)冷的1×PBS 緩沖液，4 ℃ 500×g離心5 min（重復(fù)2 次）；最后4 ℃1 000×g離心3 min 收集細(xì)胞，用移液槍盡可能吸去上清液；向體積為20 μL 的緊實細(xì)胞中加入200 μL 預(yù)冷的Buffer A（使用前每 1 mL Buffer A 中加入1 μL DTT，10 μL PMSF 和1 μL 蛋白酶抑制劑），渦旋劇烈振蕩15 s，冰上靜置10～15 min；加 入11 μL 預(yù)冷的Buffer B，渦旋劇烈振蕩5 s，冰上靜置15 s，再次渦旋劇烈振蕩5 s；隨后4 ℃ 14 000×g離心5 min，抽取上清液，即為抽提獲得的細(xì)胞質(zhì)蛋白，可長期保存于－80 ℃冰箱。用槍頭伸入到離心管的底部，將最下層的液體吸出并丟棄，在白色細(xì)胞核沉淀物（細(xì)胞核）中加入100 μL預(yù)冷的Buffer C（使用前向每1 mL Buffer C 中加入1 μL DTT，10 μL PMSF 和1 μL 蛋白酶抑制劑），渦旋劇烈振蕩10 s，置于搖床上冰浴處理40 min，150 次/min，再次振蕩30 s，將混懸液于4 ℃ 14 000×g離心5 min，提取上清液即為細(xì)胞核蛋白，樣品可保存于－80 ℃冰箱保存。

1.12 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平

用適量添加蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液加入已用預(yù)冷PBS 洗滌的培養(yǎng)皿中，將裂解后的細(xì)胞收集于1.5 mL EP 管中，置于冰上30 min，4 ℃ 14 000×g離心10 min，吸取上清液此即為細(xì)胞總蛋白。使用PierceTMBCA Protein Assay 試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白大小，行10% SDS-PAGE 分離蛋白（70～120 V的恒壓條件下電泳90 min），隨后在250 mA 的恒定電流（90 min）下將分離后的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用含5% 脫脂牛奶的封閉液室溫封閉PVDF 膜1 h 以上，然后加入適量兔抗人SUFU 多克隆抗體（體積稀釋比例為 1 ∶1 000）、鼠抗人GLI1 單克隆抗體（體積稀釋比例為 1 ∶1 000）和兔抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（體積稀釋比例為 1 ∶2 000），以覆蓋PVDF 膜即可，4 ℃反應(yīng)過夜；次日用TBST洗膜3 次，5 min/次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為 1 ∶5 000）或山羊抗鼠IgG（體積稀釋比例為 1 ∶5 000），室溫條件下反應(yīng)1 h；再用TBST 洗膜3 次，5 min/次，用電化學(xué)發(fā)光劑處理后再用顯影液顯色，用化學(xué)發(fā)光儀成像記錄實驗結(jié)果。

1.13 評估Hedgehog 通路抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine）以及激活劑SAG（Smoothened Agonist）對乳腺細(xì)胞增殖、遷移、抗凋亡能力的影響

將miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 細(xì)胞以及對照組MCF-7 細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d 后加入Hedgehog 通路抑制劑環(huán)巴胺（終濃度20 μmol/L），以加入相同體積的溶劑乙醇溶液為對照，繼續(xù)培養(yǎng)3 d（總培養(yǎng)時間為6 d）；再用CCK-8 法（實驗流程同1.6 節(jié)）以及FCM 法（實驗流程同1.7 節(jié)）檢測細(xì)胞3 d 以及6 d 后的體外增殖能力以及抗凋亡能力。

將抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231及其對照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d 后加入Hedgehog 通路激活劑SAG（終濃度250 nmol/L），以加入相同體積的溶劑DMSO 為對照，再用CCK-8 法（實驗流程同1.6 節(jié)）以及Transwell小室法（實驗流程同1.8 節(jié)）分析細(xì)胞3 d 以及6 d 時的體外增殖能力以及遷移能力。

1.14 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPadPrism 7 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各實驗均獨立重復(fù)3次，計量資料結(jié)果數(shù)據(jù)以± s表示，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩獨立樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗，生存曲線分析采用Kaplan-Meier 法，并使用log-rank 檢驗進(jìn)行比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-378a-3p 表達(dá)與乳腺癌患者生存期相關(guān)且在乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)

首先利用在線軟件the Kaplan-Meier plotter 將GEO 數(shù)據(jù)集GSE19783 中人乳腺癌臨床樣本分為miR-378a-3p 高表達(dá)組（46例）和低表達(dá)組（47例），用于繪制生存曲線。結(jié)果顯示（圖1A），miR-378a-3p 高表達(dá)的乳腺癌患者總生存時間明顯短于miR-378a 低表達(dá)的患者（P＝0.003 5）。這一結(jié)果提示，miR-378a對于乳腺癌具有一定的促癌作用。

為驗證GEO 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，進(jìn)一步在6 株乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、BT549、SKBR3、T47D、MDA-MB-453、MCF-7 和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A 中檢測了內(nèi)源miR-378a-3p 的表達(dá)量。實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果（圖1B）顯示，乳腺癌細(xì)胞系中miR-378a-3p 的表達(dá)量均明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞（P值均＜0.001）。

根據(jù)這一結(jié)果，在后續(xù)實驗中選取內(nèi)源miR-378a-3p 表達(dá)水平最低的乳腺癌MCF-7 細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)miR-378a-3p 的亞克??；選取內(nèi)源miR-378a-3p 表達(dá)水平最高的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞構(gòu)建拮抗miRNA 的亞克隆。進(jìn)一步用于體外考察miRNA-378a-3p 對乳腺癌細(xì)胞增殖、抗凋亡及遷移的調(diào)控作用。

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，miR-378a-3p-mimics 能明顯上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-378a-3p 的表達(dá)水平（P＜0.001，圖1C），miR-378a-3p-inhibitor 能明顯抑制MDA-MB-231 細(xì)胞中miR-378a-3p 的表達(dá)水平（P＜0.001，圖1D）。

Fig.1 The correlation between microRNA (miR)-378a-3p expression and prognosis of breast cancer patients was analyzed by Kaplan-Meier method [date from Gene Expression Omnibus (GEO) database](A),the expression levels of miR-378a-3p in different breast cancer cells (MDA-MB-231,BT549,SK-BR3,T47D,MDA-MB-453 and MCF-7 cells) and normal breast epithelial cell MCF-10A (as the control) were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (B),and the expression levels of miR-378a-3p in breast cancer MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-mimics (C) and MDAMB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-inhibitor (D) were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.***P<0.001,****P<0.000 1 (n=3).圖1 利用GEO 數(shù)據(jù)庫分析miR-378a-3p 表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，以及實時熒光定量PCR 檢測miR-378a-3p 在不同的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)或抑制miR-378a-3p 表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響

采用CCK-8 法檢測過表達(dá)miR-378a-3p 對MCF-7 細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果（圖2A）顯示，過表達(dá)miR-378a-3p 后，MCF-7 細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)（P＜0.000 1）；細(xì)胞培養(yǎng)3～5 d 時與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（第3 天時P＝0.037 3；第4 天時P＝0.000 1；第5 天時P＜0.000 1）。

同時，采用CCK-8 法檢測抑制miR-378a-3p 表達(dá)對MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果（圖2B）顯示，抑制miR-378a-3p表達(dá)后MDA-MB-231 細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.000 1），第2 天～第5 天時與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.000 1）。

2.3 過表達(dá)miR-378a-3p 可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的抗凋亡

采用FCM 法檢測過表達(dá)miR-378a-3p 對MCF-7 細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果（圖3A）顯示，過表達(dá)miR-378a-3p 后，MCF-7 細(xì)胞的凋亡率由對照組的（4.60±0.37）%下降到（2.70±0.14）%；與對照組相比，MCF-7 細(xì)胞的凋亡率明顯降低（P＜0.01）。這一結(jié)果提示，在MCF-7 細(xì)胞中過表達(dá)miR-378a-3p 能抑制其抗凋亡能力。

同時，采用FCM 法檢測抑制miR-378a-3p表達(dá)對MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果（圖3B）顯示，miR-378a-3p-inhibitor組MDAMB-231 細(xì)胞的凋亡率為（2.01±0.08）%，對照組MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡率為（1.24±0.20）%；與對照相比，抑制miR-378a-3p 表達(dá)后MDAMB-231 細(xì)胞的凋亡率明顯上升（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，在MDA-MB-231 細(xì)胞中拮抗miR-378a-3p 表達(dá)能增強(qiáng)其抗凋亡能力。

Fig.2 The proliferation abilities of breast cancer MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying microRNA (miR)-378a-3p-mimics (miR-378a-3p overexpression) (A) and MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-inhibitor (silencing miR-378a-3p expression)(B) were detected by CCK-8 assay.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1,vs the controls (n=3).圖2 CCK-8 法檢測過表達(dá)miR-378a-3p 或抑制miR-378a-3p 表達(dá)對乳腺癌MCF-7 細(xì)胞（A）和MDAMB-231 細(xì)胞（B）增殖能力的影響

Fig.3 The apoptosis rates of breast cancer MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying microRNA (miR)-378a-3p-mimics (miR-378a-3p overexpression) (A) and MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-inhibitor (silencing miR-378a-3p expression) (B) were detected by FCM.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.*P<0.05,**P<0.01 (n=3).圖3 FCM 法檢測上調(diào)或抑制miR-378a-3p 表達(dá)對乳腺癌MCF-7（A）和MDA-MB-231 細(xì)胞（B）凋亡率的影響

2.4 抑制miR-378a-3p 表達(dá)可抑制乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的遷移能力

采用Transwell 小室實驗檢測拮抗miR-378a-3p 表達(dá)水平對對MDA-MB-231 細(xì)胞體外遷移能力的影響。結(jié)果（圖4）顯示，在MDAMB-231 細(xì)胞中抑制miR-378a-3p 表達(dá)后能明顯減弱細(xì)胞遷移能力。與對照組相比，抑制miR-378a-3p 表達(dá)后，發(fā)生體外遷移的腫瘤細(xì)胞數(shù)量從（1 061.00± 64.79）個減少至（261.00±53.82）個（P＜0.001）。

2.5 乳腺癌細(xì)胞中miR-378a-3p 高表達(dá)抑制靶基因SUFU 表達(dá)

通過生物信息學(xué)分析（在線軟件TargetScan以及Starbase）篩選hsa-miR-378a-3p 的潛在靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人SUFU mRNA 的3’-UTR 中含有2 個miR-378a-3p的識別結(jié)合位點（圖5A）。

在此基礎(chǔ)上，采用實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測miR-378a-3p 過表達(dá)MCF-7細(xì)胞中SUFU mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果（圖5B）顯示，MCF-7 細(xì)胞中過表達(dá)miR-378a-3p 后，SUFU mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01)。以上結(jié)果提示，在乳腺癌細(xì)胞中SUFU基因可能受到miR-378a-3p 的靶向調(diào)控。

進(jìn)一步通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分別對SUFU mRNA 3’-UTR 上的2 個預(yù)測結(jié)合位點進(jìn)行驗證。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果（圖5C）顯示，miR-378a-3p 主要與SUFU mRNA 3’-UTR 中的T1 結(jié)合位點結(jié)合，在MCF-7 細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染了內(nèi)參Renilla luciferase 報告質(zhì)粒的前提下，同時轉(zhuǎn)染miR-378a-3p-mimics 與SUFUT1WT 質(zhì)粒（包含SUFU mRNA 3’-UTR 中的第一個結(jié)合位點的野生型序列）時其雙熒光素酶報告系統(tǒng)比值（R1/R2）明顯減低（P＜0.000 1），同時轉(zhuǎn)染miR-378a-3p-mimics 與包含該位點突變型序列的SUFU-T1MUT 質(zhì)粒時R1/R2 均未出現(xiàn)明顯降低（P＝0.284 3）。此外對于預(yù)測的第2 個結(jié)合位點，miR-378a-3p-mimics 無論與包含該位點野生型序列的SUFU-T2WT 質(zhì)粒（P＝0.200 2）或突變型序列的SUFU-T2MUT 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染雙熒光素酶報告系統(tǒng)比值（R1/R2），差異均未有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.4700）。

另外，通過在線軟件Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）對1 085例乳腺癌樣本分析后發(fā)現(xiàn)（圖5D），SUFU mRNA 的表達(dá)水平與miR-378a-3p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＝1.02×10－4）[16]。上述結(jié)果均提示，miR-378a-3p 可以在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控SUFU基因的表達(dá)。

2.6 miR-378a-3p 通過影響SUFU 與GLI1 結(jié)合以及影響GLI1 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核激活Hedgehog 信號通路而發(fā)揮促癌作用

Fig.4 The migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying microRNA (miR)-378a-3p-inhibitor (silencing miR-378a-3p expression) was detected by Transwell assay (crystal violetstaining,×100).MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-inhibitor were taken as the control.***P<0.001 (n=3).圖4 Transwell 小室法檢測抑制miR-378a-3p 表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力的影響

Fig.5 SUFU was the target gene of microRNA (miR)-378a-3p in breast cancer cells.A:The potential binding sites of miR-378a-3p in SUFU mRNA 3’-untranslated region (3’-UTR) were analyzed by bioinformatics assay.B:The effects of miR-378a-3p overexpression on the expression levels of SUFU mRNA and protein in breast cancer MCF-7 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting,respectively.C:The dual luciferase reporter system was used to verify the binding of miR-378a-3p on binding sites of the SUFU mRNA 3’-UTR [****P<0.000 1 (n=3)].D:The expression of miR-378a-3p was negatively associated with SUFU expression in breast cancer cells by bioinformatics assay.NC:Negative control.圖5 在乳腺癌細(xì)胞中，SUFU 是miR-378a-3p 的靶基因

已有的研究表明，SUFU 是Hedgehog 信號通路的負(fù)調(diào)控子，可以通過與GLI1 相互作用阻止其轉(zhuǎn)入細(xì)胞核從而抑制GLI1 的功能[17]。而Hedgehog 信號通路是已知的在多種腫瘤中調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的一條重要的信號通路[18]。因此，結(jié)合上述實驗結(jié)果及相關(guān)研究報道，推測在乳腺癌中miR-378a-3p 可通過抑制SUFU 的表達(dá)間接促進(jìn)GLI1 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而激活Hedgehog信號通路，發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞體外增殖、抗凋亡和遷移的作用。

為了驗證這一推測，本研究中首先采用蛋白質(zhì)印跡法檢測了Hedgehog 信號通路中重要的組成分子GLI1 和PTCH1 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果（圖6A）顯示，miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 細(xì)胞中GLI1 和PTCH1 蛋白表達(dá)上調(diào)；這一結(jié)果提示，過表達(dá)miR-378a-3p 可激活Hedgehog 信號通路。

通過免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）進(jìn)一步驗證miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 及其對照組細(xì)胞，抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 及其對照組細(xì)胞中SUFU 與GLI1 蛋白的相互作用。CO-IP 法檢測結(jié)果（圖6B）顯示，過表達(dá)miR-378a-3p 的MCF-7 中通過抑制SUFU 表達(dá)削弱了SUFU 與GLI1 蛋白的結(jié)合，而拮抗miR-378a-3p 表達(dá)的MDAMB-231 細(xì)胞中SUFU 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，鞏固了SUFU 與GLI1 蛋白的結(jié)合，阻礙GLI1 蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。

Fig.6 The effects of microRNA (miR)-378a-3p on the interaction of SUFU negative regulator of hedgehog signaling (SUFU) and GLI family zinc finger 1 (GLI1) and the distribution of GLI1 in the nucleus and cytoplasm.A:The effects of miR-378a-3p overexpression on the expression levels of PTCH1 and GLI1 proteins in breast carcer MCF-7 cells were detected by Western blotting.B:The influence of miR-378a-3p on the interaction between SUFU and GLI1 in MCF-7 and MDAMB-231 cells was detected by co-immunoprecipitation (co-IP) assay.C:The distribution of SUFU and GLI1 proteins in the nucleus and cytoplasm of MDA-MB-231 cells after silencing miR-378a-3p expression was detected by Western blotting.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.圖6 miR-378a-3p 對SUFU 與GLI1 的結(jié)合以及GLI1 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中分布的影響

隨后選擇抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDAMB-231 細(xì)胞，分別提取細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步驗證GLI1 以及SUFU 蛋白定位的變化。檢測結(jié)果（圖6C）提示，抑制miR-378a-3p 表達(dá)后SUFU 的表達(dá)水平提高，從而使SUFU 與GLI1 蛋白的結(jié)合增強(qiáng)，導(dǎo)致GLI1 囤積在細(xì)胞質(zhì)中，使得細(xì)胞核中GLI1 蛋白的表達(dá)量明顯減少。上述結(jié)果提示了，抑制miR-378a-3p 表達(dá)具有一定的抑制Hedgehog 信號通路活性的作用。

2.7 miR-378a-3p 在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)通過激活Hedgehog 信號通路發(fā)揮促癌功能

上述研究提示，miR-378a-3p 過表達(dá)時乳腺癌細(xì)胞中Hedgehog 信號通路被激活。同時進(jìn)一步探討miR-378a-3p 表達(dá)水平的改變是否為通過改變Hedgehog 信號通路活性調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡和遷移能力。常規(guī)培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行CCK-8 檢測，結(jié)果顯示miR-378a-3p 過表達(dá)MCF-7 細(xì)胞的增殖能力明顯強(qiáng)于NC-mimics組（P＜0.000 1）；加 入cyclopamine（20 μmol/L）后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，再次用CCK-8 法檢測發(fā)現(xiàn)，無論是miR-378a-3p-mimics組還是NC-mimics組，與NC-mimics ＋乙醇組的MCF-7 細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖能力均明顯下降，提示抑制Hedgehog 信號通路活性可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖；且miR-378a-3p-mimics ＋cyclopamine組MCF-7細(xì)胞與NC-mimics ＋乙醇組的增殖能力相當(dāng)（P＝0.223 6）（圖7A）。這一結(jié)果提示了，過表達(dá)miR-378a-3p 對腫瘤細(xì)胞的促增殖作用可通過抑制其下游的Hedgehog 信號通路活性予以抵消，也暗示了過表達(dá)miR-378a-3p 可能是通過調(diào)控下游的Hedgehog 信號通路發(fā)揮促腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

Fig.7 The cell viabilities of MCF-7 cells with microRNA (miR)-378a-3p overexpression after treatment with Hedgehog signaling pathway inhibitor cyclopamine (20 μmol/L) (A) and MDA-MB-231 cells with miR-378a-3p down-regulation after treatment with Hedgehog signaling pathway activator (SAG:250 μmol/L) (B) were detected by CCK-8 method.****P<0.000 1 (n=3).NC:Negative control.圖7 CCK-8 法檢測miR-378a-3p 過表達(dá)的MCF-7 細(xì)胞經(jīng)Hedgehog 信號通路抑制劑cyclopamine（20 μmol/L）處理后（A）其細(xì)胞活力的變化，以及抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)Hedgehog 信號通路激動劑SAG（250 mol/L）處理后（B）其細(xì)胞活力的變化

為了進(jìn)一步驗證這一推論，本研究中將抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-453 細(xì)胞使用CCK-8 法在上述實驗相同的時間點進(jìn)行檢測，同樣獲得了類似的結(jié)果，即無論是否拮抗miR-378a-3p 的表達(dá)水平，Hedgehog 通路激活劑SAG 均可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖（P＜0.00 0 1），而加入SAG處理3 d 后miR-378a-3p-inhibitor組MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖能力與加入溶劑DMSO 的NC-inhibitor組MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力持平（P＝0.902 9）（圖7B）。上述結(jié)果均提示了，miR-378a-3p 可以通過調(diào)控下游的Hedgehog 信號通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖。

此外，本研究中同樣考察了miR-378a-3p 表達(dá)改變能否通過Hedgehog 信號通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的抗凋亡能力。結(jié)果（圖8）顯示，無論是否過表達(dá)miR-378a-3p，加入cyclopamine 后發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯增加。同時，細(xì)胞培養(yǎng)3 d再加入cyclopamine 后，其發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量與NC-mimics ＋乙醇組發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量接近（P＝0.329 1），提示了通過過表達(dá)miR-378a-3p產(chǎn)生的抗凋亡作用在抑制了Hedgehog 信號通路后被削弱了，說明過表達(dá)miR-378a-3p 可通過激活miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信號通路發(fā)揮抗凋亡的作用。

同樣地，通過Transwell 小室實驗檢測在抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞中加入Hedgehog 通路激活劑SAG 后能否恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的體外遷移能力。結(jié)果（圖9）顯示，無論是否抑制miR-378a-3p 表達(dá)，加入SAG 后發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯著增加（P＜0.05）。類似地，在第3 天時miR-378a-3p-inhibitor ＋SAG組細(xì)胞發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量與NC-inhibitor ＋DMSO組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.521 7）。下調(diào)miR-378a-3p 表達(dá)后可通過抑制miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信號通路的活性抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

以上這些實驗結(jié)果均表明miR-378a-3p 在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)可通過激活miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡及遷移，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。

Fig.8 The apoptosis rate of MCF-7 cells with microRNA (miR)-378a-3p overexpression after treatment with Hedgehog signaling pathway inhibitor cyclopamine (20 μmol/L) was detected by FCM.*P<0.05,***P<0.00 1,****P<0.000 1 (n=3).NC:Negative control.圖8 FCM 檢測miR-378a-3p 過表達(dá)MCF-7 細(xì)胞經(jīng)Hedgehog 信號通路抑制劑cyclopamine（20 μmol/L）處理后對其凋亡率的影響

Fig.9 The cell migration ability of MDA-MB-231 cells with microRNA (miR)-378a-3p downregulation after treatment with Hedgehog signaling pathway activator (SAG:250 nmol/L)was detected by Transwell assay (crystal violetstaining,×100).*P<0.05,**P<0.01 (n=3).NC:Negative control.圖9 Transwell 小室實驗檢測抑制miR-378a-3p 表達(dá)的MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)Hedgehog 信號通路激動劑SAG（250 μmol/L）處理后其細(xì)胞遷移能力的變化

3 討論

遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移是晚期乳腺癌高致死率的重要原因之一[3]。已有的研究表明，miR 可以通過調(diào)控多種腫瘤增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路，如Hedgehog 信號通路、Wnt 信號通路等發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長轉(zhuǎn)移的作用[19]。已有的報道顯示，miR-378 家族在臨床乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并提示其可能與腫瘤的發(fā)展相關(guān)[13]。本課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-378 可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖和遷移[20]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-378 家族成員之一的miR-378a-3p 表達(dá)量在乳腺癌細(xì)胞系中均顯著增加。miR-378a-3p 高表達(dá)的乳腺癌患者生存率明顯低于低表達(dá)患者，提示了miR-378a-3p 可能在乳腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮一定的促癌作用。通過相關(guān)的體外細(xì)胞學(xué)實驗及分子機(jī)制探究，發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p 高表達(dá)可通過miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡和遷移能力的增強(qiáng)。

本研究中篩選并鑒定發(fā)現(xiàn)，SUFU基因是miR-378a-3p 得以在乳腺癌中發(fā)揮促癌作用的直接下游靶標(biāo)。miR-378a-3p 通過與SUFU mRNA 3’-UTR 區(qū)域結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制其表達(dá)。與本研究發(fā)現(xiàn)一致，SUFU已在多種腫瘤中被報道是一種抑癌基因[21]。例如PENG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，SUFU基因在臨床胃癌組織樣本和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌作用；MIA 等[23]發(fā)現(xiàn)，SUFU基因同樣在膀胱癌中發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果提示，SUFU作為miR-378a-3p 重要靶基因，可以成為乳腺癌治療中的一個潛在的治療靶點。

已有的研究表明，Hedgehog 信號通路及其上游調(diào)控因子的失調(diào)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控機(jī)制[24]，SUFU 作為Hedgehog 信號通路中重要組成分子，為轉(zhuǎn)錄因子GLI 的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對Hedgehog 信號通路起負(fù)調(diào)控作用[25]。SUFU 通過與GLI1/2 蛋白結(jié)合阻止其激活以及向細(xì)胞核中定位[26]。已有的報道顯示，鋰可通過抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）阻止SUFU/GLI1 復(fù)合物解離，以此阻止GLI1 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運[17]，導(dǎo)致Hedgehog信號通路的失調(diào)，誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生。在本研究中同樣證實，miR-378a-3p 高表達(dá)可通過抑制SUFU 表達(dá)削弱SUFU 與GLI1 的結(jié)合，從而將GLI1 從該復(fù)合物中釋放出來，以此加強(qiáng)了GLI1 在細(xì)胞核內(nèi)的定位。另一方面，在乳腺癌細(xì)胞系中通過外源過表達(dá)miR-378a-3p 獲得的促進(jìn)增殖、遷移及抗凋亡的表型在阻斷Hedgehog信號通路后可削弱相應(yīng)表型。反之亦然，外源拮抗miR-378a-3p 的表達(dá)水平帶來的抑癌效果可通過激活Hedgehog 信號通路予以抵消。這些數(shù)據(jù)表明，高表達(dá)的miR-378a-3p 通過負(fù)調(diào)控SUFU激活Hedgehog 信號通路發(fā)揮促癌作用。因此，本研究結(jié)果提示通過拮抗miR-378a-3p 的表達(dá)水平，聯(lián)合Hedgehog 信號通路抑制劑或可成為一種全新的乳腺癌輔助治療策略。

綜上所述，本研究結(jié)果證明了miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信號通路軸促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的生長、抗凋亡和侵襲且在臨床上與不良預(yù)后有關(guān)。因此，靶向miR-378a-3p 通過降低其表達(dá)量或封閉其功能以此抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲對于治療晚期乳腺癌患者，可能是一種行之有效的輔助療法。