曹 園，陳楓文，胡 楊，廉 凱，張熙明

（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院襄陽(yáng)市中心醫(yī)院骨科，襄陽(yáng) 441021）

骨骼在運(yùn)動(dòng)、支持器官、維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和結(jié)構(gòu)堅(jiān)固性方面發(fā)揮著重要作用。代謝紊亂、創(chuàng)傷、腫瘤切除、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病均可造成骨萎縮、骨再生延遲等骨缺損[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，骨折的終生患病率為50%。雖然大多數(shù)骨損傷能夠正常愈合，但仍有10%～15%的骨折患者會(huì)出現(xiàn)愈合不良的并發(fā)癥，如延遲愈合或不愈合[2]。因此，繼續(xù)探索促進(jìn)骨折愈合的有效策略具有重要意義。地黃是東亞地區(qū)的一種傳統(tǒng)中草藥，已被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥，但其活性成分和作用機(jī)制尚不完全清楚[3]。梓醇是地黃的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗缺血等多種生物學(xué)活性[4]。然而，梓醇對(duì)骨折愈合的影響尚待闡明。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，在促進(jìn)和加速骨再生方面具有巨大潛力[5]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）是骨形成最重要的調(diào)節(jié)因子之一，自人體胚胎發(fā)育開(kāi)始參與骨骼發(fā)育和骨缺損修復(fù)，在脂肪、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[6]。已有研究表明，BMP-2通過(guò)激活人無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族（Wingless-Type MMTV Integration Site Family，Wnt）信號(hào)通路，使β-連鎖蛋白（β-catenin）信號(hào)通路積聚，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，修復(fù)骨缺損[7]。本研究旨在探究梓醇對(duì)大鼠股骨骨折愈合的影響及其作用機(jī)制是否與調(diào)控BMP-2 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)，以期為制定新的促進(jìn)骨折愈合的有效策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

梓醇（純度≥98%）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；BMP-2干擾慢病毒液（sh-BMP-2）和陰性對(duì)照慢病毒液（sh-NC）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol 試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 購(gòu)自美國(guó)Bimake ；BMP-2、Runx2 和Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam；β-catenin 和GAPDH 抗體購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司；cyclinD1 和c-myc抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology ；堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒和BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；骨鈣素（OCN）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48 只清潔級(jí)雄性SD 大鼠，6～7 周齡，體質(zhì)量（230±20）g，購(gòu)自湖北奧菲生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（鄂）2019—0024。所有大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房。環(huán)境溫度20～24 ℃、濕度60%～70%、晝夜12 h/12 h 飼養(yǎng)，提供充足的飲水和飼料。待所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，進(jìn)行造模。本研究經(jīng)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠股骨骨折模型的建立及給藥處理

待所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，參考文獻(xiàn)[8]建立大鼠股骨骨折模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，隨后將大鼠固定。暴露大鼠股骨中段，用線鋸將股骨中段鋸斷，造成橫行骨折。用直徑為1.5 mm的克氏針進(jìn)行髓內(nèi)固定骨折斷端，生理鹽水反復(fù)沖洗切口后，逐層縫合切口。將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、梓醇組、梓醇+sh-NC 組和梓醇+sh-BMP-2 組，每組12 只。梓醇組大鼠灌胃50 mg/kg梓醇[9]，梓醇+sh-NC組大鼠灌胃50 mg/kg梓醇和尾靜脈注射300 μL sh-NC 慢病毒液，梓醇+sh-BMP-2 組大鼠灌胃50 mg/kg 梓醇和尾靜脈注射300 μL sh-BMP-2 慢病毒液，對(duì)照組大鼠灌胃等量溶劑，1次/d，連續(xù)給藥3周。

1.3.2 X線檢測(cè)

各組大鼠骨折0 周、2 周和3 周后，拍攝各組大鼠股骨正位X 線片。參考文獻(xiàn)[10]應(yīng)用Lane-Sandhu X 線評(píng)分評(píng)估各組大鼠骨折愈合情況。Lane-Sandhu X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括骨形成、骨連接、骨塑形3個(gè)方面。骨形成：無(wú)骨形成記0分；骨形成占骨缺損25%記1 分；骨形成占骨缺損50%記2 分；骨形成占骨缺損75%記3分；骨形成滿缺損記4分。骨連接：骨折線清楚記0分；骨折線部分存在記2分；骨折線消失記4分。骨塑形：未見(jiàn)骨塑形記0分；骨髓腔形成記2分；皮質(zhì)骨塑形記4分。

1.3.3 Micro-CT檢測(cè)

術(shù)后2 周和3 周，各組大鼠隨機(jī)取6 只大鼠，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，隨后處死大鼠，取患肢股骨標(biāo)本，去除周?chē)浗M織和髓內(nèi)克氏針。用微型CT 系統(tǒng)掃描股骨，定義骨折線上下5 mm 范圍區(qū)域建立三維興趣區(qū)，分別測(cè)量骨體積（bone volume，BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，TB.N）、骨小梁間距（trabecular bone spacing，TB.Sp）和骨小梁厚度（trabecular thickness，TB.Th）。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)BMP-2 mRNA表達(dá)

術(shù)后3 周，處死大鼠，取大鼠骨痂組織液氮凍存。取液氮凍存的各組大鼠骨痂組織，迅速研磨至粉末狀。加入Trizol 試劑，提取組織總RNA。微量分光光度計(jì)測(cè)定各樣品的RNA 濃度，立即將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA 為模板，根據(jù)2×SYBR Green qPCR Master Mix 說(shuō)明書(shū)所示進(jìn)行BMP-2 mRNA 表達(dá)的檢測(cè)。反應(yīng)程序：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃、15 s；60℃、60 s；95℃、15 s。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算BMP-2 mRNA 表達(dá)。其中，BMP-2 上游引物：5’-TCGAGAACAGATG CAGGAAG-3’，BMP-2 下游引物：5’-GGAATTTCGAGT TGGCTGTT-3’；GAPDH 上游引物：5’-TTGAACCAGGCGGCTGCGGA-3’，GAPDH 下游引物：5’-GGAGGCTGCG GGCTCAATTT-3’。

1.3.5 Western blotting 檢測(cè)BMP-2、Runx2、ColⅠ、β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白表達(dá)

取液氮凍存的各組大鼠骨痂組織，迅速研磨至粉末狀。加入RIPA 蛋白裂解液，冰上裂解組織30 min，離心取上清液。BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液的蛋白濃度。各樣品取30 μg蛋白置于SDS-PAGE 凝膠加樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳分離和轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入BMP-2（1∶1 000）、Runx2（1∶1 000）、ColⅠ（1∶1 000）、βcatenin（1∶1 000）、cyclinD1（1∶2 000）、c-myc（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體，4 ℃條件下孵育過(guò)夜。二抗（1∶5 000）室溫條件下孵育1 h。將ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑均勻滴至膜上，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度分析。

1.3.6 ELISA檢測(cè)血清中ALP和OCN水平

10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，分離患肢側(cè)股動(dòng)脈，切斷股動(dòng)脈后收集血液。血液室溫靜置10 min后，離心收集上清液（即血清）。根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)所示，檢測(cè)血清樣品中ALP和OCN水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨折愈合X線評(píng)分的比較

與對(duì)照組比較，梓醇組大鼠骨折2周和3周后X線評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC組大鼠骨折2周和3周后X線評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC 組比較，梓醇+sh-BMP-2組大鼠骨折2周和3周后X線評(píng)分顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠骨折愈合X線評(píng)分的比較

2.2 各組大鼠Micro-CT檢測(cè)指標(biāo)的比較

與對(duì)照組相比，梓醇組大鼠骨折3周后BV、BV/TV、TB.N 和TB.Th 顯著升高（P＜0.05），TB.Sp 無(wú)顯著差異（P＞0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC 組大鼠骨折3 周后BV、BV/TV、TB.N、TB.Sp 和TB.Th 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC 組相比，梓醇+sh-BMP-2組大鼠骨折3周后BV、BV/TV、TB.N和TB.Th 顯著降低（P＜0.05），TB.Sp 無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠Micro-CT檢測(cè)指標(biāo)的比較

2.3 各組大鼠BMP-2蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，梓醇組大鼠BMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC組大鼠BMP-2 mRNA 和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC 組相比，梓醇+sh-BMP-2 組大鼠BMP-2 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠BMP-2蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)和成骨相關(guān)基因蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，梓醇組大鼠ALP 和OCN 水平顯著升高（P＜0.05），Runx2 和ColⅠ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC 組大鼠ALP和OCN 水平、Runx2 和ColⅠ蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC組相比，梓醇+sh-BMP-2組大鼠ALP和OCN水平顯著降低（P＜0.05），Runx2和ColⅠ蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)和成骨相關(guān)基因蛋白表達(dá)的比較

2.5 各組大鼠Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，梓醇組大鼠β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC 組大鼠β-catenin、cyclinD1 和c-myc 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC組相比，梓醇+sh-BMP-2組大鼠β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

3 討論

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜、緩慢、長(zhǎng)期的病理過(guò)程，涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化和聚集，成骨細(xì)胞的分化和成熟，以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成和血管生成[11]。骨折愈合是受損組織的自我修復(fù)過(guò)程，但各種因素的干預(yù)可能會(huì)減緩愈合過(guò)程或?qū)е鹿遣贿B[12]。目前，關(guān)于梓醇對(duì)骨折的作用及其可能的作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果表明，梓醇通過(guò)上調(diào)BMP-2表達(dá)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在大鼠股骨骨折愈合過(guò)程中起促進(jìn)作用。

梓醇具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和降血糖等多種生物活性[13]。研究表明，梓醇通過(guò)抑制核因子κB配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨吸收，抑制卵巢切除小鼠的骨丟失。該結(jié)果表明，梓醇可能是治療骨疾病的一種有前途的候選藥物[14]。另有研究探討了梓醇對(duì)牙槽骨損傷的保護(hù)機(jī)制，該研究結(jié)果顯示，梓醇能減少骨丟失，升高ALP和OCN水平，降低TNFα 和COX-2 的表達(dá)，從而減輕尼古丁所致?lián)p傷和牙槽骨丟失，促進(jìn)牙槽骨礦化[15]。本研究結(jié)果顯示，梓醇可升高大鼠X 線評(píng)分、BV、BV/TV、TB.N 和TB.Th，升高大鼠ALP 和OCN 水平，促進(jìn)骨痂形成、Runx2和ColⅠ蛋白表達(dá)，該研究結(jié)果與Li等[15]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明梓醇可促進(jìn)大鼠骨折端軟骨痂的礦化和吸收，促進(jìn)骨折愈合。

BMP-2 是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的最重要的細(xì)胞因子之一，在胚胎發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化到骨發(fā)育和骨折修復(fù)等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮相關(guān)作用。成人骨骼中BMP活性的變化與骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎和骨折愈合能力下降有關(guān)[16]。證據(jù)顯示，BMP-2 能促進(jìn)體外兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。此外，BMP-2 能促進(jìn)兔橈骨缺損處的骨修復(fù)[17]。研究表明，BMP-2聯(lián)合骨誘導(dǎo)生物陶瓷材料β-磷酸三鈣可明顯促進(jìn)拔牙窩骨愈合，減少拔牙窩骨壞死[18]。在體外，丹參酮ⅡA 通過(guò)上調(diào)BMP-2 增加Runx2 和ColⅠ的表達(dá)、ALP 活性和鈣沉積，促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的成骨分化。在體內(nèi)，丹參酮ⅡA具有促進(jìn)骨折愈合的作用。該研究結(jié)果表明，上調(diào)BMP-2在骨折愈合中具有重要作用[19]。本研究結(jié)果顯示，梓醇治療可上調(diào)股骨骨折大鼠BMP-2蛋白表達(dá)。此外，慢病毒介導(dǎo)的BMP-2干擾可逆轉(zhuǎn)梓醇對(duì)骨折大鼠骨折愈合的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，梓醇通過(guò)上調(diào)BMP-2表達(dá)促進(jìn)大鼠骨折愈合。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[20]。β-Catenin 的活性受Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的控制，由Wnt配體、Fzd和Lrp5/6組成的復(fù)合物可穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)β-Catenin 蛋白并阻止其降解。累積的β-catenin 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF 形成復(fù)合物，刺激下游基因c-myc、cyclinD1 和c-jun 的表達(dá)[21]。βcatenin 的缺失將使間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌巧蒣20]。目前，已有研究表明，DMP-PYT 通過(guò)增強(qiáng)BMP-2誘導(dǎo)的β-catenin的活化，在體內(nèi)外刺激成骨細(xì)胞分化和骨形成[22]。此外，證據(jù)顯示，梓醇在體內(nèi)外通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，增加大鼠顱骨缺損模型中骨愈合能力，并減輕卵巢切除模型大鼠骨丟失[23]。因此，梓醇對(duì)骨折大鼠的作用可能與調(diào)控BMP-2 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，梓醇處理可上調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中β-catenin、c-myc 和cyclinD1 表達(dá)。慢病毒介導(dǎo)的BMP-2干擾可逆轉(zhuǎn)梓醇對(duì)骨折大鼠β-catenin、c-myc和cyclinD1 表達(dá)的促進(jìn)作用。該研究結(jié)果表明，梓醇可能通過(guò)上調(diào)BMP-2 表達(dá)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合。

綜上所述，梓醇可能通過(guò)上調(diào)BMP-2表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合。本研究為明確梓醇對(duì)骨折愈合的影響及開(kāi)發(fā)新的骨折治療藥物提供了新的依據(jù)。