王詠春 高紅梅 劉芳 朱?，?徐茂青

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250000； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟南 250000； 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動站，山東 濟南 250000)

高血壓是臨床上最常見的心血管慢性病之一，嚴(yán)重消耗了醫(yī)療和社會資源，尤其是在人口基數(shù)大的中國，國家和個人的疾病負(fù)擔(dān)很重[1]。近年來高血壓的診療方法取得了長足進步，指南建議改善生活方式和逐級加藥的治療方案，但據(jù)最新的統(tǒng)計報道，在中國高血壓的知曉率、治療率和控制率仍不理想，背后的原因是多方面的，比如高血壓患者未根據(jù)指南推薦的目標(biāo)控制血壓，以及現(xiàn)有的幾種藥物不能完全滿足患者的個體化需求[2]，患者對降壓治療的依從性差。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在高血壓、冠心病和心力衰竭等心血管疾病中扮演重要的角色，傳統(tǒng)RAS阻斷劑血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)通過阻斷RAS的不同環(huán)節(jié)，發(fā)揮獨特的靶器官保護作用，是高血壓治療方案的一線藥物，許多研究證實抑制RAS活性能顯著提高患者的遠(yuǎn)期生存率和改善生存質(zhì)量。近年來血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)受到國外學(xué)者的廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是降壓的理想靶點[3-4]。

傳統(tǒng)藥物無法有效地降低血AGT水平，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是前景良好的基因沉默技術(shù)，基于RNAi技術(shù)原理，靶向肝源性AGT基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)在多種動物模型中表現(xiàn)出顯著而持久的降壓療效。1期臨床試驗正在進行中，已有84例高血壓患者按2∶1的比例分別接受安慰劑和單次遞增劑量ALN-AGT(即靶向肝源性AGT基因的siRNA藥物)的治療，這是1期臨床試驗的第一部分內(nèi)容。2021年4月，Alnylam公司在歐洲高血壓學(xué)會-國際高血壓學(xué)會上正式公布了ALN-AGT 1期中隨機對照研究的結(jié)果，最新的數(shù)據(jù)截至2021年2月25日，這種小核酸藥物有望成為理想的RAS阻斷劑[5]，改變高血壓治療的方向，為患者帶來福音。

1 AGT的來源和代謝

人類AGT基因定位于1號染色體長臂42-43區(qū)(1q42-43)，是全長13 kb的單拷貝基因，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，表達產(chǎn)物AGT是α2-球蛋白，其基因多態(tài)性影響血AGT的水平。組織水平上，血中的AGT主要由肝細(xì)胞合成和分泌，肝源性AGT是循環(huán)RAS的重要成分，此外，腦、腎、脂肪和大動脈等組織也可合成少量AGT[6]，不同于循環(huán)RAS的內(nèi)分泌途徑，局部RAS以旁分泌或自分泌形式發(fā)揮作用。

AGT是腎素的特異性底物，也是所有血管緊張素的唯一前體，AGT在RAS中經(jīng)過連續(xù)的酶裂解生成多種具有活性的血管緊張素，血管緊張素結(jié)合血管緊張素受體參與血壓調(diào)節(jié)和發(fā)揮其他生物學(xué)效應(yīng)，最后經(jīng)由腎臟清除。

2 血管緊張素與高血壓

AGT與高血壓及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。一方面，AGT作為RAS的重要成分，其基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的易感性有關(guān)[7-8]，越來越多的證據(jù)表明，環(huán)境與致病基因之間的相互作用是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵因素[9]；另一方面，血AGT濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過血管緊張素的濃度，接近腎素的米氏常數(shù)，因此AGT(底物)和腎素(酶)水平的變化容易影響血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的濃度。高血壓常見的病理生理過程是在內(nèi)外因素的刺激下，AGT基因表達異常上調(diào)引起下游AngⅡ合成增加，繼而介導(dǎo)血壓升高和靶器官(心、腦和腎)損傷的發(fā)生，同時較高的血AGT水平也可增加機體對其他血壓應(yīng)激源的敏感性[10]。

此外，AGT亦有不依賴于血管緊張素的效應(yīng)，AGT通過介導(dǎo)體重增加和肝脂肪變性影響高血壓的發(fā)生和發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥大鼠缺乏肝源性AGT后，預(yù)防飲食誘導(dǎo)的體重增加，改善胰島素敏感性，減輕肝脂肪變性，引起血壓降低[11]，然而詳細(xì)的機制有待闡明。

3 RNAi技術(shù)與靶向肝源性AGT基因的siRNA

3.1 RNAi技術(shù)的原理

RNAi技術(shù)是前景良好的基因沉默技術(shù)之一，具有很高的效率和安全性。RNAi技術(shù)的詳細(xì)過程如下(見圖1)，設(shè)計好的siRNA由具有磷酸化5’末端的短雙鏈RNA(通常20～24 bp)和具有兩個突出核苷酸的羥基化3’末端構(gòu)成[12]，一條RNA鏈與靶mRNA部分互補稱為引導(dǎo)鏈，另一條RNA鏈為乘客鏈。siRNA進入胞質(zhì)，經(jīng)由TAR-RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的相互作用，與Argonaute蛋白和Dicer酶等大分子組裝成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)[6]。siRNA在內(nèi)切核酸酶作用下解開雙鏈和丟失乘客鏈，引導(dǎo)鏈的5’端被設(shè)計具有較弱的堿基對(較多的A和U)而在熱力學(xué)上不穩(wěn)定[13]，因此優(yōu)先成為RISC的一部分并獲得活性，能夠?qū)ふ野衜RNA片段并結(jié)合，而Argonaute蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域具有核酸酶活性，負(fù)責(zé)降解與引導(dǎo)鏈結(jié)合的mRNA，從而實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默特定基因的表達[14]。單個RISC可重復(fù)使用，且siRNA設(shè)計中使用RNA依賴性RNA聚合酶增強了信號[12]，級聯(lián)放大了沉默效應(yīng)。

圖1 RNAi技術(shù)原理

3.2 siRNA的載體

由于RNAi是非常高效的基因調(diào)控機制，在生物進化中形成了重重防御RNAi的機制，比如裸核酸不能穿過細(xì)胞膜，核酸酶對入侵的核酸進行非特異性降解，還有免疫反應(yīng)等?？傊?，RNAi過程中最大的難題是siRNA需搭載合適的平臺才能靶向遞送到胞質(zhì)，否則就會導(dǎo)致無效或不良作用，而運載系統(tǒng)的細(xì)胞毒性往往成為另一個主要問題。常用的siRNA載體有病毒、陽離子脂質(zhì)、聚合物和納米粒子等，其中非病毒載體因為具有較低的免疫原性和生產(chǎn)成本而被廣泛應(yīng)用[15-16]。

目前比較成功的非病毒載體是三價N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-siRNA結(jié)合物[17](見圖2)，該結(jié)合物通過皮下注射進入循環(huán)系統(tǒng)，緩慢釋放到體內(nèi)臟器，GalNAc與肝細(xì)胞表面高表達的無唾液酸糖蛋白受體特異性緊密結(jié)合，引起肝細(xì)胞內(nèi)吞結(jié)合物，隨著細(xì)胞內(nèi)pH下降，受體-配體分離，siRNA離開內(nèi)涵體進入胞質(zhì)組裝成RISC誘導(dǎo)RNAi[13，18-19]。由于肝細(xì)胞選擇性攝取GalNAc-siRNA并蓄積，通過皮下注射就可實現(xiàn)最小劑量的靶向遞送和最優(yōu)化的基因表達抑制[14-15，18]。GalNAc修飾的siRNA半衰期很長，是藥效持久性的藥理學(xué)基礎(chǔ)，單次皮下注射即可維持?jǐn)?shù)月至半年多的降壓效果，不需要頻繁給藥，因此siRNA比傳統(tǒng)RAS阻斷劑的藥物依從性更好。1期臨床試驗的最新數(shù)據(jù)已公布，高血壓患者單次注射≥100 mg的ALN-AGT，8周后的24 h收縮壓降低>10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，血AGT水平在12周內(nèi)持久降低>90%，維持降壓的注射間隔可能是3個月或6個月。

圖2 GalNAc修飾的siRNA靶向肝細(xì)胞

3.3 靶向肝源性AGT基因的siRNA

得益于技術(shù)的進步，靶向肝源性AGT基因的siRNA已成功開發(fā)，可精確地調(diào)控肝細(xì)胞AGT基因的表達水平，降壓作用呈劑量依賴性，在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)和子癇前期大鼠等模型中表現(xiàn)出顯著而持久的降壓效果，正在進行1期臨床試驗。

3.3.1 siRNA的降壓機制

靶向肝源性AGT基因的siRNA降壓機制如下(見圖3)：抑制肝細(xì)胞AGT基因表達將降低血AGT水平，RAS通過負(fù)反饋上調(diào)腎素表達，進而促進AGT底物消耗以維持血管緊張素水平，直至血AGT幾乎完全耗竭，腎素不能維持代償，下游血管緊張素的合成減少，所有血管緊張素受體受到的刺激減少，引起血壓大幅下降[19]。由于siRNA從源頭抑制下游所有血管緊張素肽的活性，阻斷RAS更為徹底，因此有學(xué)者稱之為“理想的RAS阻斷劑”，這種小核酸藥物被設(shè)計用于治療高需求的高血壓患者，包括未控制和難治性的高血壓(見圖4，引用自Alnylam官網(wǎng)文件作為參考)。

圖3 靶向AGT的siRNA降壓機制

圖4 ALN-AGT的時機：未控制和難治性的高血壓

3.3.2 siRNA的降壓效果

Olearczyk等[20]給SHR靜脈注射脂質(zhì)納米粒包裹的siRNA(見表1)，肝源性AGT mRNA水平在給藥8 h后達到最低值，AGT基因敲除率最高超過90%，效果至少持續(xù)1周，SHR收縮壓顯著降低。

表1 主要實驗比較

Uijl等[21]比較siRNA與卡托普利和纈沙坦的降壓效果(見表1)，發(fā)現(xiàn)siRNA具有同傳統(tǒng)RAS阻斷劑相當(dāng)?shù)慕祲汉托难鼙Ｗo作用。更重要的是，siRNA單次皮下注射的長期有效性，可平穩(wěn)降壓數(shù)周至數(shù)月，延長了注射的時間間隔，改善了患者對治療的依從性。

關(guān)于降壓的AGT閾值，Mullick等[22]研究揭示在SHR模型中，最初降低平均動脈壓至少需降低75%的血AGT，維持降壓效果則需降低60%的血AGT；Uijl等[21]進一步研究發(fā)現(xiàn)至少要消除血中99%以上的AGT才能完全抑制AngⅡ作用和阻斷RAS的再激活，然而在該實驗中單獨使用siRNA最多降低97.9%的血AGT，只有siRNA與纈沙坦聯(lián)合使用才能降低99.8%的血AGT。

即便血AGT水平未降到上述標(biāo)準(zhǔn)，血壓仍有明顯的降低，這可能歸因于局部RAS的受抑。目前認(rèn)為腎合成AngⅡ所需的腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶是腎源性，但腎的AGT來源于循環(huán)血，即主要依賴于肝合成的AGT，血AGT在生理狀態(tài)下通過巨蛋白依賴的方式被近端小管細(xì)胞重吸收[23-24]。當(dāng)血AGT濃度開始下降，腎RAS對血中AGT的減少比系統(tǒng)RAS更敏感，在血AGT水平下降還不明顯時，腎RAS可能已受到抑制，導(dǎo)致血壓降低[25]。

Haase等[26]使用靶向肝源性AGT基因的siRNA治療子癇前期的大鼠(見表1)，在顯著降低母體血壓的同時改善了胎盤灌注和胎兒預(yù)后。值得注意的是，在Haase等的實驗中，不僅母鼠耐受良好，胎鼠也未檢測到siRNA的暴露，siRNA作為具有肝臟特異靶向性的大分子無法穿過血胎屏障，排除了對胎兒的影響。因為Haase使用的子癇前期大鼠模型，不足以證明siRNA對孕婦和胎兒的安全性，目前關(guān)于siRNA在妊娠中的應(yīng)用尚無定論。

盡管Haase的實驗存在局限性，但結(jié)論仍具有重要意義，因為AngⅡ與其2型受體結(jié)合在胚胎發(fā)育過程中起重要作用，傳統(tǒng)RAS阻斷劑可導(dǎo)致較低的新生兒存活率和嚴(yán)重的發(fā)育問題，所以孕婦是降壓治療的特殊人群，可選擇的藥品種類有限，而且難以達到降壓標(biāo)準(zhǔn)，及時終止妊娠通常是重癥子癇患者唯一的選擇，靶向肝源性AGT基因的siRNA若能平衡母體的健康和成長中胎兒的需要，將為患有高血壓的孕婦提供更優(yōu)的選擇[27]。

1期臨床試驗的次要終點是血AGT的基線變化，血和尿的藥代動力學(xué)：患者在單次注射≥100 mg ALN-AGT的12周內(nèi)血AGT水平下降>90%，而單次注射800 mg ALN-AGT的患者在第12周時血AGT水平降低96%～98%。探索性終點是24小時動態(tài)血壓監(jiān)測收縮壓/舒張壓的基線變化：患者單次注射ALN-AGT≥100 mg的8周后，24 h收縮壓降低>10 mm Hg；單次注射ALN-AGT≥800 mg的8周后，24 h收縮壓降低>15 mm Hg；患者單劑注射800 mg的第12周，24 h平均血壓降低17/9 mm Hg。上述數(shù)據(jù)說明ALN-AGT呈劑量依賴地降低血AGT水平和血壓，具有臨床價值。

3.3.3 siRNA治療的安全性

Mullick等[22]認(rèn)為在RAS受到嚴(yán)重抑制時，腎內(nèi)AGT對維持腎功能十分重要，而對維持高血壓不重要，與RAS阻斷相關(guān)的低血壓、高鉀血癥和急性腎功能不全等不良反應(yīng)主要歸因于腎內(nèi)RAS過度抑制。在循環(huán)中，腎臟能自我調(diào)節(jié)以維持正常腎血流量和腎小球濾過率，這種能力依賴于腎內(nèi)RAS，部分腎動脈粥樣硬化、狹窄或低血容量者使用ACEI/ARB，可因腎小球濾過率降低而發(fā)生急性腎功能不全。在抑制肝源性AGT基因表達的實驗中未觀察到以上不良反應(yīng)，事實上，在已知的動物實驗中均未發(fā)現(xiàn)靶向AGT基因的siRNA可能導(dǎo)致的不良反應(yīng)，直到實驗結(jié)束，動物的肝腎功能仍然完好，不排除因時間較短而未發(fā)生不良反應(yīng)的可能。

Haase等[26]研究引出的一個爭議是先兆子癇是低RAS活動狀態(tài)，沉默肝源性AGT基因?qū)Υ祟惢颊卟灰欢ㄓ幸?。也有學(xué)者認(rèn)為RAS可增強人體對不良條件的抵抗力，siRNA對RAS活性的阻斷可能會削弱這種能力，盡管目前并無證據(jù)支持這種觀點，此外，siRNA對于低RAS活性高血壓患者的治療效果也有待深入研究[19]。

1期臨床試驗的主要終點是安全性和耐受性，結(jié)果觀察到輕至中度的不良反應(yīng)，最常見的是注射部位反應(yīng)(發(fā)生率8.9%)，癥狀短暫而輕微，無需干預(yù)即自行恢復(fù)；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清肌酐和血清鉀均無臨床意義的升高，提示肝腎功能未受損，與動物實驗結(jié)論一致；無患者在治療期間發(fā)生低血壓；無死亡或不良事件導(dǎo)致受試者退出研究。目前的結(jié)果表明在輕至中度的高血壓患者中，單次皮下注射ALN-AGT的安全性和耐受性良好，支持繼續(xù)進行臨床試驗，推進臨床應(yīng)用。

值得一提的是，盡管siRNA的研究人員不認(rèn)為十分有必要逆轉(zhuǎn)siRNA效果，但在急需恢復(fù)RAS活性時可使用Reversir技術(shù)，通過將高親和力的寡核苷酸探針雜交到RISC加載的引導(dǎo)鏈，使功能RISC失效，從而快速和有效地逆轉(zhuǎn)siRNA介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)[28]。

4 未來和展望

4.1 siRNA聯(lián)合用藥

靶向抑制肝源性AGT基因的siRNA降壓機制雖然高效，但未免單一，而且也有作用極限，研究人員考慮聯(lián)合其他治療高血壓的藥物。Olearczyk等和Uijl等使用siRNA聯(lián)合沙坦類藥物用于降壓有顯著的協(xié)同作用，能實現(xiàn)最大程度的血壓降低，且未觀察到明顯的不良反應(yīng)，驗證了siRNA與傳統(tǒng)RAS阻斷劑聯(lián)合應(yīng)用的可行性，這對疾病背景復(fù)雜的高血壓患者可能更有益。過去ACEI與ARB聯(lián)合的RAS雙通道阻斷療法因為不確定的安全性和療效而備受爭議[29]，如今siRNA獨特的藥理學(xué)機制表明它與其他降壓藥物聯(lián)用有很好的潛力，1期臨床試驗的第四部分是ALN-AGT聯(lián)合厄貝沙坦的研究，評估這種新型RAS阻斷劑與傳統(tǒng)RAS阻斷劑的協(xié)同作用，以期為高血壓的進一步治療提供思路。

4.2 RNAi技術(shù)的局限

siRNA進入開發(fā)不過十幾年，用于臨床治療的siRNA藥物被批準(zhǔn)上市也不過發(fā)生在近兩三年內(nèi)，盡管治療效果顯著，安全性較好，但這一領(lǐng)域尚有很多疑問待解決，如GalNAc修飾的siRNA以一種速率受限的未知機制逃逸出內(nèi)涵體[12]，這一步驟直接限制了siRNA在肝細(xì)胞內(nèi)起效的速度，至今技術(shù)上仍無法完全消除這種限速[25]。

4.3 RNAi未來的方向

全身和局部RAS在高血壓中相互作用的研究表明抑制肝外組織的RAS，如降低腦、腎和脂肪組織的AngⅡ水平也可降低血壓，這是未來高血壓治療的一個重要方向，然而目前將RNAi療法遞送到肝外組織的技術(shù)并不成熟，未來應(yīng)考慮在肝源性AGT表達已受抑的情況下如何調(diào)節(jié)局部組織的RAS活性。

5 小結(jié)

高血壓是遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的異質(zhì)性疾病，臨床上以原發(fā)性高血壓最為常見，其發(fā)病機制不完全清楚。近年來越來越多的研究肯定AGT在高血壓等心血管疾病中的靶點地位，隨著臨床試驗的進行，靶向肝源性AGT基因的siRNA有望成為理想的RAS阻斷劑，持久而平穩(wěn)地控制患者血壓。此外，血壓調(diào)節(jié)機制中存在多個反饋，目前的幾項實驗周期較短，長期血壓是否會受其他因素的影響而產(chǎn)生波動尚不可知，期待臨床試驗?zāi)軐Υ俗鞒鼋獯稹?/p>