曾 順 劉達興

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管外科，遵義 563000)

大鼠腹腔心臟移植模型是目前廣泛使用的心臟移植動物模型之一，相比于頸部移植模型更易被接受[1]，主要用于移植免疫、病理、藥理等方面的研究。此模型的建立最早于1964年由 Abbott等[2]報道，由Ono等[3]在1969年改進并確立該模型的基本術(shù)式，但并沒能簡化其復(fù)雜的操作難度，提高成功率，因此不斷有研究人員進行大鼠腹腔同種異體異位心臟移植模型的改良。在本研究中，我們經(jīng)過不斷地嘗試，在前人的基礎(chǔ)上總結(jié)出一系列經(jīng)驗及注意事項，對手術(shù)步驟進行改良優(yōu)化，旨在指導(dǎo)初學(xué)者快速掌握手術(shù)方法，造模過程更加穩(wěn)定高效。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：受體為SPF級雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量 200～ 220 g。供體為雄性Wistar大鼠 30 只，6～8周齡，體質(zhì)量 200～220 g。由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-001。自由進食。術(shù)前12 h動物禁食不禁水。實驗通過遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，倫理審查編號：KLLY(A)-2019-080。

1.1.2實驗器械：血管彎鉗1把、直鉗1把、外科剪1把、持針器1把、16 cm角頭顯微鑷1把、16 cm直頭顯微鑷 2把、16 cm彎頭顯微剪2把、16 cm顯微針持1把、4.7 cm血管夾2個、V型腹部撐開器1個、自制大鼠手術(shù)固定板 2個、自制冰盒 1個、Leica手術(shù)顯微鏡M220F12、8-0無損傷帶線縫合針、4-0縫線、套管針、各型號注射器、無菌棉簽、無菌紗布及無菌棉球若干。

1.1.3藥品：1%戊巴比妥鈉(0.8 g/80 mL生理鹽水)上海試劑二廠產(chǎn)品，0.9%氯化鈉鹽水，4 ℃肝素水(25 U/mL∶12 500 U肝素/500 mL生理鹽水)江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司，4 ℃心肌保護液(Del Nido，復(fù)方電解質(zhì)注射液500 mL/20%，甘露醇8.15 mL/25%，硫酸鎂注射液4 mL/5%，碳酸氫鈉11 mL/10%氯化鉀10 mL/2%，利多卡因3.25 mL)，5%葡萄糖注射液。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1麻醉：使用1 mL注射器緩慢腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，約1 mL，同時麻醉SD大鼠和 Wistar大鼠，注射后3～5 min即進入麻醉狀態(tài)。若麻醉狀態(tài)欠佳，逐量追加0.1 mL戊巴比妥鈉。觀察大鼠呼吸平穩(wěn)和四肢松弛后，分別固定于自制手術(shù)板上。

1.2.2受體準備：麻醉狀態(tài)適宜后，大鼠置于操作臺上固定，擺好仰臥位，紗布折疊后置入后腰部，抬高腹部，腹部備皮，75%乙醇消毒3次。行腹部正中切口剪開皮膚，6～7 cm，沿腹白線剪開腹膜，用V型拉鉤牽引撐開腹壁切口，棉簽將腸管推向大鼠左側(cè)，不牽拉出體外，用溫生理鹽水紗布覆蓋隔離腸管，棉簽鈍性分離顯露腎靜脈分支以下至髂血管分支以上的下腔靜脈及腹主動脈，然后顯微鑷逐層分離。選取一段約1 cm血管，直接電凝離斷側(cè)壁及背側(cè)小靜脈分支部分(圖1a)，取出拉鉤，向腹腔內(nèi)注入2 mL生理鹽水，鹽水紗布覆蓋術(shù)區(qū)切口備用。

1.2.3供心摘?。郝樽頎顟B(tài)適宜后，將大鼠放置于鋪好棉墊的固定板上，呈仰臥位，胸、腹部備皮，75%乙醇消毒3次。相同方式打開腹腔，棉簽將腸管推向一側(cè)，顯露下腔靜脈，向下腔靜脈注入肝素水2 mL，使供體肝素化，壓迫針孔止血1 min，剪斷下腔靜脈及腹主動脈放血，剪開膈肌，剪斷兩側(cè)肋骨，U型切口打開胸腔，用止血鉗夾持劍突上翻胸骨，打開心包，4 ℃肝素水澆灌心臟表面保持低溫。電凝上腔靜脈，將肝素水20 mL沿下腔靜脈緩慢注射心臟，心臟由紅變?yōu)橥咙S色，銀白色網(wǎng)狀動脈于心臟表面清晰可見為止，再次用10 mL注射器將Del Nido停跳液沿下腔靜脈注射入心臟，可看到心臟跳動減慢直到停跳，剪除胸腺組織及多余脂肪組織，顯微直角鑷沿心臟橫竇穿過4-0縫合線，集束結(jié)扎肺靜脈，上腔靜脈、下腔靜脈，鈍性分離主動脈及肺動脈間隙，以顯微剪剪斷升主動脈，供心保留長2～4 mm主動脈。同樣方法剪斷肺動脈，保留相同長度肺動脈。注意主動脈及肺動脈均有分叉，在分叉以下剪斷，避免二次修剪。抽取適量肝素水，用適當長度套管針頭，沿供心主動脈、肺動脈斷端注入，再次灌洗心臟血管,并觀察獲取血管管徑及長度，結(jié)扎線提起供心，直接剪斷左右肺門、心臟周圍靜脈，剪去多余結(jié)締組織，置入4 ℃肝素水中保存。

1.2.4心臟移植：夾閉受體選擇段血管的下腔靜脈、腹主動脈，先夾閉近心端，后夾閉遠心端，清除選取段血管上附著的結(jié)締組織，顯微鑷輕提起下腔靜脈，顯微剪破開小口，拭去血液，肝素水沖洗，沿小口位置向上做一口徑稍長于供心肺動脈的縱切口，肝素水由切口沖洗干凈管腔，不殘留血栓，同樣方法在腹主動脈稍高于下腔靜脈縱切口處，做一長度大小與供心主動脈口徑一致的縱切口(圖1b)，冰鹽水紗布包裹供心后放置在腹主動脈側(cè)，調(diào)整供心位置待吻合，吻合時升主動脈、肺動脈斷端盡量接近受體腹主動脈、下腔靜脈縱切口處，用8-0無損傷縫合線予供心主動脈、受體腹主動脈切口行端側(cè)吻合，首先固定近心端一角(圖1c)，后固定遠心端作起始線(圖1d)，將供心提起翻向下腔靜脈一側(cè)，連續(xù)縫合外側(cè)壁，4～5針可完成吻合(圖1e)，首尾兩針盡量靠近固定角，吻合至切口另一角時，供心提起翻向腹主動脈側(cè)，進而改變進針方向縫合主動脈內(nèi)側(cè)壁，連續(xù)縫合內(nèi)側(cè)壁后在遠心端起始線頭處結(jié)扎，約縫合 4～5針可完成吻合，在最后1針打結(jié)前用肝素水充盈血管，排凈血管及供心內(nèi)氣體，同時觀察有無漏口，打結(jié)(圖1f)。直接下腔靜脈固定遠心端作起始線連續(xù)縫合內(nèi)側(cè)壁(圖1g)，縫合5～6針(圖1h)，近心端轉(zhuǎn)角處，從下腔靜脈內(nèi)側(cè)壁穿入，從外側(cè)壁穿出，連續(xù)縫合外側(cè)壁，縫合5～6針。在收緊縫線前沖洗吻合口、排出血管及供心內(nèi)氣體(圖1l)，棉球包繞吻合處壓迫。開放血管夾，先開放遠心端，待供心復(fù)跳后揭開棉球，觀察有無出血漏口，及時壓迫止血或加縫。止血完畢后，腹腔注入2 mL生理鹽水，關(guān)閉腹腔。

圖1 Wistar-SD大鼠腹腔異位心臟移植

1.2.5術(shù)后處置及觀察：術(shù)后大鼠單獨飼養(yǎng)于鼠籠中，適當暖風(fēng)復(fù)溫，一般術(shù)后10～20 min蘇醒，蘇醒后予5%葡萄糖鹽水約5 mL飼養(yǎng)補充液體量，術(shù)后自由活動、進食，保持墊料干燥及適宜飼養(yǎng)環(huán)境，密切通過觸診了解移植心搏動情況，觀察大鼠一般情況、雙下肢活動等。手術(shù)成功標準為術(shù)后供心恢復(fù)平穩(wěn)心率(150～220次/min)，每天通過腹部觸診了解供心跳動情況，視Postson心臟收縮分級為Ⅲ～Ⅳ級，供心跳動72 h以上為手術(shù)成功。

2 結(jié)果

本研究過程中，完成Wistar-SD大鼠腹腔異位心臟移植 30對，成功 29對，成功率 96.7%。因術(shù)中誤扎心臟，開放后無法止血死亡1例，總手術(shù)時間(59.8 ±10.0)min，其中受體血管顯露時間(5.1 ±2.0)min，供心摘取時間(9.9 ±3.0)min，受體血管造口時間(4.1±1.0)min，受體腹主動脈端側(cè)吻合時間 (10.4±4 .0) min，受體下腔靜脈端側(cè)吻合時間(8.8±3.0)min，供心缺血時間(24.2 ±5.0)min。開放后止血處理(10.2±5.0)min。升主動脈-腹主動脈平均縫合(12.1±2.0)針，肺動脈-下腔靜脈平均縫合(13.7±3.0)針?；謴?fù)血供到開始心室纖顫時間(10.2 ±2.0)s，心室纖顫期(30.3 ±5.0)s。在移除血管夾開放血供后，所有大鼠均存在吻合口滲血，按壓后大部分可止血，均以轉(zhuǎn)角處滲血為主，失血量0.3～0.5 mL，開放血管后可在下腔靜脈處觀察血流情況，均通暢情況良好，均在術(shù)后恢復(fù)血供、心跳(如圖2)。大鼠術(shù)后10～20 min可蘇醒，蘇醒后對飲水需求較高，2～3 h后可正常飲食，精神可，5～6 h后行走自如，無截癱、下肢活動障礙、尿潴留等并發(fā)癥。每日腹部觸診，移植心收縮有力，Postson心臟收縮分級為Ⅲ～Ⅳ級，72 h以上均可觸及心跳(150～220次/min)。

圖2 血供開放后心臟

3 討論

大鼠腹部心臟移植模型由Ono等[3]確立基本術(shù)式以來，因大鼠制備飼養(yǎng)較方便，且該模型便于術(shù)后方便觀察，因此在器官移植基礎(chǔ)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，難度較大的顯微縫合技術(shù)和各環(huán)節(jié)復(fù)雜操作成為了阻礙。本研究對該模型手術(shù)方式進行了改良，旨在讓手術(shù)操作更為簡便，現(xiàn)分享一些小技巧及注意事項。

3.1 麻醉藥物

本研究采用麻醉使用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射，未出現(xiàn)因麻醉死亡案例。本研究在預(yù)實驗時，采用七氟烷吸入麻醉，同其他研究報道類似[4]，吸入麻醉易出現(xiàn)窒息等情況，需密切觀察大鼠呼吸節(jié)律等，不斷調(diào)整麻醉深度，避免窒息情況的發(fā)生，在撤除吸入麻醉后1～2 min大鼠即可恢復(fù)清醒，翻身活動。經(jīng)比較麻醉藥物優(yōu)缺點后，正式實驗時采取戊巴比妥鈉腹腔注射，較吸入麻醉，腹腔注射麻醉優(yōu)點為術(shù)后一般10～20 min蘇醒，起到對動物模型的一定制動作用，術(shù)后1～2 h可自由活動，術(shù)中可以不用關(guān)注呼吸情況，不用調(diào)節(jié)吸入麻醉深度，若使用吸入麻醉單術(shù)者操作可能忽略這一過程，致受體窒息，或因此增加供心缺血時間。本研究使用腹腔注射麻醉尚未發(fā)生因麻醉死亡案例，效果安全可靠，如術(shù)中出現(xiàn)大鼠躁動，可逐量追加0.1 mL麻醉藥，但仍需警惕的是，朱力鳴等[5]報道在預(yù)實驗中出現(xiàn)因手術(shù)操作時間過長，大鼠因麻醉效果死亡情況，同其他研究報道相同，隨手術(shù)時間的增加，麻醉效果會難以判斷，在麻醉后期追加給藥時需謹慎。

3.2 術(shù)中體位

3.2.1受體體位改進：術(shù)中受體仰臥位，腰部墊高，使下腔靜脈及腹主動脈抬高，位置更淺表，更容易顯露，術(shù)中操作空間較大，易于術(shù)中操作。

3.2.2供體體位改進：術(shù)中供體仰臥位，打開胸腔后，背部可置予20 mL注射器抬高整個胸腔，灌注液及血液沿抬高胸腔向腹腔流動，便于整個術(shù)區(qū)視野的清晰。

3.3 供受體準備順序及供受體選擇

余春俊等[6]可先完成供體心臟獲取，再行受體大鼠腹腔血管的顯露準備，但本研究單操作者先顯露受體大鼠腹腔血管，未影響受體大鼠生理狀況，再獲取供心，可適當減少供心缺血時間。在選擇供受體方便，SD大鼠腹腔選用血管可見分支血管一般少于2根，Wistar大鼠的可見血管分支一般 3～4支，為減少術(shù)中結(jié)扎分支時間，故選用SD大鼠為受體，Wistar大鼠為供體。受體血管制備時，本實驗采取直接電凝離斷分支血管，避免結(jié)扎引起血管損傷，結(jié)扎不完全等術(shù)中滲血影響操作視野等情況，本研究認為直接電凝分支血管對大鼠生存影響較小，能大幅度減少術(shù)中時間，且完成實驗后大鼠無出現(xiàn)截癱、活動障礙等情況。

3.4 灌注方法

本研究采取沿下腔靜脈灌注，灌注沖洗心臟前，阻斷上腔靜脈，避免上腔靜脈血液的回流，減少了灌注沖洗量，一般僅需肝素水20 mL即可達到灌注滿意的效果。灌注標準為可以觀察到供心由紅潤變?yōu)橥咙S色, 心壁冠狀動脈各分支無殘留血液，均呈銀白色，表明灌注完全[7]，也有報道采用經(jīng)胸主動脈灌注以排除供心血液，但該方法不符合心臟血流生理方向，需更大的沖洗灌注量，該過程可能導(dǎo)致心肌損傷，且胸主動脈較下腔靜脈顯露困難，經(jīng)過嘗試比較后未予采用[8]。

3.5 集束結(jié)扎血管

對于供心周圍血管的處理，采用的方法為用一根4-0縫合線經(jīng)心臟橫竇通過主動脈、肺動脈背側(cè)，將心臟背側(cè)上、下腔、肺門靜脈，左、右心耳集束結(jié)扎[8]。該方法具有簡便、快速、防止心耳出血、增加復(fù)跳后循環(huán)血量等優(yōu)點，但此處需保證結(jié)扎可靠，至少三個手術(shù)外科結(jié)。本實驗開始時行兩個外科結(jié)，開放血管后出現(xiàn)滲血等情況，可再次鉗夾后結(jié)扎，未影響心臟跳動頻率，行三個手術(shù)外科結(jié)后保證結(jié)扎可靠未再次出現(xiàn)集束結(jié)扎血管滲血等情況，且采用集束結(jié)扎不影響心臟的復(fù)跳及頻率。

3.6 供心保存

獲取供心時，充分沖洗心臟及冠脈血液，并使用Del Nido液保護心肌，獲取供心后置入4 ℃肝素水中保存，因為首先完成受體血管顯露，一般只需保存3～4 min即可開始縫合，縫合時同樣予冰鹽水紗布包裹供心，術(shù)中無需反復(fù)向供心提供鹽水澆灌即可達到心肌的保護效果，減少單術(shù)者因此耽誤的縫合時間，提高效率及心肌保護[9]。

3.7 受體血管吻合口的準備

目前，研究報道是用冠脈刀片切開受體血管前壁或8-0縫針挑起受體血管前壁后剪除挑起部分[10-11]等方式，于受體血管上做一口徑與供心主動脈口徑近似的縱切口，此兩種方法均有一定損傷對側(cè)血管壁可能，特別對于初學(xué)者，損傷受體血管后壁概率大，直接導(dǎo)致模型建立失敗，在預(yù)實驗時采用上述方法時，均出現(xiàn)劃破后壁血管情況，正式實驗采取顯微鑷稍提起血管壁，顯微剪剪開小口，沖洗血液后，沿小口向上做長度適宜的縱切口，應(yīng)用此方法未再損傷血管后壁，可靠有效，行下腔靜脈縱切口時，應(yīng)略大于肺動脈口徑，腹主動脈縱切口與主動脈口徑一致，避免縫合后回流不暢，心臟充血變硬。

3.8 血管縫合

采用顯微鏡下連續(xù)縫合，升主動脈-腹主動脈端側(cè)吻合，因上下兩角是縫合后易滲血部位，可先固定兩角后，連續(xù)縫合，針距1 mm，邊距0.5 mm，靠近兩角的針距盡量縮小，完成最后1針縫合打結(jié)前，需向吻合口注入肝素水，排凈血管及供心內(nèi)氣體，同時觀察潛在的出血口，及時加縫。下腔靜脈-肺動脈端側(cè)吻合時，固定兩角會加大縫合的難度，且因靜脈壁較薄，反復(fù)牽拉可能引起靜脈壁的撕裂，只固定一角，針距1 mm，邊距1 mm,在近心端轉(zhuǎn)角處1針需連續(xù)穿過下腔靜脈內(nèi)側(cè)壁和外側(cè)壁，才能保證再次進針的角度。

綜上所述，包括在手術(shù)前禁食，減少大鼠腸管膨隆干擾，充分準備各種術(shù)中需要使用的器械或藥品，適宜的麻醉方式，可有效減少手術(shù)耗時。每個手術(shù)步驟均可能影響實驗最后的結(jié)果，此模型需要術(shù)者具備一定的顯微外科能力，全面掌握手術(shù)操作的各個步驟，減少縫合時間，減少供心缺血時間，才能高效地完成模型的建立，保證模型構(gòu)建的穩(wěn)定效率。本文總結(jié)改進的大鼠腹腔異位心臟移植模型操作方法，有效敘述初學(xué)者可能遭遇的困難及雷區(qū)，一定程度上簡化、降低了手術(shù)難度，為移植的研究提供便利。