張 靜 張 贊 趙 磊 郭雅南 黃 蕤 許立達(dá)

(1.北京化工大學(xué)，北京 100029)(2.百奧賽圖(北京)醫(yī)藥科技有限公司，北京 101111)

近年來(lái)使用靶向程序性死亡受體1(PD-1)、程序性死亡受體1配體(PD-L1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)等免疫檢查點(diǎn)藥物進(jìn)行腫瘤免疫治療越來(lái)越受到關(guān)注。其中，臨床前動(dòng)物模型選擇是腫瘤免疫治療中面臨的十大重要挑戰(zhàn)之一[1]。通過(guò)基因工程將人類基因插入動(dòng)物體內(nèi)，以提高動(dòng)物在人類疾病研究中利用性，在疾病的基礎(chǔ)研究和藥物研究中都得到了廣泛應(yīng)用?；蛉嗽椿∈笸ㄟ^(guò)插入人類基因來(lái)替代相應(yīng)的內(nèi)源性小鼠基因使小鼠人源化，被廣泛應(yīng)用于人類疾病模型建立、腫瘤研究以及生物制藥研究中[2-4]。單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)是臨床治療中成功率較高的一類藥物[5-7]，但是人類和嚙齒動(dòng)物之間的某些單克隆抗體交叉反應(yīng)性差會(huì)嚴(yán)重限制其臨床前研究進(jìn)程。目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因人源化可以為在小鼠中驗(yàn)證人類單克隆抗體提供一種有效的方法。

CD40是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的成員，是一類共激活信號(hào)分子，主要由抗原提呈細(xì)胞(APC)如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞，特別是腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，以及某些腫瘤細(xì)胞特別是B細(xì)胞惡性腫瘤和淋巴瘤表達(dá)[8-10]，其配體為CD40 L，主要在血小板、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和活化的T細(xì)胞上表達(dá)[11]。CD40與它的配體CD40 L相互作用可以激活A(yù)PC，為T細(xì)胞活化提供共激活信號(hào)，啟動(dòng)效應(yīng)性細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。構(gòu)建CD40人源化小鼠模型能夠?yàn)镃D40單克隆抗體藥物開(kāi)發(fā)以及在腫瘤治療中的安全應(yīng)用研究提供更多可選擇的動(dòng)物模型。本研究通過(guò)構(gòu)建CD40人源化小鼠模型并對(duì)其CD40表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證這種模型對(duì)于評(píng)價(jià)人CD40激活型抗體藥物臨床前藥效作用和安全性的可能。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

健康的SPF級(jí)C57BL/6小鼠、昆明(KM)小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。CD40人源化小鼠(B-hCD40)由百奧賽圖(北京)醫(yī)藥科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0004；本研究方案經(jīng)百奧賽圖(北京)醫(yī)藥科技股份有限公司的動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查編號(hào)：BAP-BJ-PS-101、BAP-BJ-PS-102。小鼠MC38結(jié)腸癌細(xì)胞購(gòu)自舜冉上海生物科技有限公司；Cas9 mRNA和sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGA shortscript T7 Kit和純化試劑盒MEGA clear Kit 購(gòu)自Life Technologies；southern消化酶StuI和SpeI購(gòu)自NEB；southern雜交液和地高辛發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche；探針引物合成于金唯智生物科技有限公司；RT-PCR引物合成于Thermo fisher scientific；流式檢測(cè)抗體均購(gòu)自Biolegend，包括鼠抗CD45(30-F11)、TCRβ(30-F11)、CD19(6D5)、CD4(GK1.5)、 CD8(53-6.7)、CD11c(N418)、CD11b(M1/70)、NK1.1(PK136)、F4/80(8M8), Gr1(RB6-8C5)、Ly6G(1A8)、Foxp3(FJK-16S)、CD40(3/23)、PD-1(RMP1-30)、TIM3(RMT3-23)、Eomes(Dan11mag)、T-bet(4B10)和抗人CD40(HB14)；激活型抗人CD40單克隆抗體(CD40 Ab)由百奧賽圖(北京)醫(yī)藥科技股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1sgRNAs的篩選：通過(guò) CRISPR 設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http:∥crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)了多個(gè)sgRNA，分別靶向小鼠CD40 exon2和exon7的兩個(gè)位點(diǎn)。使用sgRNA活性檢測(cè)系統(tǒng)UCATM(Biocytogen)篩選出兩個(gè)靶向活性高的sgRNA來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Cas9 mRNA和sgRNA的制備：通過(guò) PCR 擴(kuò)增將Cas9 mRNA和sgRNA序列添加到含T7啟動(dòng)子的Cas9或sgRNA模板上。將該模板使用MEGA shortscript T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。使用MEGAclear試劑盒將Cas9 mRNA和sgRNA純化，然后用RNase-free水洗脫。

1.2.3打靶載體構(gòu)建：我們?cè)O(shè)計(jì)的打靶載體含有人CD40基因序列(取代小鼠CD40序列)和左(～1 500 bp)、右(～1 500 bp)兩個(gè)同源臂的序列作為打靶模板，修復(fù)由Cas9/sgRNA 產(chǎn)生的雙鏈斷裂。小鼠CD40的部分編碼區(qū)域(小鼠第20～192個(gè)氨基酸)被人CD40(人第 20～192個(gè)氨基酸)取代。

1.2.4顯微注射：C57BL/6雌性小鼠和KM小鼠品系分別作為胚胎供體和假孕代孕母體。將超排的雌性 C57BL/6小鼠(3～4周齡)與雄性C57BL/6小鼠交配，收集受精胚胎。將不同濃度的 Cas9 mRNA、sgRNA 和供體載體混合，共同注射到單細(xì)胞期受精卵的細(xì)胞質(zhì)中。注射后，將存活的受精卵轉(zhuǎn)移到 KM假孕雌性小鼠的輸卵管中。

1.2.5Southern印跡雜交：從小鼠尾部提取的基因組DNA用SpeI或StuI酶消化，在0.8%瓊脂糖凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上。使用含有地高辛(DIG)標(biāo)記的探針的雜交液在42 ℃下與膜過(guò)夜雜交。隨后使用DIG發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)雜交信號(hào)。

對(duì)于探針的制備，使用 Taq DNA聚合酶通過(guò) PCR 程序制備 3′-外部和內(nèi)部探針，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明摻入DIG-11-dUTP標(biāo)記探針使用以下引物擴(kuò)增3′-外部探針(358 bp)：5′-TCTGCAGAGCCA AGCATAGCAAAGT-3′和3′-GAGCCAGCTCAAAGC AGAGCTATCA-5′。對(duì)于內(nèi)部探針(368 bp)使用以下引物：5′-GGTCAAGCAGATTGGTAAGT GGCTC-3′和3′-GAGGGGGACATTAACCATCAT GG-5′。

1.2.6RT-PCR：使用總RNA提取試劑盒提取6周齡的小鼠脾臟總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)小鼠CD40和人CD40的mRNA的表達(dá)。

使用以下引物擴(kuò)增GAPDH(269 bp)：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和3′-GCCTGCTTC ACCACCTTCTT-5′。小鼠CD40(413 bp)使用以下引物：5′-TGAGAAGACCCAATGCCACC-3′和3′-TCCGGGACTTTAAACCACAGAT-5′。人源化CD40(408 bp)，使用以下引物：5′-GTGCTGTTCTTTG TGCCAGC-3′和3′-AGGTCTTTGGTCTCACAGCTT-5′。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠CD40蛋白表達(dá)及免疫細(xì)胞分群：分別對(duì)C57BL/6小鼠和B-hCD40小鼠腹腔注射7.5 μg mCD3抗體，24 h后收集小鼠脾臟細(xì)胞檢測(cè)B-hCD40小鼠人源CD40蛋白的表達(dá)水平。分別收集C57BL/6和B-hCD40小鼠脾臟細(xì)胞，對(duì)小鼠的各個(gè)淋巴細(xì)胞群包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD4+陽(yáng)性細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和Treg細(xì)胞進(jìn)行流式分析。對(duì)收集到的小鼠脾臟組織進(jìn)行研磨，然后使用ACK紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，去除紅細(xì)胞。500 g離心5 min后，將得到的脾臟細(xì)胞與熒光直接標(biāo)記抗體在4 ℃條件下避光孵育細(xì)胞30 min，PBS洗滌后進(jìn)行重懸，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8HB14抗體的體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)：將結(jié)腸癌MC38細(xì)胞以5×105個(gè)/0.1 mL接種于雌性B-hCD40小鼠的右側(cè)皮下，待腫瘤生長(zhǎng)到約100 mm3時(shí)，按腫瘤體積挑選10只小鼠隨機(jī)分組，每組5只，共2組，分別為溶劑對(duì)照PBS組和CD40 Ab(3 mg/kg)組。所有組給藥途徑均為腹腔注射，每周給藥2次，連續(xù)給藥6次。給藥期間和觀察期間每周測(cè)量2次小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積，并記錄測(cè)量值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，動(dòng)物安樂(lè)死，計(jì)算相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率(TGI)。

1.2.9HB14抗體的體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)：挑選9只B-hCD40小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分組，每組3只，共3組，分別為PBS溶劑對(duì)照組、CD40 Ab(20 mg/kg)組和CD40 Ab(1 mg/kg)組。挑選6只C57BL/6 N小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分組，每組3只，共2組，分別為CD40 Ab(20 mg/kg)和CD40 Ab(1 mg/kg)組。所有組給藥途徑均為尾靜脈注射，在第0、3、7、10天給藥，共給藥4次。給藥期間和觀察期間每周測(cè)量2次小鼠體質(zhì)量，并記錄測(cè)量值。第11天取血檢測(cè)血生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST。第14天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，將小鼠放入10%甲醛固定，用于病理HE染色觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 B-hCD40小鼠打靶策略

CD40是一種I型跨膜糖蛋白。小鼠CD40(mCD40)基因位于2號(hào)染色體上，小鼠CD40前體蛋白編碼289氨基酸(aa)，主要由N端信號(hào)肽(19aa)、胞膜外區(qū)(193aa)、跨膜區(qū)(22aa)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)(74aa)組成。人CD40基因位于20號(hào)染色體上，人CD40其前體含有277aa，由N端信號(hào)肽(20aa)、胞膜外區(qū)(193aa)、跨膜區(qū)(22aa)和胞內(nèi)區(qū)(62aa)組成。其中，人CD40蛋白與小鼠CD40蛋白的同源性為61%。本研究中使用人CD40(20aa-192aa)替換小鼠CD4(20aa-192aa)，生成嵌合的CD40蛋白，胞內(nèi)區(qū)為鼠源的蛋白，能正常傳遞細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，不影響正常的小鼠生物活性。利用CRISPER/Cas9基因打靶技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)小鼠CD40基因的sgRNA。5′端sgRNA序列(5′-3′)：GACAAACAGTACCT CCACGA；3′端sgRNA序列(5′-3′)：CGCATCCGG GACTTTAAACC；5′端和3′端的PAM序列分別為5′TGG和3′TGG。在Cas9系統(tǒng)切開(kāi)DNA鏈后通過(guò)同源重組將人CD40片段重組到靶位點(diǎn)上，打靶載體圖譜如圖1所示。同時(shí)制作攜帶人CD40基因片段的打靶載體，與Cas9 mRNA、sgRNA共同顯微注射受精卵，移植到假孕雌性的輸卵管中，獲得F0代小鼠，通過(guò)PCR以及測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性小鼠。

2.2 B-hCD40小鼠雜合子及純合子的構(gòu)建

將陽(yáng)性F0代小鼠和背景鼠(C57BL/6)回交，獲得F1代小鼠，通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。將測(cè)序陽(yáng)性的F1代陽(yáng)性小鼠(1EJ24-29、1EJ24-31、1EJ24-32、1EJ24-36)再進(jìn)行southern雜交驗(yàn)證(圖2)。A探針(也稱5′探針)能夠特異性結(jié)合人CD40基因片段，小鼠鼠尾基因組DNA通過(guò)Spel酶消化后，能被A探針檢測(cè)到，條帶大小為8.8Kb，但是WT的小鼠染色體不能被檢測(cè)到；3’探針設(shè)計(jì)在小鼠CD40基因9號(hào)外顯子下游，小鼠鼠尾基因組DNA通過(guò)Stul酶消化后，WT的小鼠染色體和人源化的染色體都能被檢測(cè)到。獲得F1代southern陽(yáng)性小鼠，將F1代陽(yáng)性小鼠交配，獲得純合的F2小鼠。

圖2 CD40人源化陽(yáng)性小鼠的構(gòu)建

2.3 B-hCD40小鼠人CD40的mRNA及蛋白水平鑒定

反轉(zhuǎn)錄PCR分析顯示人CD40的mRNA在純合人源化小鼠的脾臟中表達(dá)，而在野生型中不表達(dá)。小鼠CD40的mRNA僅在野生型小鼠的脾臟組織中表達(dá)，在純合子小鼠中無(wú)法檢測(cè)到，如圖3A所示。

在野生型小鼠中，小鼠CD40蛋白經(jīng)過(guò)抗鼠CD40抗體檢測(cè)后，41.6%的細(xì)胞表達(dá)小鼠CD40蛋白，而在B-hCD40小鼠中，小鼠CD40蛋白無(wú)表達(dá)。在純合B-hCD40小鼠中，人CD40蛋白經(jīng)過(guò)抗人CD40抗體檢測(cè)后，58.1%的細(xì)胞表達(dá)人CD40蛋白，而在野生型小鼠中，人CD40蛋白無(wú)表達(dá)(圖3B)。

圖3 人CD40在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)情況

2.4 B-hCD40小鼠各淋巴細(xì)胞亞群分布

經(jīng)過(guò)改造后的B-hCD40小鼠的B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分布情況與野生型小鼠保持一致，無(wú)明顯改變(圖4A、圖4B)。兩種小鼠CD4陽(yáng)性細(xì)胞、CD8陽(yáng)性細(xì)胞和Treg細(xì)胞在T細(xì)胞中分布也無(wú)明顯改變(圖4C)。以上結(jié)果共同提示，CD40人源化改造不影響小鼠各淋巴細(xì)胞亞群的分布。

圖4 B-hCD40小鼠脾臟細(xì)胞各淋巴細(xì)胞亞群分析

2.5 CD40 Ab抑制腫瘤生長(zhǎng)情況

在首次給藥后第18天，生理鹽水對(duì)照組腫瘤平均體積為(2 661±350)mm3，CD40 Ab(3 mg/kg)給藥組平均腫瘤體積為(485±195)mm3，TGI為85.8%。相比于溶劑對(duì)照組，CD40 Ab給藥組腫瘤體積顯著減小(P<0.001)(圖5A)。以上結(jié)果提示，B-hCD40小鼠可以作為評(píng)價(jià)CD40抗體藥效的一種有效動(dòng)物模型。在CD40 Ab發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)作用同時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量相比于對(duì)照組增加不是很明顯(圖5B)，我們推測(cè)CD40 Ab作用小鼠后可能對(duì)小鼠自身產(chǎn)生一定毒副作用。

圖5 基于B-hCD40小鼠的CD40 Ab藥效評(píng)價(jià)

2.6 CD40 Ab抗體體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

首次給藥后第2、8和12天，CD40 Ab(20 mg/kg)組小鼠體質(zhì)量與溶劑對(duì)照組相比有明顯降低(圖6A)。首次給藥后第11天，CD40 Ab(20 mg/kg)組小鼠ALT和AST水平顯著升高(圖6B)，提示對(duì)CD40小鼠肝臟產(chǎn)生一定毒性作用。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)小鼠各臟器HE染色結(jié)果顯示(圖6C)，CD40 Ab(20 mg/kg)組小鼠肝臟和腎臟中可以明顯觀察到有炎性細(xì)胞聚集，C57BL/6小鼠各給藥組均沒(méi)有這種現(xiàn)象，表明CD40 Ab對(duì)B-hCD40小鼠肝臟和腎臟產(chǎn)生了毒性作用。以上結(jié)果提示，B-hCD40小鼠可以作為評(píng)價(jià)CD40抗體藥物毒性的一種工具小鼠。

圖6 CD40 Ab抗體的毒性作用

3 討論

B-hCD40小鼠模型可以為在小鼠中驗(yàn)證人單克隆抗體提供一種有效的方法。我們的研究首先構(gòu)建了靶向B-hCD40小鼠模型，將小鼠CD40基因的胞外區(qū)替換為人源組分。B-hCD40小鼠能表達(dá)人源胞外區(qū)和鼠源跨膜區(qū)及鼠源胞內(nèi)區(qū)的嵌合蛋白，保留了小鼠胞內(nèi)蛋白序列，可以最小化影響小鼠胞內(nèi)信號(hào)的傳遞。單克隆抗體CD40 Ab靶向的嵌合蛋白的胞外區(qū)剛好為人源化的蛋白序列。由于嵌合mRNA來(lái)自內(nèi)源性小鼠啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并且改造后的嵌合人/鼠蛋白表達(dá)包含小鼠跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，我們推測(cè)其對(duì)下游信號(hào)傳遞的生理過(guò)程的影響極小。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)鑒定出人CD40在野生型小鼠中沒(méi)有表達(dá)，但在純合子小鼠中觀察到表達(dá)，與野生型小鼠相比，純合子動(dòng)物高水平的表達(dá)人mRNA和蛋白。小鼠CD40在野生型小鼠中表現(xiàn)出高水平的表達(dá)，但在純合子小鼠中沒(méi)有表達(dá)，這也清楚地表明B-hCD40小鼠模型是成功的。

在單克隆抗體的腫瘤免疫治療中，T細(xì)胞活化需要雙重信號(hào)的刺激，首先是T細(xì)胞抗原受體(TCR)特異性識(shí)別MHCI/抗原復(fù)合物產(chǎn)生的第一信號(hào)，同時(shí)需要共刺激分子(如4-1BB-4-1BBL、CD40-CD40 L、CD27-CD27 L和OX40-OX40 L等)活化產(chǎn)生第二信號(hào)[12]。CD40作為一類共刺激分子，和受體CD40 L結(jié)合后激活A(yù)PC細(xì)胞誘導(dǎo)一系列下游信號(hào)通路，介導(dǎo)廣泛的免疫及炎癥反應(yīng)。CD40激動(dòng)劑單克隆抗體在激活A(yù)PC促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫同時(shí)，也可以激活非T細(xì)胞介導(dǎo)的髓系來(lái)源細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[13]。我們成功構(gòu)建B-hCD40小鼠模型后，對(duì)HB 14抗體在這種模型上的藥效和毒性作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示CD40 Ab能夠顯著抑制MC38結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)，并且在發(fā)揮藥效的同時(shí)可能會(huì)對(duì)小鼠肝臟和腎臟產(chǎn)生一定毒副作用。

目前，用于腫瘤藥物開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究的幾種小鼠模型主要包括自發(fā)或誘導(dǎo)的小鼠腫瘤模型、基因工程小鼠模型、人源腫瘤細(xì)胞系異種移植和人源腫瘤異體移植模型等[14]。通過(guò)基因改造獲得的免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠模型由于小鼠免疫系統(tǒng)健全，在評(píng)價(jià)藥效作用同時(shí)也可以用于藥物毒性評(píng)價(jià)，并且由于基因改造獲得的小鼠模型相對(duì)穩(wěn)定，小鼠批間差異較小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較高，對(duì)于藥物臨床前作用評(píng)價(jià)也很有利。我們的研究表明，B-hCD40小鼠可以作為評(píng)價(jià)CD40激動(dòng)劑單克隆抗體藥物臨床前藥效和毒性作用的一種有效動(dòng)物模型。同時(shí)，免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠模型也具有制備周期長(zhǎng)、制備過(guò)程復(fù)雜等特點(diǎn)，這在一定程度上可能會(huì)限制其在疾病基礎(chǔ)研究和藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。