張卉，柴亮聽，盧靜，王玉紅，王常燕，常文亮，景麗

(1.邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，邯鄲 056000；2.邯鄲市第一醫(yī)院檢驗科，邯鄲 056000)

體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI)的受精評估通常在行IVF/ICSI后(18±2)h進行。當(dāng)受精后觀察到2個原核(pronuclei，PN)和2個極體(polar body，PB)時，視為卵母細(xì)胞已受精，但實際工作中有11.3%～20.0%的成熟卵母細(xì)胞在光鏡下沒有受精跡象，稱為未見原核(non-pronuclear，0PN)[1]。雖然在行IVF/ICSI后第2天可以看到一些0PN分裂的卵母細(xì)胞，但歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會實驗室指南[2]并不建議移植這些胚胎。目前，對于0PN來源胚胎的染色體倍數(shù)組成的解釋不是特別明確，行IVF時是否使用0PN來源胚胎一直是一個有爭議的話題。大量的細(xì)胞遺傳學(xué)分析表明，部分0PN來源胚胎為二倍體胚胎且有4.4%～37.2%的0PN來源胚胎可發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚[3-5]。雖然對0PN來源胚胎移植后妊娠的報道很多，但很少有隨訪移植0PN來源胚胎并獲得健康新生兒的文獻報道[6-8]。因此，本研究回顧性分析了2016年12月至2019年12月于邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行凍融單囊胚移植的253個周期患者的臨床資料，為分析0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀，提高胚胎利用率，減少不孕癥夫婦的心理及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)提供了部分臨床依據(jù)，也為臨床移植策略提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年12月至2019年12月于邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行凍融單囊胚移植的不孕癥患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤40歲；(2)IVF中0PN和2PN來源的單囊胚移植周期；(3)轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度>7 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)ICSI或補救ICSI(R-ICSI)周期的所有囊胚；(2)IVF周期中1PN來源囊胚的周期；(3)解凍IVF周期中0PN及2PN來源囊胚未存活的周期。

本研究共納入253個周期。根據(jù)囊胚不同來源分組，分別為0PN囊胚組(n=29)和2PN囊胚組(n=224)。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)及評分：注射HCG(珠海麗珠)約36 h后，取卵母細(xì)胞并行IVF。胚胎培養(yǎng)使用G5序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，置于37℃、6%CO2、5%O2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Cook，澳大利亞)中培養(yǎng)。授精(18±2)h后觀察卵母細(xì)胞的PN及PB數(shù)量，根據(jù)觀察到的PN數(shù)記錄為0PN、1PN、2PN、3PN或多PN；根據(jù)觀察到的PB數(shù)記錄為1PB、2PB或PB碎。以觀察到2PN同時為2PB的胚胎為正常受精胚胎，在受精后第2～3天觀察胚胎卵裂情況，第3天移植或冷凍后將剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)。本中心實施囊胚培養(yǎng)的前提條件是保留第3天冷凍或移植卵裂期胚胎不少于4枚后，剩余卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)。受精后第5～6天觀察囊胚形態(tài)，參照Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)[9]對囊胚期胚胎進行評分，根據(jù)囊胚的擴張程度分為1～6期：1期為早期有腔室囊胚，囊胚腔體積<胚胎總體積的1/2；2期為囊胚腔體積≥胚胎總體積的1/2；3期為囊胚完全擴張，即囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期為囊胚的囊胚腔完全充滿胚胎，透明帶變薄，胚胎總體積變大；5期為正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期為囊胚完全脫出透明帶。根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(inner cell mass，ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophoblast cell，TE)的質(zhì)量進行分級。ICM的評分分為：A級(細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密)、B級(細(xì)胞數(shù)目少，排列松散)和C級(細(xì)胞數(shù)目很少)。TE的評分分為：A級(上皮細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)構(gòu)致密)、B級(上皮細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目少，結(jié)構(gòu)松散)、C級(上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成)。本中心可利用囊胚的定義為：囊胚的擴張度≥3期且ICM和TE評分至少一項優(yōu)于C級。從IVF周期中獲得的可利用0PN或2PN來源囊胚在隨后的解凍周期中行玻璃化解凍并移植。

2.囊胚冷凍及解凍：囊胚冷凍前行激光人工皺縮，采用玻璃化冷凍和解凍試劑盒(Kitazato，日本)，操作步驟按照試劑盒說明書進行。復(fù)蘇后的囊胚進行激光輔助孵化，選擇在遠離ICM的透明帶上切割透明帶的1/4左右，最后將復(fù)蘇后的囊胚移入平衡好的囊胚培養(yǎng)液中，置于37℃、6%CO2、5%O2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Cook，澳大利亞)培養(yǎng)至少2 h，選擇存活的胚胎移植入患者子宮內(nèi)。

3.內(nèi)膜準(zhǔn)備與黃體支持：兩組患者均采用自然周期或人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。自然周期方案：于患者月經(jīng)周期第8～10天開始B超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜，排卵前肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，卵泡破裂后第5天行凍融單囊胚移植。人工周期方案：月經(jīng)第3天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4～10 mg/d，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)40～60 mg/d，第6天行凍融單囊胚移植。移植后繼續(xù)給予黃體支持。

4.妊娠結(jié)局：囊胚移植后14 d檢測血β-HCG，β-HCG≥3 U/L為HCG陽性，移植28 d 后B超檢查可見妊娠囊及原始心管搏動確定為臨床妊娠，孕12周之前的胚胎丟失或妊娠終止為早期流產(chǎn)。

5.隨訪內(nèi)容：電話隨訪妊娠過程、分娩方式、分娩時間、新生兒體重、新生兒性別、新生兒出生狀況及出生時新生兒先天畸形等。

6.觀察指標(biāo)：比較兩組患者的一般情況、β-HCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、新生兒胎齡、早產(chǎn)兒(胎齡<37周的新生兒)比例、新生兒體重、低體重兒(體重<2 500 g的新生兒)比例、新生兒性別比例和重大先天畸形兒(為隨訪期間或出生時出現(xiàn)功能損害或需要手術(shù)矯正的新生兒)等。β-HCG陽性率=β-HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胎齡=囊胚移植后的天數(shù)+19。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者一般情況比較

兩組患者的女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、子宮內(nèi)膜厚度、不孕類型、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、不孕原因比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般情況比較[M(P25，P75)，n(%)]

二、兩組患者的妊娠結(jié)局比較

兩組間β-HCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的妊娠結(jié)局比較(%)

三、兩組患者的新生兒結(jié)局比較

兩組患者的新生兒胎齡、新生兒體重、早產(chǎn)兒比例、低體重兒比例、性別比例及重大畸形兒比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者的新生兒結(jié)局比較[(-±s)，%]

四、多因素線性/Logistic回歸分析妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局

多因素線性/Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)整了女方年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、內(nèi)膜厚度、不孕類型、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、不孕原因等混雜因素后，0PN來源囊胚不影響臨床妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局(P>0.05)(表4、表5)。

表4 0PN來源囊胚對妊娠結(jié)局影響的多因素Logistic回歸分析

表5 0PN來源囊胚對新生兒結(jié)局影響的多因素線性/Logistic回歸分析

討 論

受精是精子進入卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞活化，第二極體釋放，精子頭部解聚，核膜重新形成，雌雄原核向卵母細(xì)胞中心遷移的復(fù)雜過程。雌雄原核的形成通常是同步的，大多數(shù)雌雄原核可在授精后5～20 h出現(xiàn)[10]。我們在臨床工作中觀察卵母細(xì)胞受精情況時，除了正常的2PN受精，還可以觀察到多PN、1PN或0PN發(fā)生卵裂的異常受精情況。多PN常見于多精子受精，此類胚胎有形成多倍體染色體的風(fēng)險，目前不建議繼續(xù)培養(yǎng)，而1PN和0PN的發(fā)生頻率分別為1.6%～7.7%[11]和11.3%～20%[1]。受精時表現(xiàn)為0PN，后期發(fā)生卵裂的胚胎可能源自于正常受精、異常受精或孤雌激活[12]，因此，0PN并不總是受精失敗的標(biāo)志，一定比例的0PN來源胚胎能夠發(fā)育形成與2PN來源胚胎形態(tài)相似的胚胎。Destouni 等[6]利用全基因組單倍體分型研究0PN來源胚胎的二倍體染色體發(fā)現(xiàn)，在0PN來源胚胎中雙親二倍體率為75.5%。Lim 等[13]發(fā)現(xiàn)在合子期丟棄的66%的0PN來源胚胎是二倍體。Manor 等[10]利用熒光原位雜交技術(shù)對0PN來源胚胎的染色體進行分析時發(fā)現(xiàn)，57%的0PN來源胚胎有正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)。以上研究表明，0PN來源二倍體胚胎的起源不是孤雌激活，而是沒有觀察到PN的正常受精卵。由于0PN來源胚胎和2PN來源胚胎的整倍體率相似，因此它們在IVF中的應(yīng)用需要進一步的討論[6]。由于PN在行ICSI后6～29 h均可能出現(xiàn)[14]，所以在觀察受精時，沒有PN的卵母細(xì)胞可能實際上是含有2PN的胚胎。

0PN來源胚胎源于正常受精、異常受精或孤雌激活是很難確定的。有研究指出，卵裂期胚胎發(fā)育至融合階段形成囊胚，提示胚胎基因組激活，能夠發(fā)育至囊胚階段的胚胎染色體異常率較低，因此，可以通過延長培養(yǎng)時間篩選異常受精的0PN來源胚胎[15]。來源于正常受精的0PN來源胚胎，其囊胚形成率較高；而來源于異常受精和孤雌激活的0PN來源胚胎，其囊胚形成率很低[16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，0PN卵裂期胚胎的種植率低于2PN卵裂期胚胎，但當(dāng)移植囊胚期胚胎時，0PN來源囊胚和2PN來源囊胚的著床率相似，本研究報告結(jié)果與之相符。

本研究結(jié)果顯示，行單個凍融囊胚移植時，0PN來源囊胚和2PN來源囊胚的β-HCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無顯著差異(P>0.05)；兩組間新生兒的胎齡、早產(chǎn)兒比例、新生兒體重及低體重兒比例比較均無顯著差異(P>0.05)；雖然0PN囊胚組新生兒男性比例相對較低，但與2PN囊胚組比較無顯著差異(P>0.05)；兩組均無重大畸形兒出生。以上研究數(shù)據(jù)進一步支持對于特殊的患者不應(yīng)該丟棄0PN來源胚胎，特別是卵巢反應(yīng)差或反復(fù)移植失敗的患者，最好將0PN卵裂期胚胎培養(yǎng)到囊胚期進行移植或冷凍，從而為這些患者提供實現(xiàn)妊娠的機會。

本研究的一個優(yōu)點是本研究只納入行單囊胚移植的病例，這種做法排除了多胚胎移植產(chǎn)生的潛在影響，如多胚胎移植導(dǎo)致的雙胎妊娠與流產(chǎn)率升高，雙胎消失綜合征導(dǎo)致的單胎新生兒低體重發(fā)生率升高[18]。因此，單胚胎移植在流產(chǎn)率和新生兒體重方面可能比多胚胎移植能夠得到更準(zhǔn)確的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。但是，我們的研究也有一定的局限性：首先，納入的0PN囊胚組的移植周期數(shù)較少，出生的新生兒數(shù)量也相對較少，因此，關(guān)于妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的結(jié)果需要更多的病例來進一步證實；其次，由于目前臨床工作中大多數(shù)IVF評估均在不使用時差系統(tǒng)的情況下進行[19-20]，因此本研究沒有應(yīng)用時差技術(shù)對受精狀態(tài)進行評估；最后，本研究沒有對胚胎行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)。

綜上所述，在無2PN來源胚胎的情況下，IVF中形態(tài)正常的0PN來源囊胚有較好的發(fā)育潛能，在病人充分知情同意后可考慮移植0PN來源胚胎，但需對臨床妊娠過程及結(jié)局進行嚴(yán)密隨訪。