于坤弘，李子越，董天玉，羅淑年,3，江連洲，于殿宇，王立琦

1.九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司 (哈爾濱 150010) 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 (哈爾濱 150030) 3.哈爾濱商業(yè)大學(xué) (哈爾濱 150028)

由于黑龍江地區(qū)氣候及土壤等條件的影響,大豆中青豆的含量較多，并且青豆中的磷脂含量較高，尤其是非水化磷脂，所以在精煉過(guò)程需要對(duì)磷脂含量進(jìn)行控制。傳統(tǒng)水化脫膠工藝只能夠脫除水化磷脂，酸法脫膠和特殊脫膠雖然可以脫除部分非水化磷脂，但是應(yīng)用于非水化磷脂含量高的大豆油時(shí)效果不是很理想，不能夠滿足后續(xù)精煉工藝的要求，且能量消耗較大，中性油損失多，而酶法脫膠是利用磷脂酶將非水化磷脂水解為溶血性磷脂，再采用水化方法脫除，該工藝因其高效性和環(huán)保性而受到越來(lái)越多的重視[1-2]。

磷脂酶主要有磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。在酶法脫膠過(guò)程中通常使用的是A型和C型磷脂酶[3]。磷脂酶A1能夠特異性酶解磷脂中Sn-1位上?；鵞4]。水解產(chǎn)物溶血磷脂相較于一般磷脂具有更好的親水性，在油脂水化過(guò)程中可以快速的吸水膨脹，從而使非水化磷脂從油脂中脫除。

然而，在使用酶脫膠技術(shù)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，磷脂酶的純度以及酶解終點(diǎn)難以判斷，使油脂酸價(jià)升高，酶解效率低，因此在油脂精煉過(guò)程中需要不斷檢測(cè)和調(diào)控大豆油中的磷脂含量。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行化學(xué)分析，檢測(cè)速度較慢、成本較高、易受到人為和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的影響、易污染環(huán)境，更不利于在線檢測(cè)和調(diào)控[5]。

電化學(xué)分析技術(shù)由于具有快速檢測(cè)、結(jié)果準(zhǔn)確和易于實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，近年來(lái)在食品安全領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Yang等[8]成功的將膽堿氧化酶(ChOx)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)固定在碳糊電極上用于人血清樣品中PC的檢測(cè)，Li等[9]使用聚吡咯修飾電化學(xué)傳感器電極來(lái)測(cè)定游離脂肪酸的含量，與傳統(tǒng)滴定法相比，線性電位伏安法無(wú)需預(yù)處理，且靈敏度和準(zhǔn)確度更高；王麗然等[10]以殼聚糖為固定材料制備了HRP傳感器，用于測(cè)定植物油過(guò)氧化值，研究表明，傳感器法在靈敏度和準(zhǔn)確度優(yōu)于國(guó)標(biāo)碘量法。

本項(xiàng)目為在油脂加工生產(chǎn)過(guò)程中達(dá)到對(duì)磷脂含量的快速檢測(cè)和實(shí)施調(diào)控，采用絲網(wǎng)印刷電極(SPE)，用交聯(lián)劑將HRP和ChOx依次交聯(lián)到修飾SPE表面，制備雙酶SPE。并將所制備的雙酶SPE用于生物精煉大豆毛油中磷脂含量的檢測(cè)，從而判斷生物精煉反應(yīng)的進(jìn)程，以保證生物酶的適度精煉，減少化學(xué)試劑的使用，提高了大豆油脂產(chǎn)品的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

一級(jí)大豆油，九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；磷脂酶D(168 U/mg)、膽堿氧化酶(18 U/mg)、辣根過(guò)氧化物酶(265 U/mg)、磷脂酰膽堿(99%)，上海源葉生物有限公司；殼聚糖，分析純，鄭州東達(dá)化工產(chǎn)品有限公司；戊二醛(0.5 wt%)，生物試劑，上海五聯(lián)化工廠；硫堇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；絲網(wǎng)印刷電極(絲網(wǎng)印刷電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極)，EI3002，南京中科電極有限公司；磷脂酶A1(PLA1)，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司，酶活性8 420 U/mL；Triton-X100，上海西唐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電化學(xué)工作站，CHI660D型，上海辰華儀器公司；高效液相色譜儀，Waters1525型，美國(guó)waters公司；Φ 1 300 mm × 1 500 mm酸反應(yīng)罐；3個(gè)Φ 2 000 × 2 500 mm酶反應(yīng)罐；PX70型自清式離心機(jī)，進(jìn)油量3 500 kg/h，轉(zhuǎn)數(shù)7 000 r/min；脫臭塔200 t/d。

1.3 樣品處理

以大豆粉末磷脂、磷脂酶D及1%Triton-X100作為乳化劑，加入一定量至一級(jí)大豆油中，制備磷脂含量不同的混合大豆油樣品，用于驗(yàn)證雙酶SPE對(duì)卵磷脂(PC)的電響應(yīng)性和含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

利用制備的雙酶SPE和高效液相色譜對(duì)制備的大豆毛油卵磷脂含量以及生產(chǎn)車(chē)間中脫膠油進(jìn)行檢測(cè)。大豆毛油經(jīng)浸出車(chē)間水化脫膠后，磷脂含量為5 460 mg/L，酸值(KOH)為2.8 mg/g，過(guò)氧化值4.7 mmol/kg，水分及揮發(fā)物0.97%。

1.4 雙酶SPE的制備

取濃度為4 U的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶液6 μL滴涂到殼聚糖修飾過(guò)的SPE表面，滴加5 μL戊二醛于電極表面，37 ℃下交聯(lián)30 min，然后用PBS緩沖液清洗電極表面。再取3 μL殼聚糖/乙酸溶液滴于HRP電極表面，靜止干燥。再在SPE上滴加10 μL濃度為3 U的膽堿氧化酶(ChOx)，待表面成薄膜狀時(shí)滴加5 μL戊二醛于電極表面，37 ℃下交聯(lián)30 min，得到雙酶SPE。其反應(yīng)機(jī)理如下所示：

1.5 測(cè)定方法

水分及揮發(fā)物含量的測(cè)定，參照GB/T 5528—2008；不溶性雜質(zhì)含量的測(cè)定，參照GB/T 15688—1985；酸值的含量，參照GB/T 5530—2005；過(guò)氧化值含量的測(cè)定，參照GB/T 5538—2005測(cè)定；三氯丙醇酯含量的測(cè)定，參照AOCS Cd 29a-13，并測(cè)定油脂中反式脂肪酸的含量[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂循環(huán)伏安曲線

在電位掃描范圍為-0.6～0.8 V，掃描速度為0.01 V/s的條件下，通過(guò)循環(huán)伏安法掃描，得到磷脂濃度不同的大豆油樣品的循環(huán)伏安曲線，如圖1所示。

圖1 不同濃度磷脂的循環(huán)伏安曲線

在反應(yīng)過(guò)程中，PC經(jīng)PLD酶解后獲得膽堿，膽堿在ChOx催化作用下生成H2O2，H2O2再被固定的HRP還原，進(jìn)而氧化態(tài)的HRP與溶液中電子媒介體硫堇之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，最終TH+在電極表面得到電子被還原，從而產(chǎn)生了還原電流，實(shí)現(xiàn)了雙酶SPE對(duì)PC的電化學(xué)響應(yīng)。

2.2 雙酶SPE檢測(cè)大豆毛油中PC的含量

利用雙酶SPE檢測(cè)所制備的磷脂含量不同的混合大豆油樣品，在電壓-0.5～0.5 V范圍內(nèi)，對(duì)采集的原始電化學(xué)數(shù)據(jù)分別利用Savitzky-Golay平滑濾波和db N系列小波進(jìn)行去噪處理，然后再分別利用還原峰電流與磷脂含量直線擬合、主成分回歸、偏最小二乘回歸和支持向量機(jī)回歸4 種方法建立校正回歸模型。采用方波伏安法(SWV)和HPLC檢測(cè)大豆毛油中PC含量、RSD及加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)大豆毛油中PC含量的檢測(cè)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，所制備的磷脂含量不同的混合大豆油樣品中PC的含量分布較合理，具有一定梯度。對(duì)雙酶SPE進(jìn)行方波伏安掃描，測(cè)定大豆毛油中PC的含量，獲得各組分的加標(biāo)回收率在96.71%～106.19%之間，都控制在90%～110%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，說(shuō)明采用SWV測(cè)定大豆毛油中PC含量的可行性高。在油脂脫膠車(chē)間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)大豆毛油中磷脂含量，在電壓-0.5～0.5 V范圍內(nèi)，用SWV和HPLC檢測(cè)大豆毛油中磷脂含量、RSD及加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 檢測(cè)大豆毛油中磷脂含量的檢測(cè)結(jié)果

由表2可以看出，對(duì)雙酶SPE進(jìn)行方波伏安掃描，測(cè)定大豆毛油中磷脂的含量，獲得各組分的加標(biāo)回收率在96.42%～106.30%之間，都控制在90%～110%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，說(shuō)明采用SWV測(cè)定大豆毛油中磷脂含量的可行性高，可以滿足實(shí)際檢測(cè)要求。

2.3 大豆毛油生物脫膠效果

將油脂加熱至55 ℃，通過(guò)定量泵向純水化脫膠后的大豆毛油中加入45%的檸檬酸溶液，經(jīng)高速混合后，加入磷脂量的3%熱軟水經(jīng)靜態(tài)混合后，加入 NaOH 溶液及30 mg/kg 油的PLA1，經(jīng)高速混合后將油泵入酶反應(yīng)罐攪拌反應(yīng)2.5～3.0 h，經(jīng)離心分離得到酶法脫膠油，利用電化學(xué)生物傳感器，對(duì)樣品的磷脂含量進(jìn)行快速檢測(cè)，當(dāng)磷脂含量低于500 mg/L后，進(jìn)入下一工序。經(jīng)脫酸、脫色、脫臭等得到精煉后大豆油其質(zhì)量如表3所示。

表3 精煉大豆油主要指標(biāo)

從表3中可以看出，大豆油中TFAs為0.23%，縮水甘油酯97 μg/kg，三氯丙醇酯甾醇213 mg/kg，符合一級(jí)大豆油標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明生物精煉及適度加工減少了化學(xué)精煉過(guò)程中的化學(xué)試劑使用量，生物精煉提高油脂精煉率，電化學(xué)生物傳感器可瞬時(shí)檢測(cè)大豆毛油中的殘磷量，保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

3 結(jié)論

將膽堿氧化酶(ChOx)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)固定在絲網(wǎng)印刷電極上，開(kāi)發(fā)出電化學(xué)生物傳感器，可瞬時(shí)檢測(cè)大豆毛油中的殘磷量，采用雙酶SPE檢測(cè)大豆毛油中PC、磷脂的含量，相關(guān)性較好，電化學(xué)生物傳感器替代實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)殘磷量的方法，實(shí)時(shí)控制酶反應(yīng)終點(diǎn)，避免了生物酶的過(guò)度酶解，減少了化學(xué)試劑的使用量，避免了磷脂高溫?zé)峋圩兎磻?yīng)。經(jīng)后續(xù)適度加工后，大豆油質(zhì)量達(dá)到一級(jí)大豆油的標(biāo)準(zhǔn)，提高了產(chǎn)品的核心技術(shù)含量，符合我省深度開(kāi)發(fā)“原字號(hào)”延伸傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)鏈條的要求。