蔡高占，張汝美，王亞琴，黃國鋒，李俊婷，劉小濤，姚文龍，周 浩，李建斌，仲躋峰＊

1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100

2 寧波市農(nóng)業(yè)村局，浙江寧波 315033

3 余姚市陸埠鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江余姚 315420

4 寧波市鄞州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江寧波 315100

5 寧波市牛奶集團(tuán)有限公司，浙江寧波 315033

6 寧波市鄞州瞻岐鷹山牛場，浙江寧波 315100

0 引言

人類第一個試管嬰兒誕生于40 年前，該技術(shù)后來應(yīng)用于奶牛等其他物種。最初，對奶牛進(jìn)行IVF也是用于不孕癥的治療。盡管IVF技術(shù)在治療病理性不孕上取得一些成功，但該方法的發(fā)展和應(yīng)用主要集中在改善遺傳選擇和減少世代間隔方面。這些方法的商業(yè)應(yīng)用得益于40 年的研究，主要是用屠宰場獲得的卵母細(xì)胞和冷凍精液（精子），形成了一個非常強(qiáng)大的模型，可用于奶牛和人類的臨床應(yīng)用。目前針對不同物種的IVF已經(jīng)發(fā)表了幾篇優(yōu)秀的綜述，主要集中在技術(shù)的早期階段、奶牛產(chǎn)業(yè)方面的應(yīng)用以及奶牛使用IVF技術(shù)的相關(guān)問題[1]。本文總結(jié)了過去40 年奶牛IVF的重要步驟、存在的誤區(qū)以及取得的進(jìn)展（圖1）。

圖1 奶牛IVF發(fā)展史

1 最初的挑戰(zhàn)（1980—1990年）

盡管生殖生物學(xué)家從20世紀(jì)50年代開始對嚙齒類動物進(jìn)行IVF試驗，但1978年世界首例試管嬰兒Louise Brown的誕生還是引起了人們極大興趣，同時也加大了對奶牛等其他大型哺乳動物IVF的研究力度。Robert Edwards[2]在一篇文章中對20世紀(jì)促進(jìn)IVF發(fā)展的杰出工作進(jìn)行了詳細(xì)的回顧，他是60年代觀察奶牛和其他哺乳動物未成熟卵母細(xì)胞的先驅(qū)，并因?qū)VF發(fā)展做出的貢獻(xiàn)于2010年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。

因為人類第一個試管嬰兒出生的程序方案中涉及到成熟卵子的回收，所以最初的努力也集中在通過剖腹手術(shù)和腹腔鏡從奶牛身上獲得成熟卵子。Benjamin Brackett小組[3]通過腹中部手術(shù)來獲得卵母細(xì)胞并將胚胎移植到輸卵管中，成功培育出了世界上第一個試管犢牛。用腹腔鏡回收卵母細(xì)胞，然后將兔子輸卵管中孵育7 天后的囊胚轉(zhuǎn)移到子宮，這一研究花了4 年多的時間。使用腹腔鏡回收卵母細(xì)胞為使用IVF治療不孕癥提供了可能，并為該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用開辟了道路。

最初的（1980—1990年）10 年里，腹腔鏡是臨床應(yīng)用IVF治療奶牛不孕的首選技術(shù)，后來被超聲所取代。肝素對奶牛精子體外獲能具有刺激作用，有助于提高受精率和成功率[4]，這也部分解釋了腹腔鏡回收卵母細(xì)胞會取得巨大成功的原因，因為在奶牛上使用的是60 cm腹腔鏡，為了防止卵母細(xì)胞在腹腔鏡中凝結(jié)，需要在針狀沖洗液中使用抗凝劑。肝素作用的發(fā)現(xiàn)是偶然的，直到兩年后當(dāng)John Parrish[5]發(fā)表研究成果時，人們才明白這一點(diǎn)。肝素雖然不是真正存在于輸卵管中，但可以模仿一些卵泡液成分，比如蛋白多糖。而在卵母細(xì)胞方面的挑戰(zhàn)是尋找最佳培養(yǎng)條件，Robert Edwards[6]已經(jīng)證明了卵母細(xì)胞在體外能夠自動恢復(fù)減數(shù)分裂。事實上，大多數(shù)實驗室仍使用Neal First實驗室開發(fā)的添加有血清、促卵泡激素（FSH）和雌二醇的TCM-199進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM），用Tyrode-Lactate培養(yǎng)基進(jìn)行精子洗滌和精子/卵子共孵育。而胚胎培養(yǎng)基在起初的10 年里被改進(jìn)過多次，至今仍然在持續(xù)改善，其挑戰(zhàn)是，胚胎在輸卵管中發(fā)育的最初幾天以及胚胎代謝對基因組激活前后過渡的適應(yīng)。事實上，奶牛IVF的最初成功是通過胚胎在家兔或綿羊輸卵管中的短暫孵化而獲得的。最終，輸卵管細(xì)胞的共培養(yǎng)取代輸卵管的孵育是奶牛胚胎通過8-細(xì)胞阻滯的要求。因此，在從單細(xì)胞胚胎到囊胚的發(fā)育過程中，培養(yǎng)基的組成在胚胎基因組激活時發(fā)生了改變，這是一種與人類一樣的順序和方法，在這一過程中，培養(yǎng)基的組成發(fā)生了2～3 次改變[7]。理想培養(yǎng)基最優(yōu)組分的逐步完善始于對輸卵管環(huán)境的分析和合成輸卵管液（SOF）的制備（SOF被迅速采用），補(bǔ)充血清或牛血清白蛋白（BSA），最終還是補(bǔ)充了特定的氨基酸，使單細(xì)胞胚胎能夠在合成或半合成BSA培養(yǎng)基條件下發(fā)育到囊胚。盡管在血清存在的情況下，單一培養(yǎng)取得了一些成功，但仍然令人困惑的是，在某種程度上奶牛的獨(dú)特之處在于對群體培養(yǎng)的要求。雖然一些機(jī)械條件諸如微流體、非常小的培養(yǎng)液滴或使用微井方法來減少自分泌因子的分散，但這些因子還沒有被確認(rèn)。

2 IVM的成就（1990—2000年）

因為極少有關(guān)于用活體卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF的報道，所以使用屠宰場的卵巢獲得卵母細(xì)胞，成為一個非?；钴S的研究領(lǐng)域。眾所周知，卵母細(xì)胞成熟過程與卵泡不同，后者比前者更容易在體外繁殖。愛爾蘭的I.Gordon團(tuán)隊[8]和美國Neal First[9]在測試卵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件方面是最活躍的。在大多數(shù)培養(yǎng)條件下，卵母細(xì)胞的核成熟是完全自動的；24 h內(nèi)，II期卵母細(xì)胞的成熟率超過85%。因此，早在20世紀(jì)80年代末，利用屠宰場材料，一次試驗獲得數(shù)百個胚胎是完全有可能的。

與其他物種相比，奶牛和豬的卵母細(xì)胞來源幾乎是不受限制的，這有助于開發(fā)更好的技術(shù)和培養(yǎng)條件。其他物種的進(jìn)展就比較慢，如馬或者寵物；馬IVF仍然受到精子不能在體外受精而需要向卵母細(xì)胞中注射精子的限制[10]；而寵物IVF的成功率也受到季節(jié)和寵物自身生理特性的影響。

在使用屠宰場卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎時，發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)基會影響后代的表型。最初，在綿羊身上觀察到大量后代綜合癥，后來在奶牛上，發(fā)現(xiàn)還與受精后培養(yǎng)基中的血清有關(guān)。該現(xiàn)象在本質(zhì)上是表觀遺傳，當(dāng)胚胎通過克隆產(chǎn)生時，無論是與無核卵母細(xì)胞融合的囊胚還是與體細(xì)胞核融合的囊胚，該現(xiàn)象都會加劇。這種表型的發(fā)生率在現(xiàn)在也很難估計，隨著妊娠期的延長，可能是輕微的，也可能是極端的，比如伴有小牛體重異常和胎盤異常造成的死胎。在巴西的一次大型手術(shù)中，通過超聲引導(dǎo)抽吸卵巢獲得卵母細(xì)胞，而無需激素刺激供體；最近一項基于15 000 個新生犢牛（人工授精作為對照組）的調(diào)查顯示，IVF的小牛出生體重平均增加了1 kg。

多年來，人們一直懷疑合成的培養(yǎng)基是否是限制卵母細(xì)胞發(fā)育能力的主要原因，盡管合成培養(yǎng)基可以一直培養(yǎng)到囊胚期。事實上，1990—2000年，除了引進(jìn)新型孵化器、降低氧分壓外，還添加了數(shù)百種不同的產(chǎn)品、細(xì)胞因子、生長因子、抗氧化劑，但卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚期的平均成功率一直在30%～40%。這些條件中很少有經(jīng)過體內(nèi)轉(zhuǎn)移測試的。

奶牛屠宰時，從其卵巢中抽取所有卵泡獲得的卵母細(xì)胞-卵丘復(fù)合體的形態(tài)變化很大，在奶牛體內(nèi)，卵泡主要在FSH的影響下呈波浪狀生長。21 天的發(fā)情周期可包括有2～3 個生長波，每個生長波都可形成1 個9 mm以上的優(yōu)勢卵泡。當(dāng)FSH開始升高時，最大的卵泡可能成為優(yōu)勢卵泡，而較小的卵泡將在FSH的作用下生長幾天，然后隨著FSH水平下降而開始閉鎖過程。這種現(xiàn)象從青春期到死亡，甚至在懷孕期間都有發(fā)生。因此，如果在屠宰時隨機(jī)采集卵巢，大多數(shù)卵泡將在3～9 mm之間，并且它們含有可用于IVM-IVF的卵母細(xì)胞群。從8 mm卵泡開始，尺寸的影響變得更加重要；但即使卵母細(xì)胞來自更大的卵泡，也不能保證成功。由于閉鎖過程是漸進(jìn)的并且需要時間，所以在FSH降低時，卵巢中大約1/3的卵泡將處于FSH依賴生長階段，1/3將處于平臺階段，另外1/3將在閉鎖階段[11]。這種情況反映在從這些卵泡中恢復(fù)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的形態(tài)上，并與結(jié)果部分相關(guān)。一個非常致密和明亮的卵丘表明，原始卵泡處在生長階段或卵母細(xì)胞沒有完全發(fā)育。卵丘的早期擴(kuò)張與平臺期有關(guān)，其結(jié)果較好，但仍遠(yuǎn)未達(dá)到100%。排卵前卵泡的卵母細(xì)胞有時表現(xiàn)出更高的發(fā)育潛能，但由于優(yōu)勢卵泡沒有全部排卵，大多數(shù)在閉鎖過程中消失，并且觀察到質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象。

3 動物預(yù)處理的改進(jìn)（2000—2010年）

事實上，在卵泡生長階段，F(xiàn)SH的刺激顯著降低了卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，而抽吸前2～3 天FSH的停止刺激，創(chuàng)造了一個促黃體生成素（LH）提供生長的窗口，使得大于9 mm的卵泡生長為具有很高發(fā)育能力的卵母細(xì)胞成為可能。隨后的試驗證明培養(yǎng)基的性能優(yōu)良，卵母細(xì)胞數(shù)量合適，囊胚率可達(dá)80%以上。令人驚訝的是，在這些試驗中還注意到，與屠宰后立即抽取的卵母細(xì)胞相比，卵巢在正常體溫溫度下運(yùn)輸和保存之后，抽取的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力有所提高。這種現(xiàn)象與LH條件的誘導(dǎo)有關(guān)，與RNA分子從卵丘轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞有關(guān)。這些結(jié)果促進(jìn)開發(fā)了一種在卵母細(xì)胞抽吸前處理奶牛的新方案。該方案是在FSH刺激下產(chǎn)生一批優(yōu)勢卵泡，并繼續(xù)刺激直到大多數(shù)卵泡達(dá)到LH受體出現(xiàn)的階段，然后模擬體內(nèi)環(huán)境，即卵泡在沒有FSH但有基礎(chǔ)LH的情況下繼續(xù)生長和分化。此時，卵泡生長模式從總顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞數(shù)量增加的高有絲分裂期轉(zhuǎn)變?yōu)榈揭后w體積累而膨脹的低有絲分裂期。從IVF后觀察到的囊胚率來看，F(xiàn)SH后期與卵母細(xì)胞質(zhì)量的提高有關(guān)。然而，根據(jù)這些觀察結(jié)果，尚不清楚FSH在整個排卵過程中是否會保持這種能力，或者如果排卵被阻止，卵母細(xì)胞質(zhì)量是否會隨著卵泡進(jìn)入閉鎖而下降[12]。

為了進(jìn)一步提高對FSH中止對卵母細(xì)胞質(zhì)量影響的理解，Nivet[13]建立了一種刺激方案，以評估滑行時間對囊胚率的影響。方案具體為，6 頭奶牛接受相同的刺激，接著進(jìn)行4 次不同的滑行（在每頭奶牛中），然后進(jìn)行卵母細(xì)胞抽吸、IVF和培養(yǎng)。

結(jié)果顯示，44 h、68 h的滑行時間產(chǎn)生的胚胎多于20 h；92 h滑行時間產(chǎn)生的胚胎少于44 h、68 h的，但結(jié)果差異不顯著，說明較長的滑行時間優(yōu)于較短的滑行時間。在這些試驗中，一些動物產(chǎn)生的卵母細(xì)胞，囊胚率可達(dá)到100%。明確地表明，當(dāng)卵母細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)良時，培養(yǎng)條件并非限制因素。此外，從卵母細(xì)胞、卵丘、顆粒細(xì)胞三個部分獲得組織樣品，有助于了解在最終轉(zhuǎn)化過程中所發(fā)生的生理變化[14]。

在一篇關(guān)于IVF的局限性的論文中，Patrick Lonergan表示，“有相當(dāng)多的證據(jù)表明，原始卵泡對卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力有顯著的影響，一旦從卵泡中取出卵母細(xì)胞，其發(fā)育能力就會受到限制”[15]。因此，在卵母細(xì)胞抽吸之前的預(yù)處理卵泡仍有很大的改善可能。

4 基因組效應(yīng)（2010—2020年）

該部分將討論兩個方面的基因組革命：第一，使用轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)工具對IVF產(chǎn)生的卵泡、卵母細(xì)胞和胚胎進(jìn)行基因組分析；第二，基因組選擇對奶牛IVF的影響。

從IVF的早期開始，體外成熟的卵母細(xì)胞及體外產(chǎn)生的胚胎同體內(nèi)相比外觀和行為明顯不同。比如，與體內(nèi)胚胎相比，體外產(chǎn)生的胚胎植入能力差，對冷凍保存更敏感。隨著基因組學(xué)工具的發(fā)展，從單個細(xì)胞到囊胚階段分析胚胎的能力為體內(nèi)和體外比較提供了一個新的角度。另外，微陣列技術(shù)或RNAseq技術(shù)可以對不同條件下培養(yǎng)的胚胎與體內(nèi)胚胎進(jìn)行對照比較。下文提到的大多數(shù)研究和所使用的條件在加拿大胚胎基因網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)站上均有介紹。

Tesfaye通過比較體內(nèi)和體外交替培養(yǎng)的胚胎的基因表達(dá)，分析了每個發(fā)育階段（IVM、受精、早期卵裂、MET桑椹胚和囊胚）的基因表達(dá)情況，獲得了全面的數(shù)據(jù)；結(jié)果表明，胚胎在4-細(xì)胞和桑葚胚階段對體外條件特別敏感。然后，同一組分析了從體外和體內(nèi)不同時期的不同組合中獲得的囊胚的DNA甲基化，以證明隨著體外時間的推移，不同甲基化區(qū)域（DMR）逐漸增加。培養(yǎng)條件也會影響轉(zhuǎn)錄組，而特定數(shù)量的糖、脂類或活性氧的存在會導(dǎo)致基因表達(dá)的變化和DNA甲基化[16]。這些工具顯然非常敏感，但觀察到的差異是可以部分預(yù)期的，因為體外環(huán)境永遠(yuǎn)不會與體內(nèi)完全相似。觀察到的變化是適應(yīng)這種不同環(huán)境的一部分，體外生產(chǎn)的胚胎總是與體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎有所不同。

不足為奇的是，IVF對妊娠率的影響很小，盡管與人工授精或體內(nèi)胚胎移植相比，體外受精胚胎會造成更多的胚胎的和胎兒的損失；最近一些出生后的表型被描述，但更多的是有性生殖的精子和受體，而不是IVF本身。

在所有研究的物種中，通過IVF獲得的后代與自然受孕的后代都有些不同?！督】蹬c疾病的發(fā)展起源》雜志最近的一期特刊報道了人工生殖技術(shù)對包括奶牛在內(nèi)的許多物種的影響[17]。盡管血清效應(yīng)在90年代就已經(jīng)被知曉，而且到目前為止已經(jīng)有數(shù)以百萬計的健康犢牛和人類嬰兒出生，但是表觀遺傳效應(yīng)仍然令人擔(dān)憂。這也需要進(jìn)行更多的研究，以便更好地衡量、跟蹤和了解對其成年后健康潛在的影響。

5 基因組選擇

2010年初開始使用基因組學(xué)工具選擇最有價值的個體，對特定品種進(jìn)行快速修飾。雖然基因組選擇的目標(biāo)與表型分析相似，但在囊胚階段獲得信息的能力提高了遺傳進(jìn)展的速度?；蚪M學(xué)選擇對構(gòu)成下一代的動物所需特征的精確識別，使得對這種新的人工繁殖技術(shù)的需求迅速增加，用以快速選擇和繁殖具有所需特征的動物。最初，選擇已驗證的公牛（5 年及以上）和已驗證的母牛（3 年及以上）進(jìn)行IVF。但現(xiàn)在，隨著出生后不久的基因組分析，公牛的遺傳價值立即被知曉，一旦精液能夠生產(chǎn)出來，公牛就可以被選為IVF的父本供體，母牛也如此。不同的是，現(xiàn)在可以在性成熟前采集卵母細(xì)胞，成功率相對較高。這正在推動全球幾個IVF實驗室的發(fā)展。在過去的（2010—2020年）10 年里，體外受精產(chǎn)生的胚胎數(shù)量不斷增加，繼南美肉牛行業(yè)移植了數(shù)百萬個胚胎之后，現(xiàn)在利用IVF產(chǎn)生的奶牛胚胎正在迅速增長。使用IVF的另一個誘因是可以在體外使用性控精液，這使得一些公牛在每批胚胎中使用更少的精液，從而使其更經(jīng)濟(jì)。冷凍IVF胚胎的可能性也為進(jìn)行胚胎活檢如進(jìn)行基因組分析和選擇最佳的移植組合打開了大門。突然之間，所有用于IVF過程優(yōu)化的工作，都以一個非常有效的程序達(dá)到高潮，以更快地提高基因組價值。IVM、性控精液IVF、合成培養(yǎng)基、活檢和冷凍保存，每一步都必須幾乎完美的完成，才能形成一條高效的通路。由于許多步驟在技術(shù)上是復(fù)雜的，并且對操作人員或環(huán)境非常敏感，因此，其商業(yè)化進(jìn)程仍有挑戰(zhàn)。

6 IVF的未來

當(dāng)然，IVF不會很快從動物選擇工具箱中消失，尤其是在前面列出的優(yōu)點(diǎn)下，比如使用性控精液和在囊胚階段進(jìn)行基因組選擇。新的方法，如形態(tài)動力學(xué)、使用基因組或較小的侵入性技術(shù)（如游離DNA）進(jìn)行非整倍體篩選，可能在奶牛上試用，以提高妊娠率。

此前，IVF技術(shù)有助于胚胎發(fā)育和體細(xì)胞核移植的研究，以及用于基因選擇和修飾的研究等?，F(xiàn)在，可以預(yù)見CRISPRCas-9相關(guān)技術(shù)可以同樣使用IVF上，這些技術(shù)將允許精確的基因組編輯甚至表觀基因組編輯。事實上，在原核階段獲得胚胎的能力對于減少鑲嵌現(xiàn)象和提高基因組編輯的成功率十分重要[18]。

7 結(jié)論

在過去的40 年里（1980—2020年），奶牛IVF已經(jīng)從一種治療不育的試驗程序演變成了許多品種的基因組加速器。在培養(yǎng)、冷凍保存、卵母細(xì)胞制備和實驗室環(huán)境方面的進(jìn)展使數(shù)百萬只珍貴動物的生產(chǎn)成為可能。一些與某些后代的表型相關(guān)的問題仍然需要更多的研究來更好地了解體外培養(yǎng)7 天的影響，奶牛IVF技術(shù)已經(jīng)成熟到與人類具有相似的規(guī)模，而且可能會持續(xù)幾十年。