程秋駱， 劉 柳， 白長川， 叢慶偉， 朱 英

1 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肝病中心， 遼寧 大連 116011; 2 大連醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧 大連 116044； 3 大連市中醫(yī)醫(yī)院 中醫(yī)科, 遼寧 大連 116013

肝癌是世界主要高發(fā)癌癥，70%～90%的病理類型為肝細(xì)胞癌(HCC)[1]，是癌癥導(dǎo)致死亡的第二大常見原因[2]。大多數(shù)HCC患者在臨床Ⅲ或Ⅳ期才被診斷，而中晚期肝癌除索拉非尼、免疫檢測(cè)點(diǎn)治療以及經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞外的可用治療手段非常稀少[3-5]。目前，HCC患者中位總生存期為9個(gè)月，5年生存率約為10%[6]。

為了尋找新的治療方案以及改善患者生活質(zhì)量，中醫(yī)藥在癌癥中的運(yùn)用越來越得到重視。中醫(yī)藥具有多組分、多靶點(diǎn)和協(xié)同作用的特征[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將中醫(yī)藥和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合起來的一個(gè)重要橋梁,從整體角度揭示藥物作用機(jī)制，具有完整性、協(xié)同作用和動(dòng)態(tài)特征，將單一靶點(diǎn)，單一藥物轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟悬c(diǎn)，多組分模式[8]，與中醫(yī)整體理論相吻合[9]。

中醫(yī)認(rèn)為肝癌屬于“肥氣、痞氣、積氣、肝積、鼓脹、黃疸”范疇，多由于臟腑氣血耗傷，情志內(nèi)傷，脾虛濕盛，痰濕結(jié)聚，使全身氣機(jī)失調(diào)，邪毒由表入里，氣、血、濕、熱、痰、瘀互結(jié)而成?！对l(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[10]中將肝癌分為五大證型:肝郁脾虛、肝膽濕熱、肝熱血瘀、脾虛濕困、肝腎陰虛。其代表方劑分別為逍遙散合四君子湯(出自《太平惠民和劑局方》)、茵陳蒿湯(出自《傷寒論》)、龍膽瀉肝湯(出自《醫(yī)方集解》)、下瘀血湯(出自《金匱要略》)、五皮飲(出自《證治準(zhǔn)繩》)、一貫煎(出自《續(xù)名醫(yī)類案》)?；诖?，本研究擬對(duì)5種方劑進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接篩選出相應(yīng)的活性成分以及活性靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分篩選及藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 匯總5種方劑中各單味藥的標(biāo)準(zhǔn)中藥名稱在TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、TCMID (http://www.megabionet.org/tcmid)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、TCM-MESH(http://mesh.tcm.microbioinformatics.org)數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)研究文獻(xiàn)搜索出的全部化學(xué)成分，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：口服生物利用度≥30%和類藥性指數(shù)≥0.18篩選出符合條件的候選活性成分。以活性成分全稱為檢索詞在Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索其Carcinoma Smiles號(hào)，然后將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫對(duì)活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2 肝癌疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“Liver cancer” 為關(guān)鍵詞在TTD(https://db.idrblab.org/ttd)、Drugbank(https://www.drugbank.ca)、Disgenet(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、Liverome(http://liverome.kobic.re.kr/index.php)、OncoDB.HCC(http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm)數(shù)據(jù)庫檢索，在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫篩選出同時(shí)含有肝癌組織和正常組織的人源基因芯片，文件編號(hào)：GSE121248、GSE58208，使用GEO2R在線分析，以adj.P.Val<0.05 為條件，篩選出肝癌組織與正常組織的差異基因。

1.3 構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 通過Venny繪圖軟件，將肝癌疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射，從而獲得5種辨證方劑治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)。將5種方劑的活性成分以及其治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中，節(jié)點(diǎn)代表5種方劑中活性成分以及治療肝癌潛在靶點(diǎn)；邊展現(xiàn)了5種方劑活性成分與作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。運(yùn)用Cytoscape軟件中 “Network Analyzer” 功能對(duì)5種方劑的活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分別進(jìn)行分析，選取連接度較高的活性成分作為關(guān)鍵活性成分，根據(jù)連接度調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的相應(yīng)節(jié)點(diǎn)大小、顏色的深淺和排序。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub基因篩選 為了明確5種方劑中成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與肝癌作用靶點(diǎn)之間的相互作用，將映射后的共同靶基因上傳至STRING在線網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https://string-db.org/)，設(shè)置蛋白種類為“人”，設(shè)置置信度>0.9，從而獲得蛋白互作關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，并使用軟件中“Cytohubber”的“Degree”功能篩選出度值排名前5的Hub基因。

1.5 Hub基因生存分析 將篩選出的Hub基因在GEPIA在線網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)上進(jìn)行生存分析，得出結(jié)果P<0.05則提示該基因?yàn)楦伟┑念A(yù)后靶點(diǎn)，提示該基因與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.6 核心活性成分與Hub基因分子對(duì)接驗(yàn)證 在Pubchem搜索核心活性成分，下載其3D分子結(jié)構(gòu)，保存為sdf格式，再從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)，保存為PDB格式。將活性成分及關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入DockThor (https://dockthor.lncc.br/v2/)網(wǎng)站進(jìn)行分子對(duì)接，從而驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果，分子對(duì)接結(jié)合能越小表示蛋白和配體兩者之間具有較好的結(jié)合活性。

1.7 GO生物學(xué)功能富集和KEGG基因通路分析 將治療肝癌潛在基因信息導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，然后選擇生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成、KEGG信號(hào)通路進(jìn)行GO生物學(xué)功能富集分析以及KEGG通路分析，將與本疾病無關(guān)通路刪除，選取P<0.05的前15條生物學(xué)過程以及前10條通路。

2 結(jié)果

2.1 5種經(jīng)典方劑活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 逍遙散合四君子湯活性成分共計(jì)110(單位：個(gè)，以下均如此)，其中柴胡17，白芍8，當(dāng)歸2，薄荷9，生姜4，甘草66，茯苓9，白術(shù)2，人參5，活性成分靶點(diǎn)共計(jì)7426。茵陳蒿湯活性成分共計(jì)19，其中茵陳8，梔子5，大黃8，活性成分靶點(diǎn)共計(jì)1435。龍膽瀉肝湯合下瘀血湯活性成分共計(jì)154，其中柴胡17，梔子5，桃仁12，大黃8，當(dāng)歸2，甘草66，木通5，澤瀉6，車前子6，黃芩19，龍膽草8，土鱉蟲4，生地黃6，活性成分靶點(diǎn)共計(jì)9544。五皮飲合四君子湯活性成分共計(jì)121，其中人參5，白術(shù)2，茯苓9，甘草66，陳皮5，桑白皮17，大腹皮1，茯苓皮3，生姜皮17，活性成分靶點(diǎn)共計(jì)6619。一貫煎活性成分共計(jì)51，其中北沙參13，枸杞31，川楝子9，當(dāng)歸6，生地黃6，麥冬3，活性成分靶點(diǎn)共計(jì)2427。

GEO數(shù)據(jù)庫篩選出肝癌組織與正常組織的差異基因3422個(gè)，其他數(shù)據(jù)庫篩選出655個(gè)肝癌疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)后篩選出肝癌疾病靶點(diǎn)共計(jì)4001個(gè)。5種經(jīng)典方劑的成分靶點(diǎn)與肝癌疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)分別為260、169、276、242、192個(gè)(圖1)。

2.2 “活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化分析 利用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的關(guān)鍵部分，選取平均自由度到最大自由度之間的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，如附錄1所示，圖中圓形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，菱形節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn)，各個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小代表Degree值的大小，各個(gè)節(jié)點(diǎn)的透明度根據(jù)Degree值的大小從低到高排列。如表1所示，前4種方劑取自由度>40的節(jié)點(diǎn)，一貫煎取自由度前5的節(jié)點(diǎn)，逍遙散合四君子湯各活性成分度值中位數(shù)為30，茵陳蒿湯各活性成分度值中位數(shù)為36, 龍膽瀉肝湯合下瘀血湯各活性成分度值中位數(shù)為35,五皮飲合四君子湯各活性成分度值中位數(shù)為28，一貫煎中各活性成分度值中位數(shù)為18，總結(jié)后發(fā)現(xiàn)槲皮素是5種經(jīng)典方劑的共同成分且對(duì)應(yīng)度值大于其對(duì)應(yīng)方劑中活性成分自由度中位數(shù)，異補(bǔ)骨脂黃酮和Kanzonol W是逍遙散合四君子湯、龍膽瀉肝湯合下瘀血湯以及五皮飲合四君子湯的共同成分且度值大于其對(duì)應(yīng)方劑中活性成分自由度中位數(shù)。

表1 5種經(jīng)典方劑度值靠前成分及其MOLID編號(hào)

注：a,逍遙散合四君子湯;b,茵陳蒿湯;c,龍膽瀉肝湯合下瘀血湯;d,五皮飲合四君子湯;e,一貫煎。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及Hub基因篩選結(jié)果 通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出5種經(jīng)典方劑治療肝癌潛在的5個(gè)Hub基因，如附錄2所示，綠色靶點(diǎn)分別代表5種經(jīng)典方劑治療肝癌潛在作用靶點(diǎn)，右側(cè)5個(gè)靶點(diǎn)根據(jù)度值大小依次由深到淺從上向下排列。度值排名前5的基因分別為PIK3CA、SRC、AKT1、MAPK1、MAPK3，每個(gè)靶點(diǎn)具體度值見表2。

表2 5種經(jīng)典方劑PPI網(wǎng)絡(luò)中Hub基因度值

2.4 生存分析結(jié)果 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫的分析，由于AKT1的最終結(jié)果P>0.05，所以暫不將其視為肝癌的預(yù)后靶點(diǎn)，剩余4個(gè)靶點(diǎn)P值均<0.05，可視為肝癌預(yù)后靶點(diǎn)，降低其表達(dá)可改善患者的生存預(yù)后。另外，本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究[11]發(fā)現(xiàn)LOXL2也是肝癌的調(diào)控靶點(diǎn)，且為SRC的上游基因，所以將LOXL2也加入其中，分析結(jié)果如圖2所示。

圖2 5個(gè)靶蛋白基因表達(dá)與肝癌預(yù)后關(guān)系

2.5 分子對(duì)接結(jié)果 5種經(jīng)典方劑治療肝癌的共同成分為槲皮素，其中3種方劑的共同成分為異補(bǔ)骨脂黃酮和Kanzonols W。其治療肝癌潛在的Hub基因5個(gè)，其中有4個(gè)可暫定為肝癌預(yù)后靶點(diǎn)，加上LOXL2基因，共計(jì)5個(gè)靶蛋白與3種活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，如表3所示。圖3顯示Kanzonols W與SRC的結(jié)合能力最強(qiáng)，其次為槲皮素和異補(bǔ)骨脂黃酮。從總體趨勢(shì)來看3種成分與PIK3CA、SRC、LOXL2結(jié)合能力相對(duì)較好。

表3 5種經(jīng)典方劑關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵基因的分子對(duì)接結(jié)果

圖3 5種方劑關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖

2.6 Hub基因參與的生物學(xué)功能及通路富集分析 5種經(jīng)典方劑治療肝癌的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析結(jié)果如下：逍遙散合四君子湯GO結(jié)果806(單位：條，以下均如此)，KEGG通路113；茵陳蒿湯GO結(jié)果554，KEGG通路106；龍膽瀉肝湯合下瘀血湯GO結(jié)果826，KEGG通路120；五皮飲合四君子湯GO結(jié)果806，KEGG通路112；一貫煎GO結(jié)果720，KEGG通路109。對(duì)各結(jié)果的P值進(jìn)行排序后選取GO結(jié)果前10條進(jìn)行柱狀圖展示，包括生物進(jìn)程、細(xì)胞組成以及分子功能，如圖4所示。KEGG通路選取前15條進(jìn)行氣泡圖展示如圖5所示。深入分析5種方劑的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其共同參與的生物學(xué)過程是對(duì)藥物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、炎癥反應(yīng)、血管生成；細(xì)胞組成是胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物；分子功能是蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合。共同調(diào)控的KEGG通路為癌癥通路、PI3K-AKT通路、MAPK通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路。

3 討論

終末期肝癌在臨床較為常見，經(jīng)循證醫(yī)學(xué)研究[12-15]發(fā)現(xiàn)該階段中醫(yī)證型多以血瘀證和肝腎陰虛證為主，所以本研究也從血瘀證和肝腎陰虛證為重點(diǎn)研究對(duì)象，對(duì)“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)經(jīng)行分析后發(fā)現(xiàn)槲皮素為5種方劑的共同活性成分，度值均大于節(jié)點(diǎn)的中位數(shù)，異補(bǔ)骨脂黃酮和Kanzonol W為肝郁脾虛、肝熱血瘀、脾虛濕困代表方劑的共同有效成分且度值大于節(jié)點(diǎn)中位數(shù)，最終選擇槲皮素、異補(bǔ)骨脂黃酮和Kanzonol W為重點(diǎn)研究成分。

槲皮素和異補(bǔ)骨脂黃酮屬于常見的天然黃酮類化合物，兩者均具有良好的抗腫瘤作用。其中槲皮素的生物學(xué)效應(yīng)包括抗氧化、抗炎、抗增殖、抗血管生成的作用，也有著抗腫瘤的作用，其抗腫瘤作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK1/2途徑來促使細(xì)胞活力喪失，促使細(xì)胞自噬能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-19]。槲皮素在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)[20]中表明其有著良好的抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖以及促進(jìn)其凋亡的作用。異補(bǔ)骨脂黃酮在抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)具有良好的作用且可以直接抑制SRC激酶的活性[21]，且有實(shí)驗(yàn)研究[22]證實(shí)異補(bǔ)骨脂黃酮有抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用。Kanzonol W是甘草的活性成分，有研究[23]證實(shí)該成分對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，但由于其提取工藝較為復(fù)雜，其研究實(shí)行相對(duì)困難。

本課題組前期研究[11]的重點(diǎn)基因LOXL2能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展有著較為重要的作用，所以將該基因納入研究中。PIK3CA、SRC、MAPK1、MAPK3、LOXL2與肝癌預(yù)后不良有關(guān)，其高表達(dá)與肝癌患者的總體生存不良有關(guān)。將上述5個(gè)基因與槲皮素、異補(bǔ)骨脂黃酮、Kanzonol W分子對(duì)接總體趨勢(shì)提示3種成分與PIK3CA、SRC、LOXL2結(jié)合能力相對(duì)較好。并且搜索5個(gè)靶蛋白相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)均與肝癌有相關(guān)性，從而提示該研究方法是科學(xué)可行的。

非受體酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src, Src)，其編碼的蛋白歸屬于Src家族激酶(SFKs)，研究[24]證實(shí)，人類SRC的基因產(chǎn)物C-Src通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、侵襲、遷移與耐藥性參與了腫瘤的惡性發(fā)展并促進(jìn)了癌癥的發(fā)生進(jìn)展。賴氨酰氧化酶樣2(lysyl oxidase-like 2，LOXL2)通過使FAK/SRC信號(hào)通路活化而介導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[25]，表明LOXL2在上皮細(xì)胞可塑性方面有著非常規(guī)的作用，通過EMT上皮細(xì)胞將獲得較高的遷移與侵襲及抗凋亡作用，從而在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移的病理過程發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。就LOXL2基因而言，已經(jīng)有研究證實(shí)其與HCC的不良預(yù)后具有相關(guān)性，其具體機(jī)制可能是通過該基因的過度表達(dá)從而增加SNAIL的表達(dá)，最終促使血管生成擬態(tài)形成和腫瘤的轉(zhuǎn)移，而血管生成擬態(tài)是已知肝癌發(fā)生的3種微循環(huán)模式其中之一，是腫瘤微環(huán)境中血管生成的一種新形式，一般惡性程度較高且容易轉(zhuǎn)移[26]。C-Src與受體激酶發(fā)揮協(xié)同作用，從而傳導(dǎo)下游如PI3K/PTEN/Akt最終起到調(diào)節(jié)增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的作用。磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3激酶催化亞基α亞型(Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform, PIK3CA)隸屬于PI3K/AKT/mTOR通路，研究[27]證實(shí)該通路是肝癌發(fā)生的有效誘導(dǎo)因子且PIK3CA基因具有多態(tài)性，基因之間單獨(dú)或協(xié)同作用可以增加肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此，PIK3CA是SRC的下游因子，LOXL2通過激活FAK/SRC通路而介導(dǎo)EMT，3個(gè)基因之間存在一定的聯(lián)系且都被證實(shí)與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。此外，對(duì)5種經(jīng)典方劑治療肝癌的潛在基因KEGG富集分析可知代謝通路主要發(fā)生在PI3K-AKT、MAPK、Ras、HIF-1通路，這些通路與肝癌的發(fā)生及治療密切相關(guān)，這些潛在基因還參與了乙型肝炎、丙型肝炎以及癌癥通路。

注：a,逍遙散合四君子湯;b,茵陳蒿湯;c,龍膽瀉肝湯合下瘀血湯;d,五皮飲合四君子湯;e,一貫煎。

注：a,逍遙散合四君子湯;b,茵陳蒿湯;c,龍膽瀉肝湯合下瘀血湯;d,五皮飲合四君子湯;e,一貫煎。

綜上所述，本文以5種經(jīng)典方劑治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)為對(duì)象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析了其關(guān)鍵活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并聯(lián)合分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了相關(guān)成分與肝癌靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。初步揭示了槲皮素、異補(bǔ)骨脂黃酮、Kanzonl W可能涉及到多靶點(diǎn)、多通路、多過程協(xié)同的抗肝癌特點(diǎn)，為后續(xù)深入研究其抗肝癌作用機(jī)制提供了參考方向。

利益沖突聲明：本文不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：程秋駱負(fù)責(zé)文章撰寫，文獻(xiàn)查找與整理，并撰寫初稿；劉柳、叢慶偉參與文章網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分?jǐn)?shù)據(jù)查找并檢索相關(guān)文獻(xiàn)；白長川負(fù)責(zé)中醫(yī)思路部分指導(dǎo)；朱英負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

附錄1～2見二維碼