蔡恬瑩， 黃美州， 陳 浩， 錢保林， 付文廣

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 四川 瀘州 646000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發(fā)生發(fā)展與線粒體障礙密切相關(guān)，本文以NASH脂肪變性、肝炎和肝纖維化為線索，探究線粒體功能障礙、結(jié)構(gòu)異常與自噬受損在NASH發(fā)生發(fā)展中的主要作用和相互關(guān)系，并就目前通過改善線粒體障礙治療NASH的相關(guān)研究進(jìn)展以及治療靶點(diǎn)作一總結(jié)。

1 線粒體障礙與NASH脂肪代謝

1.1 脂質(zhì)代謝與線粒體功能障礙 脂肪變性是NASH的病理特點(diǎn)之一[1]，脂質(zhì)代謝主要途徑脂肪酸β氧化的異常是導(dǎo)致NASH中線粒體障礙的基礎(chǔ)。脂肪堆積誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)激活，PPAR作為核激素受體家族中的配體激活受體，與相應(yīng)配體結(jié)合后調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種代謝活動，目前發(fā)現(xiàn)其亞型PPARα主要調(diào)控脂肪酸β氧化，PPARα介導(dǎo)下游靶基因肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和脂酰CoA脫氫酶表達(dá)增加，使β氧化代償性增強(qiáng)[2]，PPARα還可激活線粒體細(xì)胞色素P450酶2E1(cytochrome P450 2E1，CYP2E1)，當(dāng)線粒體電子傳遞能力飽和時(shí)，CYP2E1通過黃素蛋白將β氧化產(chǎn)生的過量電子向分子氧傳遞，產(chǎn)生大量活性氧(ROS)[3]，即出現(xiàn)線粒體功能障礙。在NASH中，各類脂質(zhì)是線粒體ROS的主要來源之一，也是ROS攻擊的對象。脂質(zhì)成分與ROS反應(yīng)產(chǎn)生的氧固醇、氧化磷脂等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可激活還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NADPH oxidase，NOX)、降低抗氧化酶錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)活性來加劇氧化應(yīng)激；氧固醇堆積于以膽固醇為主要成分的細(xì)胞膜上可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加；從破裂的肝細(xì)胞中釋放出的氧固醇氧化磷脂可介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子產(chǎn)生炎癥，或刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)活化促進(jìn)肝纖維化[4-5]，且NASH的嚴(yán)重程度和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量呈正相關(guān)[6]，這些脂毒性作用是線粒體障礙與NASH發(fā)展存在相互作用的有力證據(jù)。

1.2 脂質(zhì)代謝與線粒體結(jié)構(gòu)損傷 NASH初期脂質(zhì)代謝異常誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)形成，線粒體結(jié)構(gòu)損傷也是氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要組成部分。線粒體結(jié)構(gòu)損傷包括線粒體呼吸鏈復(fù)合物的損傷，其引發(fā)原因并不單一，其中最重要的是線粒體DNA(mtDNA)受損，mtDNA含量在脂質(zhì)積累初期代償性增加，但轉(zhuǎn)錄表達(dá)相對不足甚至下降，被稱為mtDNA適應(yīng)不良[7]，各種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物還可直接攻擊mtDNA造成基因損傷，導(dǎo)致其編碼的線粒體復(fù)合物和ATP合酶合成減少，直接影響線粒體功能。而NASH中其他損傷信號，例如脂肪變性誘導(dǎo)細(xì)胞表面凋亡信號Fas的過度表達(dá)也表現(xiàn)出對于各線粒體復(fù)合物的損傷作用[8]。NASH中脂肪積累同時(shí)誘導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)表達(dá)增加[9]，UCP2在線粒體膜上形成質(zhì)子回流通道，減少質(zhì)子與ATP合酶偶聯(lián)，導(dǎo)致氧化磷酸化受損，ATP合成能量代謝異常，共同誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)。上述研究再次印證了脂質(zhì)代謝異常與線粒體障礙之間的密切關(guān)系。

1.3 脂質(zhì)代謝與線粒體自噬異常 線粒體自噬缺陷可能是促進(jìn)NASH進(jìn)展的重要因素[10]。在生理狀態(tài)下，自噬清除功能受損的線粒體是維持細(xì)胞氧化平衡的主要方式，而NASH進(jìn)展階段，線粒體自噬缺陷導(dǎo)致對損傷線粒體的清除作用不足，大量變形、腫脹及破裂的線粒體在肝細(xì)胞內(nèi)積聚，成為ROS的主要來源[10]。在脂肪變性階段自噬缺陷亦可促進(jìn)脂質(zhì)積累，這是由于自噬依賴性的脂肪代謝機(jī)制在起作用，自噬相關(guān)蛋白如硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)不僅可促使自噬相關(guān)基因表達(dá)，還可誘導(dǎo)PPARα表達(dá)，減輕脂質(zhì)積累[11]，提示了線粒體自噬在NASH中的積極作用。

2 線粒體障礙與NASH炎癥發(fā)生

2.1 線粒體功能障礙與NASH炎癥 肝細(xì)胞炎癥是診斷NASH必不可少的基本病理標(biāo)志。在肝脂肪變性晚期，mtDNA遭受ROS的攻擊導(dǎo)致相關(guān)基因合成受阻可能為線粒體障礙引起肝炎的根源之一。ATP合酶等基因的損傷使得ATP生成減少能量代謝異常[12]，是肝炎發(fā)生的重要推動因素。而線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ合成受阻導(dǎo)致電子傳遞異常、泄露增加，引起線粒體膜電位減弱，上述原因共同作用加劇氧化應(yīng)激。在該狀態(tài)下，大量ROS釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后通過多種方式介導(dǎo)炎癥發(fā)生，其中最重要的是與肝細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚域(NOD)樣受體(NOD-like receptor 3，NLRP3)結(jié)合活化炎性小體，炎性小體是一種多蛋白信號識別復(fù)合體，由NLRP3、前激活caspase-1和銜接分子凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白共同組成，在激活的caspase-1作用下，IL-1β產(chǎn)生增加[13]，從而引起組織炎癥反應(yīng)。上述內(nèi)容闡釋了線粒體功能障礙在誘導(dǎo)NASH炎癥中的作用。

2.2 線粒體結(jié)構(gòu)異常與NASH炎癥 線粒體釋放ROS誘導(dǎo)炎癥的前提是線粒體的通透性增加，這是氧化應(yīng)激狀態(tài)下線粒體通透性過渡孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放的結(jié)果。親環(huán)蛋白D(cyclophilin D，CypD)與ATP合酶參與mPTP的形成，線粒體內(nèi)過量ROS可能通過氧化mPTP上的蛋白質(zhì)硫醇刺激其開放[14]，導(dǎo)致線粒體通透性增加甚至破裂。CypD通過與ATP合酶側(cè)支上的寡霉素敏感蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)mPTP的開放[15]，盡管ATP合酶轉(zhuǎn)化為mPTP以及CypD對其的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不完全清楚，但CypD作為調(diào)節(jié)蛋白可被視為相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，改善NASH線粒體結(jié)構(gòu)破壞。

受損的mtDNA從破裂的線粒體中釋出，以囊泡的形式被分泌出肝細(xì)胞，后進(jìn)入Kupffer細(xì)胞或單核細(xì)胞中激活其內(nèi)Toll樣受體(TLR)9，TLR9結(jié)合活化其接頭分子髓樣分化蛋白88，后者介導(dǎo)核因子κB(NF-κB)激活產(chǎn)生促炎作用。mtDNA還可在大量ROS的作用下被氧化為氧化mtDNA，釋放后的氧化mtDNA被胞吞入中性粒細(xì)胞，在其中與NLRP3結(jié)合激活炎性小體，介導(dǎo)炎癥發(fā)生[16]。與ROS引起肝細(xì)胞自身促炎因子分泌不同，mtDNA主要作用于各類炎性細(xì)胞。這些作用解釋了NASH中線粒體結(jié)構(gòu)破壞與炎癥發(fā)生的關(guān)系。

2.3 線粒體自噬異常與NASH炎癥 NASH肝炎過程中NF-κB可刺激自噬受體p62的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使p62聚集于線粒體膜上，通過與Parkin蛋白的結(jié)合介導(dǎo)線粒體自噬，以清除炎癥損傷的肝細(xì)胞[17]。而NF-κB是最重要的促炎因子之一，其具有促炎和誘導(dǎo)自噬的雙重作用，因此不難推測肝炎中的線粒體自噬可能是一種自我保護(hù)機(jī)制。近期報(bào)道[18-19]發(fā)現(xiàn)肌醇多磷酸多激酶(inositol polyphosphate multikinase，IPMK)對于自噬至關(guān)重要，IPMK通過AMPK激活絲氨酸/蘇氨酸激酶來介導(dǎo)自噬溶酶體的組裝，并支持脫乙酰酶1(sirtuin 1，SIRT1)的表達(dá)，SIRT1與NK-κB存在級聯(lián)作用，引發(fā)該通路下的雙重效應(yīng)，這為通過線粒體自噬作用改善肝炎提供了可能，也帶來了相應(yīng)的限制與阻礙。

3 線粒體障礙與肝纖維化

3.1 線粒體功能障礙與NASH肝纖維化 肝纖維化是NASH晚期病理表現(xiàn)之一。脂質(zhì)蓄積、氧化應(yīng)激和促炎因子等條件均可間接或直接激活HSC，介導(dǎo)肝纖維化[20]。高脂誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體生物發(fā)生減少，裂變?nèi)诤鲜д{(diào)，糖酵解速率增加等線粒體物質(zhì)代謝障礙，這些事件在纖維化進(jìn)程中起重要影響[21]，而其中最關(guān)鍵的是氧化應(yīng)激狀態(tài)下大量ROS對TGFβ的激活作用，TGFβ是誘發(fā)肝纖維化最重要的細(xì)胞因子，其在未激活時(shí)與潛伏期相關(guān)肽(latency-associated peptide，LAP)結(jié)合形成穩(wěn)定的二聚體蛋白，有時(shí)還存在潛伏TGFβ結(jié)合蛋白形成三聚體[22]。ROS可直接氧化LAP使其與TGFβ分離，或通過NF-κB誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶活化切割LAP，促使成熟TGFβ的釋放[23]。且最近研究[24]表明，TGFβ和細(xì)胞外ROS對HSC的雙重刺激可誘導(dǎo)HSC內(nèi)形成Sma和Mad相關(guān)蛋白2/3(Sma- and Mad-related protein，SMAD2/3)復(fù)合物，SMAD2抑制抗氧化成分細(xì)胞球蛋白(cytoglobin，CYGB)表達(dá)，使HSC中NOX活性增加，ROS產(chǎn)生增多，同時(shí)SMAD3介導(dǎo)HSC中膠原生成，TGFβ1的自分泌，提示HSC自身氧化應(yīng)激正反饋的形成，借此維持其激活狀態(tài)，該正反饋通路的發(fā)現(xiàn)為未來NASH肝纖維化的治療提供了新的方向。

3.2 線粒體結(jié)構(gòu)異常與NASH肝纖維化 肝細(xì)胞線粒體損傷后，大量mtDNA釋放可直接活化HSC，這種作用與線粒體損傷釋放mtDNA誘導(dǎo)炎癥一樣，被稱為線粒體衍生的損傷相關(guān)分子模式[25]。但細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的mtDNA通過何種受體介導(dǎo)與HSC的識別融入，或通過何種通路激活HSC仍需要更多更深入的研究，但已有的結(jié)果仍可表明肝細(xì)胞中的線粒體損傷與肝纖維化有直接關(guān)系，對線粒體損傷分泌的mtDNA的研究，亦可作為探究HSC活化與肝纖維化發(fā)生機(jī)制的線索。

HSC中ROS的積累暗示了該細(xì)胞中可能存在與NASH相關(guān)的線粒體障礙。ROS在HSC線粒體內(nèi)產(chǎn)生，同樣經(jīng)由mPTP的開放釋放入胞質(zhì)，提示HSC中存在的線粒體結(jié)構(gòu)異常，但更多的作用線索有待進(jìn)一步發(fā)掘。

3.3 線粒體自噬異常與NASH肝纖維化 線粒體自噬對于肝纖維化的作用同樣具有雙面性，一般認(rèn)為線粒體自噬清除活化的HSC是改善肝纖維化的重要手段。與肝炎下的自噬相同，HSC中也存在誘導(dǎo)活化與自噬雙重作用的物質(zhì)——血小板衍生生長因子受體α(platelet derived growth factor receptor α，PDGFRα)，Marcelin等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠中下調(diào)PDGFRα抑制自噬的同時(shí)顯示出肝纖維化的減弱，這與誘導(dǎo)自噬以達(dá)到改善纖維化的目的相違背。由此可見，自噬的作用具有雙面性，如何利用自噬誘導(dǎo)達(dá)到理想的治療效果仍需更多的研究探索。

4 NASH與線粒體異常相關(guān)的治療

4.1 維持線粒體穩(wěn)態(tài)預(yù)防NASH進(jìn)展 改善脂質(zhì)β氧化是保護(hù)線粒體功能的首要任務(wù)，McCommis等[27]通過抑制線粒體葡萄糖氧化通路，使線粒體為脂肪β氧化留存了更多空間，研究結(jié)果提示代謝作用的重新分配可以作為治療NASH的新思路。

而在維持線粒體氧化平衡中，脫乙酰酶SIRT家族的作用占據(jù)十分重要的地位。正常情況下， SIRT3誘導(dǎo)SOD2的去乙?；せ?，并維持谷胱甘肽(glutathione，GSH)生成調(diào)節(jié)因子核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)的表達(dá)從而促進(jìn)GSH的生成[28]。GSH在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體被稱為線粒體GSH(mGSH)，線粒體內(nèi)MnSOD2清除多余的ROS成為過氧化氫，再由mGSH分解為水以維持氧化平衡[29]，但NASH中高脂誘導(dǎo)SIRT3表達(dá)降低，抗氧化作用減弱導(dǎo)致了氧化平衡失調(diào)，出現(xiàn)氧化應(yīng)激。Zeng等[30]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SIRT3活性可抑制線粒體氧化應(yīng)激，預(yù)防NASH進(jìn)展。最近的實(shí)驗(yàn)[21-22]也證實(shí)，SIRT6、SIRT1分別在恢復(fù)脂肪β氧化與肝臟炎癥發(fā)生中起調(diào)控作用，是治療NASH的重要靶標(biāo)。

4.2 保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)改善NASH肝炎 線粒體破裂介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是NASH受損細(xì)胞死亡的主要途徑。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑與線粒體B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2家族蛋白作用有關(guān)，大量ROS介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的磷酸化激活，活化的JNK誘導(dǎo)促凋亡基因表達(dá)，激活促凋亡蛋白[31]，激活的tBID募集于線粒體膜上介導(dǎo)促凋亡因子Bax和Bak形成孔道，導(dǎo)致線粒體外膜通透，細(xì)胞色素C經(jīng)Bax孔道被釋放入胞質(zhì)，結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子，募集起始半胱天冬氨酸caspase-9加入并使其激活，組成完整的凋亡小體，激活效應(yīng)半胱天冬氨酸caspase -3、7切割細(xì)胞蛋白質(zhì)協(xié)助凋亡，最終被巨噬細(xì)胞識別吞噬[32]。CXC趨化因子受體3(CXC receptor 3，CXCR3)主要存在于各類炎癥細(xì)胞上，通過介導(dǎo)MAPK亞型凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1/JNK信號通路的激活誘導(dǎo)炎癥，因JNK信號在線粒體裂變凋亡中起到的重要作用，Du等[33]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CXCR3缺陷可抑制凋亡，減輕NASH炎癥，是治療NASH的有效位點(diǎn)。

4.3 抑制線粒體通透性改善NASH纖維化 HSC中存在的氧化應(yīng)激正反饋提供了NASH纖維化治療的新思路。HSC中NOX1、2、4、5等各種NOX亞型均被證實(shí)與肝纖維化進(jìn)展有關(guān)[34]，包括NOX的上游調(diào)節(jié)蛋白CYGB等均可作為切入點(diǎn)進(jìn)行抗氧化治療的研究。在對線粒體結(jié)構(gòu)的研究中，Zhao等[35]發(fā)現(xiàn)在NASH患者活化的HSC內(nèi)可調(diào)控mPTP的環(huán)狀RNA——SCAR(steatohepatitis-associated circRNA ATP5B regulator)表達(dá)下降。SCAR作為ATP5B 調(diào)節(jié)劑，通過與ATP酶F1亞基上的ATP5B蛋白結(jié)合，阻礙ATP酶與CypD的相互作用從而抑制mPTP開放。但在NASH患者中，SCAR表達(dá)抑制使mPTP開放并釋放大量ROS，提示SCAR可作為相應(yīng)治療靶點(diǎn)。Lv等[36]認(rèn)為HSC的激活與ROS的累積實(shí)際是靜止期的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的過程，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞周期調(diào)控因子p16、38的表達(dá)與ROS的產(chǎn)生有關(guān)，為清除HSC內(nèi)ROS改善NASH肝纖維化提供了可行的治療靶點(diǎn)。

4.4 線粒體自噬改善與NASH治療 針對線粒體自噬的相關(guān)治療改善肝疾病是近年來的熱門話題。Wu等[37]發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)擬激酶混合譜系激酶域樣蛋白(pseudokinase mixed lineage kinase domain-like，MLKL)表達(dá)增加，MLKL可與肝線粒體結(jié)合刺激ROS產(chǎn)生，并轉(zhuǎn)移至自噬體膜上抑制損傷細(xì)胞的自噬，加劇肝損傷。MLKL敲除模型可改善損傷肝細(xì)胞的自噬缺陷，緩解NASH進(jìn)展。Park等[11]也證實(shí)自噬相關(guān)蛋白TXNIP通過改善脂肪酸氧化并誘導(dǎo)自噬達(dá)到減輕NASH的作用，提示誘導(dǎo)自噬治療NASH的可行性及相關(guān)靶點(diǎn)的應(yīng)用。但過度的自噬誘導(dǎo)也可能加重肝損傷，故維持其間的平衡是治療NASH的關(guān)鍵，這為通過自噬尋找新的NASH治療方式提供了機(jī)會與挑戰(zhàn)。

NASH從脂肪變性至逐步出現(xiàn)炎癥、肝纖維化等一系列病理損傷的過程中存在伴隨和遞進(jìn)關(guān)系。期間可觀察到上文所述線粒體障礙在其中的作用，被證實(shí)是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，但NASH中肝細(xì)胞線粒體障礙不能被完全確認(rèn)是NASH進(jìn)展的起因還是肝臟病變的結(jié)果[12]。總結(jié)當(dāng)前研究結(jié)論不難發(fā)現(xiàn)NASH中線粒體障礙與各級病變相互作用，互為刺激因素。NASH的治療也需與改善線粒體功能方面綜合考慮，線粒體障礙尤其是氧化應(yīng)激在NASH發(fā)展中占據(jù)最為主要的地位，但其中的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究，保護(hù)線粒體功能和NASH治療的相互關(guān)系可以作為未來進(jìn)一步研究的方向及思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：蔡恬瑩負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析和撰寫論文；黃美州、陳浩、錢保林參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；付文廣負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。