許君艷，莊路陽(yáng)，王 丹，楊 敏

鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南鄭州 450000

嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PPGLs)是罕見的內(nèi)分泌腫瘤，分別在腎上腺和神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)。PPGLs最常見的臨床表現(xiàn)是高血壓，多數(shù)患者表現(xiàn)為難治性高血壓，伴隨有頭痛、心悸、多汗、頭暈、惡心、胸悶、腹痛等癥狀[1-4]。隨著研究者和臨床專家們對(duì)PPGLs發(fā)病機(jī)制和相關(guān)標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)不斷深入，以及檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)血漿或尿液中的甲氧基腎上腺素(MN)和甲氧基去甲腎上腺素(NMN)被認(rèn)為是目前輔助診斷PPGLs的最有效手段[5-7]。

由于我國(guó)對(duì)MN、NMN的檢測(cè)以質(zhì)譜技術(shù)為主，缺乏化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)產(chǎn)品，本研究依據(jù)國(guó)內(nèi)首次公開的技術(shù)與資料[8-9]，建立針對(duì)MN和NMN的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)具有快速、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，便于臨床的推廣和使用，更好地輔助PPGLs的臨床診斷。

1 材料與方法

1.1材料 MN與NMN純品購(gòu)自TRC公司，結(jié)構(gòu)類似物純品購(gòu)自阿拉丁；MN的特異性多克隆抗體與NMN的特異性多克隆抗體均購(gòu)自鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-HRP)購(gòu)自上海生工公司。表面包裹有羧基功能基團(tuán)的磁微粒購(gòu)自德國(guó)Merk公司。生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯購(gòu)自百靈威科技公司。

1.2試劑的配制 (1)檢測(cè)試劑稀釋液的配制：配制Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH7.4)，加入0.5%(m/v)的牛血清清蛋白，0.1%(m/v)的Proclin 300。(2)磁微粒包被：按照磁珠供應(yīng)商提供的操作指南將MN抗體或NMN抗體包被于磁微粒表面，抗體/磁微粒的比例為25 μg/mg。包被完成的磁微粒儲(chǔ)存于上述檢測(cè)試劑稀釋液中，磁微粒終水平為1 mg/mL；制備完成的兩種磁微?；鞈乙河?～8 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?3)SA-HRP溶液的配制：將SA-HRP按照1/5 000(v/v)的比例加入上述檢測(cè)試劑稀釋液中，振蕩混勻，2～8 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?4)校準(zhǔn)品的配制：校準(zhǔn)品稀釋液為0.1 mol/L的鹽酸溶液，溶液中加入不同水平的MN和NMN純品，制備出一組MN水平為0、20、60、200、600、2 000 ng/mL，NMN水平為0、30、90、300、900、3 000 ng/mL的混合校準(zhǔn)品，2～8 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的AutoLumo A2000全自動(dòng)檢測(cè)分析儀。

1.4方法

1.4.1標(biāo)本制備 特異性評(píng)估標(biāo)本的制備：交叉品選擇了兒茶酚胺類物質(zhì)代謝過程中的結(jié)構(gòu)類似物，如L型多巴(L-Dopa)、3-甲氧酪胺(3-MT)、多巴胺(DA)、腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)以及MN、NMN。將MN與NMN的交叉品分別添加到校準(zhǔn)品稀釋液中，配置成高、低水平的交叉標(biāo)本。重復(fù)性評(píng)估標(biāo)本的制備：校準(zhǔn)品稀釋液中加入不同水平的MN和NMN純品，配制出高、中、低3個(gè)水平的標(biāo)本。稀釋線性評(píng)估標(biāo)本的制備：將MN、NMN純品添加到校準(zhǔn)品稀釋液中，使MN水平為3 000 ng/mL左右、NMN水平為4 000 ng/mL左右，把該標(biāo)本作為高值，校準(zhǔn)品稀釋液作為低值，將高值和低值按照一定比例混合，制備出涵蓋整個(gè)校準(zhǔn)區(qū)間的系列標(biāo)本。

1.4.2標(biāo)本?；幚?將適量生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯溶解于DMSO中，混勻，作為?；瘎﹤溆?。取100 μL各個(gè)水平的校準(zhǔn)品以及其他標(biāo)本加入等體積Tris-HCl緩沖液(0.5 mol/L,pH8.0)混勻。校準(zhǔn)品及標(biāo)本中加入上述配制的酰化劑，使生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯的終水平為0.5 mg/mL，徹底混勻。

1.4.3標(biāo)本檢測(cè) 將?；幚砗蟮男?zhǔn)品及標(biāo)本轉(zhuǎn)移至反應(yīng)杯中，使用AutoLumo A2000全自動(dòng)檢測(cè)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。MN或NMN的檢測(cè)試劑分別檢測(cè)處理好的系列校準(zhǔn)品，并按照四參數(shù)法擬合劑量反應(yīng)曲線(校準(zhǔn)曲線)，用于檢測(cè)標(biāo)本的結(jié)果計(jì)算。

1.4.4特異性評(píng)估 復(fù)孔檢測(cè)經(jīng)酰化處理的交叉品，并計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的均值。按照以下公式計(jì)算交叉率：交叉率=添加標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果/交叉品的添加水平×100%。

1.4.7稀釋線性評(píng)估 復(fù)孔檢測(cè)經(jīng)?；幚淼南♂尵€性標(biāo)本，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的均值，并按照稀釋比例計(jì)算出每支標(biāo)本的理論水平；比較、分析理論水平與實(shí)測(cè)水平的一致性。

1.4.8穩(wěn)定性評(píng)估 將MN檢測(cè)試劑的組分(MN抗體包被的磁微粒混懸液、SA-HRP溶液和校準(zhǔn)品)和NMN檢測(cè)試劑的組分(NMN抗體包被的磁微粒混懸液、SA-HRP溶液和校準(zhǔn)品)放置于37 ℃溫箱中，7 d后取出，作為37 ℃組。將配置好的校準(zhǔn)品作為標(biāo)本，分別將37 ℃組和對(duì)照組試劑(4 ℃放置的試劑組分)擬合校準(zhǔn)曲線后，同步檢測(cè)校準(zhǔn)品，并計(jì)算檢測(cè)水平，分別比較4 ℃組和37 ℃組試劑檢測(cè)水平之間的偏差。

2 結(jié) 果

2.1特異性 交叉品添加水平以及交叉率見表1。結(jié)果顯示，MN抗體與L-Dopa、3-MT、DA、E、NE和NMN的交叉率小于1%，NMN抗體與L-Dopa、3-MT、DA、E、NE和MN的交叉率小于1%。

表1 兩種檢測(cè)試劑的特異性評(píng)估

續(xù)表1 兩種檢測(cè)試劑的特異性評(píng)估

2.3重復(fù)性 觀察檢測(cè)結(jié)果，確認(rèn)無離群值；重復(fù)性結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示，MN檢測(cè)試劑的CV為4.79%～5.25%，NMN檢測(cè)試劑的CV為3.85%～4.73%，可以滿足臨床使用的一般要求。

表2 不同水平標(biāo)本的CV

2.4稀釋線性 將每個(gè)標(biāo)本的實(shí)測(cè)水平值作為橫坐標(biāo)，理論水平作為縱坐標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，建立的MN、NMN檢測(cè)方法均有較好的稀釋線性(圖1～2)。

圖1 MN稀釋線性評(píng)估結(jié)果

圖2 NMN稀釋線性評(píng)估結(jié)果

2.5穩(wěn)定性評(píng)估 穩(wěn)定性評(píng)估的目的是評(píng)估試劑長(zhǎng)期放置后檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)顯示，MN兩組檢測(cè)試劑的水平1的偏差略大，NMN兩組檢測(cè)試劑的水平1、水平2的結(jié)果偏差略大，但是均<±10%。

表3 檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性評(píng)估

3 討 論

研究表明，PPGLs的大多數(shù)臨床后遺癥和并發(fā)癥與高血壓有關(guān)，可以導(dǎo)致心、腦、腎血管系統(tǒng)的嚴(yán)重并發(fā)癥，占社區(qū)高血壓病例的0.1%～0.6%，從而造成巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-4]。PPGLs的生化診斷指標(biāo)是檢測(cè)血漿或24 h尿液中MN和NMN，液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法(LC-ECD)是MN和NMN最初的檢測(cè)技術(shù)，后來被串聯(lián)質(zhì)譜法(如LC-MS/MS)或免疫測(cè)定方法取代[10-11]。LC-MS/MS因其高靈敏度、高特異度等優(yōu)點(diǎn)逐漸被廣泛用于MN、NMN、其他兒茶酚胺類物質(zhì)及其代謝物的檢測(cè),但不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果差異大,無可比性[12]。同時(shí)，由于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的局限性，MN和NMN的檢測(cè)目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

無論何種檢測(cè)技術(shù)，都需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行萃取或解離以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性；免疫學(xué)方法為了提高免疫反應(yīng)的特異性，往往在萃取步驟后會(huì)進(jìn)行酰化處理。MN和NMN在血液和尿液中均以兩種形式存在:游離態(tài)和硫酸化MN和NMN。具有臨床指導(dǎo)意義的是血漿中游離的MN和NMN或24 h尿液中總MN和NMN[6-7,13]。在臨床檢測(cè)中，為了檢測(cè)尿液中的總MN和NMN，一般通過高溫酸解或硫酸酯酶水解的方法[14]將硫酸化MN和NMN轉(zhuǎn)化為游離MN和NMN。本研究中使用的標(biāo)本為稀釋液中添加游離MN和NMN化學(xué)純品，不涉及硫酸化MN和NMN的解離，因此標(biāo)本的前處理僅涉及?；幚?。

為了驗(yàn)證本次建立的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，對(duì)檢測(cè)試劑的特異性、分析靈敏度、重復(fù)性、稀釋線性及穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估。評(píng)估特異性使用的交叉品為MN、NMN在體內(nèi)合成、轉(zhuǎn)化通路的結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)，各交叉品之間僅有1～2個(gè)化學(xué)基團(tuán)的區(qū)別。表1中的交叉率顯示，本研究選用的兩種抗體具有較強(qiáng)的特異性，可以實(shí)現(xiàn)MN、NMN的特異性檢測(cè)。本次研究構(gòu)建的檢測(cè)試劑盒分析靈敏度為10.21 ng/mL(MN)和6.91 ng/mL(NMN)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)健康人血漿、24 h尿液中MN、NMN水平的研究結(jié)果[5-6,13，15-16]，本研究構(gòu)建的檢測(cè)試劑預(yù)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)尿液標(biāo)本中MN、NMN的檢測(cè)。MANZ等[11]構(gòu)建的MN和NMN的免疫檢測(cè)產(chǎn)品，其檢測(cè)限為7.5 pg/mL(MN)和15.0 pg/mL(NMN),可以檢測(cè)出血漿標(biāo)本中MN、NMN的水平。本次構(gòu)建的檢測(cè)試劑還需要進(jìn)一步提升靈敏度，以實(shí)現(xiàn)血漿標(biāo)本中更低水平的靶物質(zhì)檢測(cè)。本次研究評(píng)估的是檢測(cè)試劑的分析內(nèi)(批內(nèi))重復(fù)性，反映的是檢測(cè)系統(tǒng)的隨機(jī)誤差。標(biāo)本選用了低、中、高3個(gè)水平，目的是為了評(píng)估在不同水平區(qū)間檢測(cè)試劑的重復(fù)性表現(xiàn)。稀釋線性驗(yàn)證是為了明確檢測(cè)試劑在一定量值區(qū)間內(nèi)的檢測(cè)準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示，MN在23.44～3 000.00 ng/mL具有良好的稀釋線性，NMN在31.25～4 000.00 ng/mL具有良好的稀釋線性，說明本次構(gòu)建的MN、NMN檢測(cè)試劑在一定區(qū)間可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)。穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果顯示，建立的MN檢測(cè)方法的偏差為-8.56%～4.53%，建立的NMN檢測(cè)方法的偏差為-3.65%～9.22%，偏差符合一般體外診斷試劑的要求，說明兩個(gè)檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性較好。

綜上所述，本研究建立的化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)試劑對(duì)待測(cè)物有較高的特異性，可以初步實(shí)現(xiàn)MN、NMN的特異性檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)試劑具有較好的重復(fù)性、稀釋線性和穩(wěn)定性。本研究初步完成MN、NMN化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)試劑的開發(fā)，可以通過進(jìn)一步的研究繼續(xù)提升該試劑的性能，為MN、NMN免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用做出技術(shù)支持。