李陽 張麗曼 張立穎 狄生云 王菲 姜雪原
摘要 目的:探討骨痹湯對膝骨關節(jié)炎大鼠軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)及轉化生長因子-β1(TGF-β1)的影響。方法:選擇健康SD大鼠40只,建立膝骨關節(jié)炎模型,隨機分為對照組和觀察組,每組20只。對照組造模術后不予治療,觀察組自造模成功后,給予骨痹湯熏蒸治療,療程4個周。治療后,比較每組大鼠痛閾、膝關節(jié)周徑及膝關節(jié)活動度情況。采用免疫組織化學法檢測各組大鼠關節(jié)軟骨中MMP-13及TGF-β1表達變化情況。結果:治療后,觀察組痛閾、膝關節(jié)周徑及膝關節(jié)活動范圍比對照組明顯改善(P<0.05);治療后,觀察組MMP-13表達水平明顯下降,且明顯低于對照組(P<0.05);治療后,觀察組TGF-β1表達水平明顯升高,且明顯高于對照組(P<0.05)。結論:骨痹湯可改善膝骨關節(jié)炎的疼痛,減少軟骨中MMP-13的表達,延緩骨性關節(jié)炎的發(fā)展,并明顯上調(diào)TGF-β1的表達,促進軟骨修復。
關鍵詞 骨痹湯;熏蒸治療;骨關節(jié)炎;膝關節(jié);基質(zhì)金屬蛋白酶-13;轉化生長因子-β1;疾病模型;動物
Abstract Objective:To investigate the effect of Gubi Decoction on matrix metalloproteinase-13 and transforming growth factor β1 in knee osteoarthritis rats.Methods:A total of 40 healthy SD rats were selected to establish knee osteoarthritis model,and randomly divided into a control group and a treatment group,with 20 rats in each group.The control group was not treated after the model making operation,and the treatment group was given fumigating and steaming treatment of Gubi Decoction for 4 weeks.After treatment,the pain threshold,the diameter of the knee joint and the activity of the knee joint were compared.The expression of matrix metalloproteinase-13(MMP-13)and transforming growth factor β1(TGF-β1)in articular cartilage of rats in each group was detected by immunohistochemistry.Results:After treatment,the pain threshold,the diameter of knee joint and the range of motion of knee joint in the treatment group were significantly improved,compared with the control group(P<0.05); the expression level of MMP-13 in the treatment group was significantly lower than that in the control group(P<0.05); the expression level of TGF-β1 in the treatment group was significantly higher than that in the control group(P<0.05).Conclusion:Gubi Decoction can improve the pain of knee osteoarthritis,reduce the expression of MMP-13 in cartilage,delay the development of osteoarthritis,and obviously up regulate the expression of TGF-β1 to promote cartilage repair.
Keywords Gubi Decoction; Fumigation treatment; Osteoarthritis; Knee joint; Matrix metalloproteinase-13; Transforming growth factor beta 1; Disease model; Animal model
中圖分類號:R289.5;R684文獻標識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.006
骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是臨床常見的關節(jié)疾病,中老年人是高發(fā)人群,其中以膝骨關節(jié)炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是最為常見[1]。隨著我國人口老齡化的不斷加劇,KOA的發(fā)病率不斷增高,其具有極高的致殘率,給患者的生命質(zhì)量帶來嚴重影響[2]。KOA的病理基礎是關節(jié)軟骨呈現(xiàn)退行性的病變,臨床癥狀主要表現(xiàn)為膝關節(jié)活動受限、疼痛、行走困難,膝關節(jié)畸形等[3-4]。早中期KOA可采取非手術治療,晚期則需要進行手術治療[5]。早中期若能有效藥物治療,可促進膝關節(jié)組織軟骨的修復,有效延遲病變進程。西醫(yī)通常采用口服塞來昔布、布洛芬等非甾體抗炎藥物及關節(jié)腔注射玻璃酸鈉的方式來緩解膝關節(jié)疼痛,潤滑關節(jié),達到治療的目的,但長期用藥會增加各種不良反應[6]。中醫(yī)對KOA的治療方式較多,包括中藥內(nèi)服外用、針灸、推拿、小針刀及中藥熏蒸等,均具有一定的療效[7]。骨痹湯具有補益肝腎及化痰祛瘀的作用,通過熏蒸的方式使藥物滲透進膝關節(jié)周圍,從而更好發(fā)揮其作用,達到舒筋通絡、活血止痛的作用,并無不良反應[8]。本研究通過對KOA大鼠給予骨痹湯熏蒸治療,探討其對軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)及轉化生長因子-β1(TGF-β1)的影響,闡述其治療KOA的可能作用機制,以期為KOA的治療提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物 選用健康SD大鼠(動物批準號:SCXK(京)2018-0021)40只,體質(zhì)量16~22 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,飼養(yǎng)于清潔級實驗室中(室溫20~24 ℃,濕度40%~60%)觀察3 d后,用于實驗。
1.1.2 藥物 骨痹湯制作:乳香10 g、沒藥10 g、艾葉20 g、海桐皮20 g、透骨草30 g、蘇木20 g、紅花15 g、防風10 g、伸筋草30 g、木瓜15 g、淫羊藿15 g、羌活10 g、獨活10 g、川牛膝15 g、澤蘭15 g、桂枝20 g。自動煎藥機煎煮成70%濃度的中藥液保存。
1.1.3 試劑與儀器 二甲苯(批號:190712)、枸櫞酸鹽(批號:191104)、PBS(批號:190805)、過氧化氫溶液(批號:190415)、DBA試劑盒(批號:190904)、大鼠抗MMP-13(批號:190813)、TGF-β1(批號:191005)以上均由北京歐北生物科技有限公司提供。切片機(Leica,德國,型號:RM2245,),顯微鏡(OLYMPUS,日本,型號:Olympus IX71),恒溫箱(上海醫(yī)療器械廠有限公司,型號:ZLHS-80-LS),甩尾測痛儀(成都泰盟軟件有限公司,型號:SW-200),自制動物熏蒸裝置。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備 將40只SD大鼠隨機分對照組和觀察組,每組20只,適應性飼養(yǎng)1周后,采用單側跟腱切除法,建立KOA模型。
1.2.2 干預方法 2組大鼠術后均常規(guī)飼養(yǎng),自由活動,對照組不采取任何干預措施,觀察組建模成功后第2天,給予骨痹湯熏蒸治療:將大鼠放入自制動物熏蒸裝置進行全身熏蒸,蒸汽溫度為40 ℃,1次/d,20 min/次,連續(xù)治療4周。
1.2.3 檢測指標與方法 在造模前及治療4周后,采用熱輻射甩尾測痛儀對2組大鼠的痛閾進行測量。造模前及治療4周后,將2組大鼠膝關節(jié)伸展,回縮膝關節(jié),采用量角器測量其伸展至回縮的角度。造模前及治療4周后,采用無彈性的軟皮尺測量大鼠膝關節(jié)的周徑。
治療4周后,處死各組大鼠后,取其后肢膝關節(jié)股骨端軟骨作為標本,放入10%中性甲醛溶液固定,15%EDTA溶液中脫鈣、脫水、透明,石蠟包埋后連續(xù)切片(厚度:5 μm),采用免疫組織化學染色檢測MMP-13及TGF-β1表達情況:將切片并放入60 ℃恒溫箱烤片過夜,二甲苯脫蠟,依次放入95%、85%、80%及75%的乙醇中各10 min,蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μL,20 ℃孵育10 min,PBS沖洗3次,加入50 μL的一抗,4 ℃下過夜后,加入二抗,20 ℃孵育10 min,DBA試劑盒顯色,放入顯微鏡下觀察,顯色后用蒸餾水洗掉,終止顯色,采取蘇木精復染2 min,中性樹膠封片。并以細胞呈棕黃色染色判斷為陽性。每張切片隨機抽取4個400×高倍鏡視野,計算出陽性細胞所占百分比,并進行百分比評分(PP),標準為[9]:1)0分:無陽性細胞;2)1分:陽性細胞百分比<5%;3)2分:5%<陽性細胞百分比≤20%;4)3分:陽性細胞百分比>20%;對染色強度進行評分(SI):1)0分:無染色;2)1分:淡黃色;3)2分:棕黃色;4)3分:棕褐色。免疫反應評分(IRS)=PP×SI。
1.3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 2組大鼠的痛閾、膝關節(jié)周徑及膝關節(jié)活動度情況
治療后,觀察組痛閾、膝關節(jié)周徑及膝關節(jié)活動范圍比對照組明顯改善,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
2.2 2組大鼠軟骨組織MMP-13及TGF-β1表達情況
治療后,觀察組MMP-13表達水平明顯下降,且明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),觀察組TGF-β1表達水平明顯升高,且明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2,圖1~2。
3 討論
KOA是臨床最常見的關節(jié)性疾病,其病理特點主要表現(xiàn)為軟骨下骨硬化、肌肉萎縮無力、滑膜增生、關節(jié)囊攣縮、關節(jié)軟骨不同程度的破壞等[10]。KOA的發(fā)病機制主要有自身免疫反應學說、軟骨細胞凋亡學說、軟骨酶降解學說和軟骨機制內(nèi)的穩(wěn)態(tài)失衡學說等[11]。中醫(yī)學認為KOA屬于“膝痹”“骨痹”“筋痹”等范疇,認為外邪(風、寒、濕等)入侵肌腠、經(jīng)絡及筋骨關節(jié),導致關節(jié)損傷,從而引發(fā)KOA,多數(shù)KOA屬于痰濕內(nèi)阻、肝腎虧虛、氣虛血瘀等,多屬本虛標實,因此臨床治療多以祛濕化痰,祛瘀化痰及補益肝腎為宗旨[12]。
中藥熏蒸是中醫(yī)的一種治療方法,具有悠久的歷史,其操作簡單,適用較廣,并有明顯的療效[13]。本研究中的骨痹湯藥方中的伸筋草、透骨草、蘇木及海桐皮具有舒筋活絡,祛風濕的功效;乳香、紅花及沒藥具有止痹痛,理氣活血的效果;艾葉具有通痹舒筋,溫經(jīng)散寒的功效;羌活、防風及獨活可起到勝濕止痛,祛風解表的功效;淫羊藿具有止痹痛,補肝腎之功效;木瓜可起到緩解筋脈拘攣、風濕痹痛的作用;川牛膝可強筋骨,益肝腎,活血化瘀,通利血脈,利關節(jié),桂枝具有溫通經(jīng)脈,發(fā)汗解肌的功效;諸藥共用,可起到祛痰濕、補肝腎、通經(jīng)脈、緩拘攣及止痹痛之效[14-15]。KOA大鼠經(jīng)過骨痹湯熏蒸治療后,其痛閾、膝關節(jié)周徑及膝關節(jié)活動范圍均明顯改善,這可使藥效經(jīng)過熱力,快速滲入皮膚,作用于肌體,從而使關節(jié)腔內(nèi)的積液得到消除,減少關節(jié)腫脹程度,擴大膝關節(jié)活動范圍;局部高溫可使膝關節(jié)部位氣血更加流暢,加快血液循環(huán),緩解關節(jié)疼痛,達到“通則不痛”的效果。
KOA的發(fā)生與多種信號通路有密切關系,相關研究證實,金屬蛋白類可抑制軟骨組織細胞外基質(zhì)形成的主要通路,在KOA的發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用[16]。MMP-13可參與組織愈合、形態(tài)生成及損傷修復等多種正常生理病理過程,其在心血管疾病、癌癥及KOA等病變過程中起到促進作用[17]。骨痹湯熏蒸治療后,KOA大鼠的MMP-13水平明顯下降,且比其他大鼠明顯,這與相關研究結果相一致[18],這可能是因為通過骨痹湯熏蒸治療后,通過熱力和藥力共同作用下,膝骨關節(jié)軟骨組織中的MMP-13表達水平下調(diào),使異常激活的細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解等生物學功能得到有效改善,從而促進病情迅速恢復。
TGF-β1是一種轉化生長因子,在軟骨細胞的生長、增殖及分化過程中發(fā)揮重要作用,對細胞外基質(zhì)形成、軟骨修復重建起到重要的調(diào)節(jié)作用[19-20]。骨痹湯熏蒸治療后,KOA大鼠TGF-β1表達水平明顯升高,這是因為熏蒸治療可通過局部良性刺激,可有效調(diào)節(jié)機體的免疫功能,進而刺激TGF-β1的大量合成與分泌,使其在軟骨組織中廣泛表達,促進軟骨修復。
綜上所述,骨痹湯熏蒸治療,可對KOA大鼠起到活血止痛,過下調(diào)MMP-13表達,提高TGF-β1表達水平,促進關節(jié)軟骨修復,發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢,對KOA具有一定預防和治療作用。
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(2020-04-08收稿 責任編輯:楊覺雄)