陳永，邱富娟，陳艷娟，朱興旺，劉永譜，余焙佳，肖長(zhǎng)虹

1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510330； 2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510632

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的風(fēng)濕科疾病，患病率高達(dá)0.5%～1.0%[1]。RA危害極大，其突出的病理特點(diǎn)是滑膜增生并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞甚至畸形[2]，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、變形和功能喪失，甚至累及人體多個(gè)系統(tǒng)、器官，引發(fā)并發(fā)間質(zhì)性肺病、動(dòng)脈粥樣硬化心血管病、貧血等[3]。

研究表明，滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是RA發(fā)病進(jìn)程中關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞[4]。RA患者的滑膜從靜止的相對(duì)無(wú)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槌錆M免疫細(xì)胞的增生性浸潤(rùn)組織。活化的FLS迅速增殖形成血管翳[5]，并且能抑制細(xì)胞凋亡，F(xiàn)LS通過(guò)產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趨化因子和基質(zhì)降解分子等增強(qiáng)遷移能力，加速關(guān)節(jié)軟骨的侵襲和破壞[6]。

目前RA的治療藥物包括糖皮質(zhì)激素、改善風(fēng)濕病情藥物及生物制劑等[7]。近幾十年來(lái)，RA病情控制雖然有了較大的提高，但仍存在難治性病例、耐藥、藥物副作用等挑戰(zhàn)[8]。甘草養(yǎng)陰湯是張仲景《金匱要略》中“甘草瀉心湯”改良而成的藥食同源配方。原甘草瀉心湯在白塞病(中醫(yī)“狐惑病”)中研究廣泛[9]，亦有對(duì)于RA等自身免疫性疾病的報(bào)道[10]，但原方中半夏具有小毒，黃連口感過(guò)于苦，改良后含有甘草、人參、羅漢果、蒲公英等藥物，這些藥物均出自國(guó)家衛(wèi)計(jì)委公布的既是食品又是藥品的中藥名單[11]，配伍陰陽(yáng)平和、滋陰扶陽(yáng)。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)，甘草[12]、人參[13]、蒲公英[14]等均具有抗炎、抗氧化、甚至抑制癌細(xì)胞增殖的作用，而RA-FLS分泌炎癥因子并具有侵襲性被認(rèn)為具有癌細(xì)胞的特性[15]，推測(cè)甘草養(yǎng)陰湯可能對(duì)RA-FLS的增殖有一定影響。基于此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察甘草養(yǎng)陰湯對(duì)RA-FLS細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為甘草養(yǎng)陰湯治療RA提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雌性SD大鼠20只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041。溫度22～24 ℃，濕度30～60%條件飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 藥品與試劑甘草養(yǎng)陰湯(自備，專利號(hào)：201910843519.9)。1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：31870082)；胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國(guó)ThermoFisher公司，貨號(hào)：10099、SV30010)；膠原酶、磷酸緩沖鹽溶液、D-Hanks液、胰酶(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：C2674、D8537、H6648、R001100)；舒泰50(法國(guó)Virbac公司，規(guī)格：50 mg，批號(hào)：86ZBA)；MTT細(xì)胞增殖分析檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司，貨號(hào)：C0009、C1062S、C1052)。

1.3 儀器3311型培養(yǎng)箱、ST40型離心機(jī)、51119600C型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；FACS Canto II流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)；DW-FL450型冰箱(長(zhǎng)虹美菱股份有限公司)。

2 方法

2.1 FLS細(xì)胞分離和培養(yǎng)通過(guò)關(guān)節(jié)鏡滑膜切除術(shù)獲得3例RA患者的滑膜組織標(biāo)本?；颊呔鶠榕裕\斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(American college of rheumatology，ACR)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，已排除感染、結(jié)核、腫瘤、糖尿病及其他免疫相關(guān)疾病?；颊弑话才庞糜谥委熌康牡南リP(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡手術(shù)，并書(shū)面同意捐贈(zèng)滑膜組織用于研究。

無(wú)菌條件下剪碎滑膜組織，加入含質(zhì)量濃度為4.0 g·L-1膠原酶的1640 培養(yǎng)基7 mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育消化4 h，300×g離心5 min，收集細(xì)胞，加入含10%胎牛血清及10 g·L-1青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，18 h后細(xì)胞貼壁。PBS洗滌，棄除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。貼壁細(xì)胞用D-Hanks液徹底沖洗后，用2.5 kg·L-1胰酶消化液消化，收集貼壁細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定FLS純度達(dá)98%以上。FLS在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳4～7代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 含藥血清的制備將大鼠隨機(jī)分為2組，即生理鹽水對(duì)照組(normal saline，NS)和甘草養(yǎng)陰湯實(shí)驗(yàn)組(gancao nurish Yin decortion，GC)，每組10只。GC組采用甘草養(yǎng)陰湯灌胃[用量：3.78 g(飲片當(dāng)量)/kg(大鼠體質(zhì)量)，相當(dāng)于60 kg成人用量的6.3倍]，每日2次，連續(xù)灌胃7 d，NS組采用等量生理鹽水灌胃。灌胃完成2 h后，舒泰50肌肉注射進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血。4 ℃冰箱靜置1 h，300×g離心8 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活并過(guò)濾除菌后，加入終濃度為10 g·L-1青霉素-鏈霉素雙抗，分裝入離心管，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)收集對(duì)數(shù)期FLS，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106mL-1，96孔板中每孔加入100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育18 h后細(xì)胞貼壁，棄上清。NS組加入100 μL含10%NS組大鼠血清的1640 培養(yǎng)基，GC組加入100 μL含10%GC組大鼠血清的1640培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h 后采用MTT法檢測(cè)FLS細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)操作按MTT細(xì)胞增殖分析檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔的OD值。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期FLS，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106mL-1，6孔板中每孔加入2 mL。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育18 h后貼壁，棄上清。NS組加入100 μL含10% NS組大鼠血清的1640 培養(yǎng)基，GC組加入100 μL含10%GC組大鼠血清的1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS清洗2次，300×g離心5 min，收集細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀按Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)按照2.4項(xiàng)下的方法準(zhǔn)備2組細(xì)胞，PBS洗滌離心后加入2 mL預(yù)冷75%酒精，4 ℃固定2 h，PBS重懸，洗滌1次。采用流式細(xì)胞儀按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分析兩組FLS的細(xì)胞周期。

3 結(jié)果

3.1 甘草養(yǎng)陰湯對(duì)FLS細(xì)胞增殖的影響與NS組比較，含藥血清干預(yù)48h時(shí)后，GC組OD值顯著降低(P<0.05)，含藥血清干預(yù)72 h后，GC組OD值極顯著性降低(P<0.001)。提示甘草養(yǎng)陰湯能顯著抑制FLS細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖1。

3.2 甘草養(yǎng)陰湯對(duì)FLS細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，與NS組比較，GC組FLS細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。提示甘草養(yǎng)陰湯能顯著促進(jìn)FLS凋亡。見(jiàn)圖2。

注：NS：生理鹽水血清組，GC：甘草養(yǎng)陰湯血清組；與NS組比較，*P<0.05，***P<0.001圖1 甘草養(yǎng)陰湯對(duì)FLS細(xì)胞增殖的影響

注：NS：生理鹽水血清組，GC：甘草養(yǎng)陰湯血清組；與NS組比較，**P<0.01圖2 甘草養(yǎng)陰湯對(duì)FLS細(xì)胞凋亡的影響

3.3 甘草養(yǎng)陰湯對(duì)FLS細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示，與NS組比較，GC組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.001)，而S期細(xì)胞百分比、G2/M期細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.000 1，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 甘草養(yǎng)陰湯對(duì)FLS細(xì)胞周期影響

4 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為病理機(jī)制的自身免疫病，滑膜增生并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞甚至畸形[17]。生理狀態(tài)下，滑膜產(chǎn)生的透明黏性滑液，可減少運(yùn)動(dòng)過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨之間的摩擦，為周圍軟骨提供結(jié)構(gòu)支持和必要的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而維持關(guān)節(jié)功能[18]。FLS是間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞，是滑液主要成分的主要來(lái)源細(xì)胞，可分泌透明質(zhì)酸等糖蛋白[19]，尤其是潤(rùn)滑素(lubricin)，是對(duì)關(guān)節(jié)潤(rùn)滑至關(guān)重要的一種蛋白[20]。此外，F(xiàn)LS表達(dá)許多介導(dǎo)細(xì)胞黏附的重要分子，例如鈣粘蛋白-11(cadherin-11)、血管細(xì)胞黏附蛋白(vascular cell adhesion molecular，VCAM)-1和各種整聯(lián)蛋白及其受體[21]。但在RA患者的滑膜中，F(xiàn)LS可以產(chǎn)生許多促炎信號(hào)分子，特別是白細(xì)胞介素-6(interlukin-6，IL-6)、IL-8、前列腺素和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，參與炎癥反應(yīng)并直接影響其它炎癥細(xì)胞[4]，這些病理過(guò)程可通過(guò)血小板微泡分泌的IL-1促進(jìn)FLS活化[22]。在FLS增殖和凋亡的過(guò)程中，RA-FLS明顯增生，導(dǎo)致與其它炎癥細(xì)胞，包括特異性和非特異性免疫細(xì)胞以及血小板一起在滑膜中產(chǎn)生炎癥，并將更多的免疫細(xì)胞募集到受損部位(滑膜)，形成炎癥反應(yīng)的正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步促成關(guān)節(jié)破壞?？梢?jiàn)，RA-FLS大量增生并伴隨炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成是滑膜增生的基礎(chǔ)[23]。

甘草養(yǎng)陰湯是在東漢末年張仲景《金匱要略》的“甘草瀉心湯”基礎(chǔ)上改良而成。原方在臨床中運(yùn)用廣泛，包括消化系統(tǒng)如潰瘍性結(jié)腸炎、消化性胃潰瘍，神經(jīng)系統(tǒng)如神經(jīng)官能癥，免疫系統(tǒng)包括白塞病[24]、TA、內(nèi)分泌系統(tǒng)及婦科疾病[25]。但原方中半夏具有小毒，黃連口感過(guò)于苦，所以對(duì)原方的相關(guān)中藥進(jìn)行改良。中醫(yī)治療疾病講究辨證論治，臨床上RA包括寒濕痹阻證、濕熱痹阻證、腎氣虛寒證、肝腎陰虛證及瘀血痹阻證等多種證型[26]。按照中醫(yī)思維，甘草養(yǎng)陰湯恐難以達(dá)到辨證論治的目的，但是甘草、人參、羅漢果、蒲公英等配伍陰陽(yáng)平和、滋陰扶陽(yáng)，形成對(duì)陰陽(yáng)的緩沖，可適合多數(shù)RA人群。另外，由于RA是系統(tǒng)性疾病，加之西藥的運(yùn)用，常存在貧血、體力下降等并發(fā)癥[27-29]，而人參等具有增強(qiáng)患者體力的補(bǔ)益功效[30-31]。

抑制FLS增殖是RA治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。細(xì)胞周期的變化是影響細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)鍵因素，在細(xì)胞周期中，G0/G1期進(jìn)行RNA和核糖體及復(fù)制所需酶的合成，S期進(jìn)行DNA合成，G2/M期進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)的大量合成，并完成細(xì)胞分裂[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，甘草養(yǎng)陰湯促使G2/M期和S期的FLS細(xì)胞比例明顯減少，而G0/G1期細(xì)胞明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了甘草養(yǎng)陰湯對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，甘草養(yǎng)陰湯含藥血清能夠抑制RA-FLS的增殖，并在一定程度上促進(jìn)凋亡。本研究尚存在不足之處，要進(jìn)一步建立RA動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)療效的考察。