汪穎 陳永靜 孫慶業(yè) 楊夢瑤 吳盾

（1. 安徽大學資源與環(huán)境工程學院 安徽省礦山生態(tài)修復工程實驗室，合肥 230601；2. 安徽省煤田地質局勘查研究院，合肥 230088）

多 環(huán) 芳 烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種兩個或兩個以上苯環(huán)相聯(lián)的持久性的有機污染物（如萘、蒽、菲和芘等），工業(yè)生產和日常生活中排放的多環(huán)芳烴廣泛分布在自然界中，水體、土壤和大氣中都檢測到多環(huán)芳烴的存在［1］。多環(huán)芳烴進入環(huán)境的主要途徑包括：工業(yè)污水、廢水、家庭污水、油料提取，以及制造藥物、油漆、塑料和殺蟲劑的工廠［2］。多環(huán)芳烴的廣泛分布及其對人體健康的潛在危害引起了人們對其生物降解機制的高度關注。一般來說，隨著苯環(huán)數的增加、化學結構的變化和疏水性的增強，多環(huán)芳烴的電化學穩(wěn)定性、抗生物降解能力也會隨之增大。穩(wěn)定性和疏水性是影響多環(huán)芳烴在環(huán)境中持久性的兩個主要因素［3］。萘是多環(huán)芳烴中結構最簡單、分子量最小的一種有機化合物，一直作為降解多環(huán)芳烴的典型化合物［4-5］。作為最常見的一種芳香族化合物，萘能阻礙人的呼吸，具有一定的毒性。

自然界中微生物種類非常豐富，大都具有很強的分解和代謝的能力。利用能夠代謝多環(huán)芳烴的微生物或酶，將其轉化為毒性很小或沒有毒性的物質［6］，是一種有前途的、廉價的方法用來降解或清理被多環(huán)芳烴污染的環(huán)境。微生物降解是將多環(huán)芳烴從污染環(huán)境中去除的主要途徑，細菌具有不同的分解酶，這一特性使它們在其他所有微生物中脫穎而出［7-8］。常見的降解多環(huán)芳烴細菌有鞘氨醇單胞屬（Sphingomonas）［9］、紅球菌屬（Rhodococcus）［10］、芽孢桿菌屬（Bacillus）［11］、假單胞菌屬（Pseudomonas）［11］和伯克氏菌屬（Burkholderia）［12］等。

萘的生物降解主要有水楊酸、龍膽酸和鄰苯二甲酸3種降解途徑［13］，通過對關鍵酶及其編碼基因的研究，已初步探究出萘的水楊酸和龍膽酸降解途徑，如圖1所示。多環(huán)芳烴環(huán)羥基化雙加氧酶是多環(huán)芳烴好氧降解的第一步，雙加氧酶可在苯環(huán)上添加兩個氧原子，萘在其作用下可生成萘二氫二醇化合物。再經過脫氫酶、雙加氧酶、異構酶等作用生成2-羥基苯丙酮酸，之后在羥基苯脫萘丙酮酸水合醛縮酶的作用下生成水楊醛。最后，水楊醛經過水楊醛脫氫酶生成水楊酸，這些是萘降解的上游步驟。在下游步驟中，水楊酸在水楊酸羥化酶作用下形成兒茶酚，經過兒茶酚1，2-雙加氧酶或兒茶酚2，3-雙加氧酶催化，產物最終進入三羧酸循環(huán)生成二氧化碳和水。水楊酸還可在水楊酸5-羥化酶的催化作用下生成龍膽酸，經龍膽酸1，2-雙加氧酶的催化，最終生成的產物進入三羧酸循環(huán)，實現對萘的降解。參與上述反應的關鍵酶基因分別有多環(huán)芳烴環(huán)羥基化雙加氧酶基因PAH［14］、反式-o-羥基苯脫萘丙酮酸水合醛縮酶基因HBHA［15］、水楊醛脫氫酶基因nahF［16］、水楊酸羥化酶基因nahG及其重復基因nahU［17］、水楊酸5-羥化酶基因S5H［15］、兒茶 酚1，2-雙 加 氧 酶 基 因CATA［18］、兒 茶 酚2，3-雙加氧酶基因C230［19］和龍膽酸1，2-雙加氧酶基因GDO［20］等。

圖1 萘的降解途徑Fig.1 Degradation pathways for naphthalene

在煤炭開采過程中，多環(huán)芳烴主要通過粉塵進入環(huán)境。在料堆和尾礦中的材料也含有多環(huán)芳烴，這些物質會對水體、土壤和地下水造成污染。微生物可以分解土壤中和植物根際周圍難以分解的有機物，有效降低環(huán)境被污染程度。萘是被美國環(huán)境保護署列為優(yōu)先控制污染物的16種多環(huán)芳烴之一，也是國內外許多工業(yè)污染場地中的主要污染物。因此，從尾礦中篩選出對萘具有降解能力的微生物是十分必要的。以從尾礦中篩選出的P6-4菌株為研究對象，對P6-4菌株的生理生化特性進行研究，優(yōu)化其對萘的降解條件，探討其對萘的降解途徑，旨在為利用微生物修復技術治理多環(huán)芳烴污染環(huán)境提供優(yōu)良菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株篩選、鑒定

1.1.1.1 菌株的篩選 研究中使用的P6-4菌株是從白茅（Imperata cylindrica）根際尾礦中篩選出來的一株優(yōu)勢菌種［21］，沾取P6-4菌株接種于50 mL的萘-無機鹽液體培養(yǎng)基［22］中，此時培養(yǎng)基pH為7.0，萘的濃度為100 mg/L。在35℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)液渾濁后，取1 mL菌液于新鮮的 萘-無機鹽液體培養(yǎng)基內，上述操作重復3次。最后在萘-無機鹽固體培養(yǎng)基上反復劃線，觀察菌株在固體培養(yǎng)基上的生長情況。

1.1.1.2 菌株的鑒定 基于16S rDNA序列的測定和系統(tǒng)發(fā)育分析方法對菌株進行鑒定：按照Bacterial DNA Kit D3350-01試劑盒中的步驟進行細菌DNA的提取，產物保存于-20℃冰箱中。以P6-4菌株的基因組DNA為模板，利用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進 行 擴 增。PCR反應條件為：94℃變性7 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；72℃延伸10 min；最后4℃保存擴增產物。對擴增產物進行回收、克隆后，交由上海華大基因完成測序，將測序反饋的堿基序列于美國國家生物技術信息中心（NCBI）上進行BLAST比對。

1.2 方法

1.2.1 生理生化研究

1.2.1.1 培養(yǎng)基和試劑 培養(yǎng)基：R2A培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基、蒙金娜培養(yǎng)基、PKO培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨淀粉培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基。

試劑：3%過氧化氫溶液、Salkowski比色液、結晶紫染液、碘液、95%乙醇、蕃紅染液、1%溴百里香酚藍乙醇溶液、6%α-萘酚乙醇溶液、40%氫氧化鉀溶液、CAS染液。

1.2.1.2 生理生化實驗 生理生化實驗步驟按細菌鑒定手冊［23］和相關文獻［24-27］進行。

1.2.2 降解試驗設計

1.2.2.1 影響菌株降解性能因素的設計 將P6-4菌株按2%的接種量接種到50 mL以萘為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，初始降解溫度為35℃，培養(yǎng)基pH為7.0，轉速為150 r/min。依次將萘降解初始質量濃度、降解溫度、降解轉速、降解pH設為變量，每次設置一個變量，以不加菌的萘-無機鹽液體培養(yǎng)基為空白對照。連續(xù)培養(yǎng)7 d后，用光密度法測定菌體濃度（OD600），判斷菌株生長情況，每組3個平行，通過菌株生長狀況剪接反應菌株降解情況，分析該菌株對萘的最佳降解條件。

1.2.2.2 菌株在最佳降解條件下降解能力的設計 萘最大吸收波長的測定：用正己烷配置80 mg/L的萘標準儲備液，進行梯度稀釋后，紫外分光光度計上設置波長，在200 nm-800 nm范圍內進行全光譜掃描，通過譜圖確定萘最大吸收波長［28-29］。

萘標準曲線的繪制：向7支25 mL的比色管中依次加入0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和5.0 mL萘-正己烷標準儲備液，正己烷定容至10 mL。用1 cm石英比色皿在萘最大吸收波長處依次測吸光度，并作吸光值與濃度的關系曲線。

生長曲線的繪制：取1 mL活化后的P6-4菌株接種到50 mL萘-無機鹽液體培養(yǎng)基中，在最優(yōu)降解條件下，振蕩培養(yǎng)7 d，每隔24 h測一次吸光度（OD600）。以不接菌種的培養(yǎng)基為空白對照，繪制菌株生長曲線，設置3個平行。

降解率的測定：在連續(xù)培養(yǎng)完成后，取20 mL培養(yǎng)液，于4℃、8 000×g的條件下離心10 min。吸取10 mL上清液，用5 mL正己烷進行萃取，萃取完成后，吸取上層液體用正己烷定容至10 mL。以正己烷為空白對照，用1 cm石英比色皿在萘最大吸收波長處測其吸光值，與不接菌的培養(yǎng)基進行對比，得到菌株對萘的最大降解率。

1.2.2.3 菌株的萘降解途徑研究 通過多環(huán)芳烴環(huán)羥基化雙加氧酶基因（PAH）［14］、羥基芐基丙酮酸水合醛縮酶基因（HBHA）［15］、水楊酸羥基化酶基因（nahU）［17］、水楊酸5-羥化酶基因（S5H）［15］、兒茶酚1，2-雙加氧酶基因（CATA）［18］、兒茶酚2，3-雙加氧酶基因（C230）［19］及龍膽酸1，2-雙加氧酶基因（GDO）［20］考察菌株的萘降解途徑。7種關鍵酶基因的相應引物，見表1。

表1 關鍵酶基因引物 Table 1 Primers of key enzyme gene

2 結果

2.1 P6-4菌株的鑒定

在萘-無機鹽固體培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色，不透明，凸起，表面油膩。以P6-4菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳切膠純化，獲得長度約為1 500 bp的產物，如圖2所示。BLAST比對結果表明，菌株P6-4與Inquilinus屬的同源性達到99%，因此判定本研究所用菌株P6-4隸屬于Inquilinus屬。

圖2 P6-4降解菌株的16S rDNA的PCR產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR products of P6-4 degrading strain

2.2 Inquilinus sp. P6-4菌株的的生理生化特征

對P6-4菌株進行一系列生理生化實驗，菌株的部分生理生化結果如表2所示，P6-4菌株為Inquilinus屬革蘭氏陰性好氧菌，可在含1%-3%鹽度的R2A培養(yǎng)基和檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并產過氧化氫酶、IAA和鐵載體，同時具有溶磷、固氮功能；該菌株不產淀粉酶，分解葡萄糖時不生成乙酰甲基甲醇。

表2 P6-4降解菌株的生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of P6-4 degrading strain

2.3 各因素對Inquilinus sp. P6-4菌株降解性能的 影響

2.3.1 菌株的萘最適降解初始質量濃度的測定 本實驗選取9個不同的萘初始濃度進行試驗。由于萘是無機鹽培養(yǎng)基的唯一碳源，菌株的生長離不開碳源的供給，所以培養(yǎng)基中萘的濃度與菌株的生長有密切關系，當不額外添加碳源時，菌株在無機鹽液體培養(yǎng)基中均無法正常生長，那么在以萘為唯一碳源條件下，菌株的生長狀況與培養(yǎng)基中萘的含量是緊密相關的，即生長越好，降解率就越高?？赏ㄟ^測定菌株的生長情況，即菌株的生長情況間接反映降解情況。由圖3-A可知，在萘-無機鹽液體培養(yǎng)基中，當萘初始質量濃度為400 mg/L，P6-4菌株能夠最好的生長。因此，在后續(xù)的實驗工作中萘的濃度都設為400 mg/L。

2.3.2 菌株的萘最適降解溫度的測定 本實驗設定了5個不同的降解溫度，結果如圖3-B所示。菌株在20-30℃的溫度范圍內，菌體的濃度隨著溫度的升高而變大，在30℃時測得的OD600值最大，然后在30-40℃的溫度范圍內，菌體濃度隨著溫度的升高而降低。因此將30℃定為菌株降解的最佳溫度，在后續(xù)的實驗工作中，都將培養(yǎng)溫度設為30℃。

2.3.3 菌株的萘最適降解轉速的測定 本實驗設置了7個不同搖床轉速，培養(yǎng)結果如圖3-C所示。在轉速為150 r/min時，菌株的生長量最大。因此在后續(xù)實驗中，搖床的轉速都設定為150 r/min。

2.3.4 菌株的萘最適降解pH的測定 本實驗共設定了7個不同的pH，測定菌株在不同pH下的菌體濃度（OD600），結果如圖3-D所示。菌株在pH為9.0時，OD600值最大。在酸性（pH 5）和強堿（pH 10和pH 11）條件下，P6-4菌株的生長普遍受到抑制，OD600值很低，均未超過0.4。

圖3 不同因素對P6-4菌株降解萘生長的影響Fig.3 Effects of different factors on the growth of P6-4 degrading strain for degradate naphthalene

2.4 Inquilinus sp. P6-4菌株在最佳降解條件下降解率的測定

利用紫外可見分光光度計進行全光譜掃描，通過最大吸收峰可知萘的最大吸收波長為275 nm。將萘標準儲備液按照梯度稀釋，分別配置成濃度為0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、12 mg/L、16 mg/L和40 mg/L的萘-正己烷標準使用液，用分光光度計在275 nm處測萘各濃度對應的吸光度。以萘各梯度標準液為x，對應的吸光值為Y，制作萘標準線Y=0.045 8x+0.011 7，標準曲線R2=0.995 4。

按2%的接種量將P6-4菌株接種到萘的初始質量濃度為400 mg/L，pH為9.0的50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150 r/min的條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d。每隔24 h取樣檢測，3個平行。設不接菌的培養(yǎng)基為對照組，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計測定出的吸光值（OD600）表示菌株的生長量，繪制菌株的生長曲線，結果見圖4。由圖4可知，第1天為生長遲緩期，第2天到第6天為對數增長期，第7天是穩(wěn)定期。

圖4 P6-4降解菌株的生長曲線Fig.4 Growth curve of P6-4 degrading strain

在連續(xù)培養(yǎng)結束后，用正己烷萃取培養(yǎng)基中的萘，結合萘濃度標準曲線，可知菌株對萘的最大降解率為93.22%。

2.5 Inquilinus sp. P6-4菌株的萘降解途徑

從3種萘降解途徑中選取7種萘降解途徑中關鍵酶基因，對7種關鍵酶基因進行PCR擴增，擴增條帶都清晰可見，擴增結果如圖5所示，之后將擴增產物進行克隆送測。由測序結果可以判斷，Inquilinus sp. P6-4菌株可以通過水楊酸和龍膽酸兩種降解途徑完成對萘的降解。

圖5 關鍵酶基因的PCR擴增電泳圖Fig.5 PCR amplified electrophoretic map of key enzyme genes

3 討論

經鑒定本研究使用的P6-4菌株隸屬于Inquilinus屬。迄今，Inquilinus屬僅有兩個確定的種，分別為Inquilinus limosus和Inquilinus ginsengisoli。Inquilinus limosus由Coenye等［30］從囊性纖維化患者的呼吸分泌物中分離得到的革蘭氏陰性嚴格需氧菌；Jung等［31］從韓國人參地土壤里篩選Inquilinus屬的另一個菌種，命名為 Inquilinus ginsengisoli。目前，關于該屬的已有研究多集中在其囊性纖維化潛在致病性和抗藥性［30-34］，對多環(huán)芳烴降解方面的研究非常少。

微生物降解多環(huán)芳烴受諸多環(huán)境因素影響，如底物濃度、培養(yǎng)溫度、轉速、pH等［35］。本研究中，當萘初始質量濃度為400 mg/L時，菌株的生長量最大，隨著底物濃度增加，菌株的生長量反而降低。Abarian等［36］研究也發(fā)現當培養(yǎng)基中萘的濃度過高時，細菌的生長會受到明顯抑制。相關研究還發(fā)現在菌株培養(yǎng)過程中，若培養(yǎng)基中萘的含量過高，微生物的生物降解能力明顯減弱，降解率與萘濃度呈負相關，說明高濃度的萘對菌株的生長有明顯的抑制作用，甚至還會產生毒害作用，威脅微生物的 生存［37-38］。

細菌的生長和對萘的利用率也會隨降解溫度的變化而有明顯的變化［39］。本研究發(fā)現，在培養(yǎng)溫度為30℃時，P6-4菌株測得的生長量最大，但當培養(yǎng)溫度為40℃時，菌株幾乎不生長。相關研究也發(fā)現溫度菌株降解萘具有較大的影響，其主要通過影響降解酶活性和微生物的生長繁殖來調節(jié)微生物對外源物質的降解吸收［40-41］。培養(yǎng)基中氧氣的含量會對菌株生長和有機污染物的降解產生影響［38］。轉速越大，培養(yǎng)基的溶氧量就越大。通過之前的實驗得知該菌株為嚴格好氧菌，那么在一定范圍內，隨著培養(yǎng)基中溶氧量的增多，菌株對萘的降解率也會越大［42］。本研究在轉速為0-150 r/min范圍內，符合上述規(guī)律。但是當轉速大于150 r/min時，菌株的生長量并不理想，可能是因為過高的轉速使降解菌與瓶壁產生較大摩擦，細胞受到機械損傷，不利于菌株的生長［43］。微生物的生長繁殖以及參與的許多生化反應都需要在具有合適pH的培養(yǎng)基中進行，因此，培養(yǎng)基的pH也是影響菌株生長的一個重要因素［38］。在培養(yǎng)完成后，測得培養(yǎng)基中pH由9.0降至7.51，這可能是因為萘在降解過程中會生成小分子的有機酸類的中間產物，與堿性體系中和，使培養(yǎng)基中的pH有所下降［44］。相關研究表明，細菌在中性或堿性條件下對萘的降解效果更好，而在強酸強堿條件下，菌株的生長和降解能力普遍受到抑制［45-46］。

已知3種萘的生物降解途徑中，水楊酸降解途徑的主要代表菌株是 Pseudomonas［47］，龍膽酸降解途徑的主要代表菌是 Ralstonia U2［48］，Abo-State等［49］用GC-MS分析萘降解中間產物發(fā)現鄰苯二甲酸的存在。nahU基因、CATA基因、C230基因是水楊酸降解途徑代表功能基因［50-52］，S5H基因、GDO基因是龍膽酸降解途徑代表功能基因［53-54］。本研究發(fā)現P6-4菌株含有nahU、CATA、C230基因，同時含有S5H、GDO基因，可推測P6-4菌株對萘的降解存在水楊酸和龍膽酸兩種途徑，是否存在其他降解途徑有待進一步探討。

4 結論

（1）P6-4菌株為Inquilinus屬，為革蘭氏陰性好氧菌。（2）1%-3%鹽度、過氧化氫酶、IAA、有機磷和無機磷溶解、固氮、產鐵載體、檸檬酸鹽利用試驗結果均為陽性，甲基紅試驗和淀粉酶試驗結果都是陰性。（3）P6-4菌株萘最佳降解條件為：萘初始質量濃度400 mg/L、30℃、150 r/min、pH 9.0。在最佳降解條件下，P6-4菌株對萘的降解率為93.22%。（4）P6-4菌 株 含 有PAH、HBHA、nahU、S5H、CATA、C230和GDO基因，推測該菌株可通過水楊酸和龍膽酸兩種降解途徑完成對萘的降解。