潘志文 陳偉庭 高潔兒 周峰 姚涓 王聲斌 姜大剛

（農業(yè)農村部植物及植物用微生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）/華南農業(yè)大學生命科學學院，廣州 510642）

自1996年轉基因作物商業(yè)化以來，創(chuàng)造了巨大的經濟效益和生態(tài)效益，為全球的糧食安全、氣候變化和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展做出了巨大貢獻。全球轉基因作物種植規(guī)模日益擴大，根據國際農業(yè)生物技術應用服務組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）發(fā)布的報告，2018年全球轉基因作物種植面積接近2億 hm2，主要包括玉米、大豆、棉花等［1］。在我國，商業(yè)化種植的轉基因作物主要包括轉基因棉花和轉基因番木瓜。

番木瓜（Carica papaya L.）又名木瓜，是著名的“嶺南佳果”。番木瓜生育期內易受病害侵染，番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV）的肆虐，導致全球各地的番木瓜品質和產量大幅度降低，嚴重影響相關產業(yè)的發(fā)展。1991年，F(xiàn)itch等［2］將PRSV病毒編碼外殼蛋白（coat protein，CP）的基因片段轉入番木瓜，培育出抗環(huán)斑病毒病的轉基因番木瓜55-1等品系，并于1998年5月在夏威夷商業(yè)化生產。由我國自主研發(fā)的轉基因番木瓜“華農1號”品系［3］，也于2006年獲得安全證書并準許商業(yè)化生產。Cheng等［4］研發(fā)的轉基因番木瓜GM YK品系也在田間表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性。鑒于轉基因番木瓜已經在我國批準商業(yè)化生產，并且具有較大的市場份額，為保護消費者的知情權和選擇權，加強對轉基因番木瓜的監(jiān)管，建立和優(yōu)化快速、準確的檢測方法非常必要。

在轉基因作物的檢測方法中，基于PCR的核酸檢測方法被廣泛應用。合適的DNA提取與純化方法在很大程度上決定了PCR檢測的準確性與可靠性［5］。DNA的提取過程中要減少各種因素對核酸的破壞與降解作用，盡量去除材料中的蛋白質、多糖以及提取過程中使用的有機溶劑等雜質［6］。因而，DNA提取質量直接影響后續(xù)PCR檢測的質量和效率。常用的提取DNA的方法有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法、高鹽低pH法、聚乙烯吡咯烷酮法、試劑盒法等，但這些方法都需要多步操作，耗時繁瑣［6］。因此，快速、簡易抽提DNA的方法一直是研究的熱點，其中以水稻為材料的報道較多［7-10］；Zou等［11］研究建立的方法可以在30 s內從植物、動物或微生物材料中提取得到質量較高的核酸用于PCR檢測，但該方法需要在抽提過程中用濾紙將DNA轉移，對技術的要求較高?；谝陨希狙芯拷⒎竟喜牧匣蚪MDNA的簡易快速制備的方法，大大提升轉基因番木瓜檢測的效率，為轉基因番木瓜檢測提供重要的技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的非轉基因番木瓜臺農2號、轉基因番木瓜華農1號材料均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑 本研究所用制備緩沖液（10 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mol/L KCl，pH9.5）為國產分析純試劑和重蒸餾水配置；PCR試劑TaKaRa Taq Hot Start Version與TaKaRa Premix Ex Taq（Probe qPCR）、6×上樣緩沖液，購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 儀器 本研究所用主要儀器如下：Tissue Lyser高通量組織研磨儀（QIAGEN，德國）；臺式高速冷凍離心機Centrifuge 5415R（Eppendorf，德國）；T100TMThermal Cycler PCR熱循環(huán)儀與CFX Connect Real-Time System實時熒光PCR系統(tǒng)，普通電泳系統(tǒng)PowerPac Basic與SUB-CELL Model 96，凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR+（BIO-RAD，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料DNA的制備 根據不同番木瓜材料，DNA制備方法略有不同。

葉片材料：使用3-5 mm孔徑的圓形打孔器在葉片上打孔，把切割下來的圓形葉片置于2.0 mL離心管中，加入3顆3-5 mm硬質合金鋼珠，使用高通量組織研磨儀勻漿。12 000 r/min離心30 s，1片圓形葉片（約25 mg）加入100 μL制備緩沖溶液，渦旋混勻，65℃加熱10 min，12 000 r/min室溫離心10 min。

果肉：稱取100-200 mg果肉置于2.0 mL離心管中，加入3顆3-5 mm硬質合金鋼珠，使用高通量組織研磨儀勻漿。12 000 r/min離心30 s，每100 mg材料加入200 μL的制備緩沖溶液，渦旋混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min室溫離心10 min。

吸取經過離心后的上清液20 μL，加入制備緩沖溶液進行10倍稀釋即為DNA溶液的原液，通過加入制備緩沖溶液進行5-25倍稀釋用于PCR檢測。

1.2.2 引物與探針 Papain基因PCR方法引物探針參考國家標準農業(yè)農村部公告第323號-1-2020 《轉基因植物及其產品成分檢測 番木瓜內標準基因定性PCR方法》［12］、NPT II基因PCR方法引物探針參考中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 1196-2012 《轉基因成分檢測 玉米檢測方法》［13］、CaMV 35S啟動子、NOS終止子PCR方法引物探針參考國家標準農業(yè)部1782號公告-3-2012 《轉基因植物及其產品成分檢測 調控元件CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》［14］。所有引物及探針序列信息如表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 轉基因木瓜篩選檢測實時熒光PCR所用引物及探針序列信息Table 1 Primers and probes sequence information used in transgenic papaya real-time PCR detection

1.2.3 PCR方法 本研究使用的PCR方法包括普通PCR方法和實時熒光PCR方法。

普通PCR擴增體系包含：25 ng/μL DNA模板2.0 μL，5 U/μL Taq HS DNA聚合酶0.125 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5 μL，重蒸餾水補至25 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴增完成后，在每個PCR反應管內加入6×上樣緩沖液5.0 μL，混合均勻后取10.0 μL于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳結束進行凝膠成像分析。

實時熒光PCR擴增體系包含：2×TaKaRa Premix Ex Taq（Probe qPCR）10 μL，DNA模 板2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μmol/L探針0.4 μL，重蒸餾水補至20 μL。PCR擴增程序為：第一階段95℃ 1 min；第二階段95℃ 5 s；60℃ 30 s，循環(huán)數(shù)45（在第二階段的60℃延伸后采集熒光信號）。

2 結果

2.1 基因組DNA的制備

本研究制備番木瓜基因組DNA關鍵步驟主要包括根據勻漿樣品的量，加入適量的制備緩沖液；對緩沖液上清進行適當倍數(shù)稀釋。用于制備DNA的番木瓜組織制備流程如圖1所示，葉片的制備主要使用小孔徑打孔器，大約3-5 mm直徑；番木瓜果肉的制備主要采用稱量的方法。

圖1 葉片、果肉基因組DNA溶液制備流程圖Fig. 1 Genomic DNA preparation process of leaf and fruit

本方法制備番木瓜基因組DNA溶液由于含有較多的雜質，不能采用常用的方法對其進行濃度測定，我們對其質量的評價主要以PCR方法進行。

2.2 基因組DNA的普通PCR檢測

為了測試簡易法制備的基因組的質量，通過普通PCR的方法對其進行檢測。對鮮葉片、干葉片以及果肉基因組DNA溶液，分別以原液、5倍、25倍和125倍稀釋液共4個梯度濃度進行番木瓜內標準基因Papain的普通PCR擴增。電泳結果顯示，番木瓜鮮葉片基因組DNA溶液經過5-125倍稀釋以后均能擴增得到清晰特異的目的條帶，其中125倍稀釋的DNA溶液擴增條帶較弱，原液擴增條帶與5倍稀釋DNA條帶亮度沒有明顯變化（圖2-A）；番木瓜干葉片基因組DNA溶液經過稀釋以后，原液擴增條帶最亮，5倍稀釋樣品次之，25倍稀釋更弱，125倍稀釋的DNA溶液擴增條帶最弱，只能隱約看到條帶（圖2-B）；番木瓜果肉基因組DNA溶液PCR結果顯示，只有DNA原液和經過低倍稀釋（5倍）擴增的條帶清晰、特異（圖2-C）。說明，本方法建立的快速DNA制備方法獲得的番木瓜基因組DNA，可以應用于PCR檢測，并且抽提效果新鮮葉片強于干葉片，強于番木瓜果肉。

圖2 內標準基因Papain普通PCR擴增Fig. 2 PCR amplification of endogenous gene Papain

2.3 基因組DNA的實時熒光PCR檢測

為了驗證本研究中的制備緩沖液對實時熒光PCR沒有抑制作用，首先用制備緩沖液稀釋CTAB法提取的番木瓜基因組DNA，設置共7個梯度濃度作為梯度標準品（Std1-Std7）進行實時熒光定量PCR擴增，結果（表2）顯示，Std1-Std7標準品的重復性良好，標準曲線擴增效率為90.73%，相關系數(shù)R2=0.998 7（圖3-A），符合定量檢測要求，表明制備緩沖液可以直接用于實時熒光定量PCR檢測中。

對使用本方法提取番木瓜鮮葉片、干葉片以及果肉基因組DNA，并以原液5倍、25倍和125倍稀釋液共4個梯度濃度進行Papain基因實時熒光PCR擴增。鮮葉片和干葉片樣品提取的DNA標準曲線擴增效率分別為95.83%和102.09%（表2），相關系數(shù)分別為R2=0.991 3（圖3-B）和R2=0.999 4（圖3-C），不同稀釋倍數(shù)的樣品重復性也較好。果肉樣品提取的DNA，1-25倍稀釋時重復性較好；但當稀釋倍數(shù)為125倍時，部分樣品出現(xiàn)擴增不穩(wěn)定，重復性較差，部分平行沒有出現(xiàn)擴增曲線，導致了所計算的標準曲線擴增效率達到145.32%（表2），相關系數(shù)R2=0.987 2（圖3-D），說明果肉樣品可能含有較多的雜質影響PCR擴增。因而，本方法提取的葉片DNA在25倍以下的稀釋濃度，能滿足實時熒光PCR檢測的要求，而果肉樣品的基因組DNA制備，高倍稀釋時不能滿足實時熒光PCR檢測的要求。

表2 番木瓜Papain基因實時熒光定量PCRTable 2 Real-time fluorescence PCR of papaya endogenous Papain gene

圖3 番木瓜Papain基因實時熒光PCR標準曲線Fig. 3 Real-time fluorescence PCR standard curve of Papain gene

2.4 快速制備DNA模板靈敏度驗證

為了進一步對本研究建立基因組DNA制備方法進行驗證，制備質量分數(shù)為0.1%、1%、5%轉基因番木瓜的鮮葉片、干葉片、果肉樣品，用本方法制備DNA溶液（原液）進行轉基因成分驗證。普通PCR電泳結果顯示，Papain基因在所有的檢測樣品中都有特異的條帶擴增，大小與預期一致（圖4-A）；而CaMV 35S啟動子（圖4-B）、NOS終止子（圖4-C）、NPTⅡ基因（圖4-D）在0.1%的低濃度時，擴增條帶較弱；在5%的濃度時，擴增條帶強清晰特異，與預期結果相符。這些結果表明本方法制備的基因組DNA，在進行轉基因番木瓜普通PCR方法檢測時，可以獲得良好的效果。

圖4 轉基因番木瓜普通PCR電泳結果Fig. 4 PCR electrophoresis results of transgenic papaya

熒光定量PCR的結果（表3）顯示：在5%轉基因番木瓜的鮮葉片、干葉片、果肉樣品的檢測中，內標準基因Papain、外源基因CaMV 35S啟動子、NOS終止子、NPTⅡ基因均能得到典型擴增曲線和Ct值，且標準偏差值（SD）范圍在0.010-0.150之間，重復性良好；在1%樣品檢測中，不管內標準基因還是外源基因，均能得到典型擴增曲線和Ct值，且SD值范圍在0.010-0.504之間，重復性較好；在0.1%樣品檢測中，不管內標準基因還是外源基因，葉片樣品均能得到典型擴增曲線和Ct值，Ct值均小于36，且SD值范圍在0.036-0.551之間，重復性較好；而0.1%的果肉樣品，雖然內標準基因還是外源基因均能得到典型擴增曲線和Ct值，但外源基因部分平行擴增Ct值大于36，重復性稍差，如CaMV 35S和NPTⅡ基因的Ct值就差異比較大，SD值分別為1.660和1.415。以上結果說明用本方法制備的基因組DNA，可以用于不同葉片的檢測中，但是對于果肉等含有雜質比較多的樣品的檢測，在低含量時檢測具有局限性。

表3 轉基因番木瓜實時熒光定量PCR數(shù)據與分析Table 3 Data and analysis of real-time fluorescence PCR of transgenic papaya

3 討論

目前，已有多個轉基因番木瓜品系被各國批準商業(yè)化應用。在我國，由于轉基因番木瓜“華農1號”已經批準商業(yè)化種植，對轉基因番木瓜的管理和檢測技術的研究收到越來越多的重視。目前對轉基因番木瓜的檢測主要使用基于核酸的檢測方法，其中PCR方法是目前最成熟、應用最多的檢測方法。本研究建立了快速簡便的基因組DNA提取方法，與傳統(tǒng)的核酸提取方法（如CTAB法、SDS法、試劑盒法等）相比具有巨大的優(yōu)勢［6］，本研究建立的快速抽提和PCR檢測方法在特異性和靈敏度方面，可以滿足葉片和果實等不同組織的檢測需要。因此，在滿足PCR檢測要求的前提下，開發(fā)更簡單高效的轉基因番木瓜基因組DNA提取方法十分必要。

本方法的關鍵在于控制加入番木瓜材料的用量與加入制備緩沖液的比例，避免獲得的PCR模板中含過多的雜質抑制PCR擴增。本方法制備基因組DNA步驟簡單，僅需一次勻漿和離心，然后進行簡單的稀釋，即可直接獲得基因組DNA溶液用于普通PCR擴增以及實時熒光PCR擴增，稀釋范圍從1-25倍均可，適用范圍廣，效果良好，能制備較多的DNA溶液，滿足多次PCR檢測的需要。本方法與傳統(tǒng)的CTAB或SDS抽提方法相比，操作步驟大幅度減少，節(jié)省了抽提時間；即使與商業(yè)化的抽提試劑盒相比，也更簡單。而且，從樣品勻漿、制備PCR模板到PCR擴增均可使用96孔方孔板、96孔PCR板、多通道微量移液器等進行，更加高效，因而特別適合用于大批量番木瓜材料的轉基因成分檢測，能大大提高轉基因番木瓜檢測工作的效率。

本研究結果顯示，本方法用于制備轉基因番木瓜葉片和果肉樣品基因組DNA溶液效果較好，使用普通PCR方法及實時熒光PCR方法進行轉基因成分檢測時，含量低至0.1%的轉基因番木瓜基因組DNA仍然能擴增得到清晰的目的條帶或典型擴增曲線和Ct值，表明本方法可以用于轉基因番木瓜葉片與果肉樣品檢測。對于含雜質較多的果肉等樣品梯度稀釋時，實時熒光標準曲線的擴增效率超出正常范圍，因此，還需要進一步調整優(yōu)化提取方法和條件，以達到更好效果。

4 結論

本研究通過探索建立了一套適用于番木瓜轉基因成分檢測的快速制備基因組DNA模板的方法，使用該方法可以從各種葉片、果肉等組織提取得到番木瓜基因組DNA模板，獲得的模板能滿足普通PCR與實時熒光PCR檢測的要求。