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        轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組DNA的快速制備和PCR 檢測(cè)方法

        2021-08-11 02:46:08潘志文陳偉庭高潔兒周峰姚涓王聲斌姜大剛
        生物技術(shù)通報(bào) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:番木瓜果肉轉(zhuǎn)基因

        潘志文 陳偉庭 高潔兒 周峰 姚涓 王聲斌 姜大剛

        (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物及植物用微生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(廣州)/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣州 510642)

        自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化以來,創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益,為全球的糧食安全、氣候變化和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。全球轉(zhuǎn)基因作物種植規(guī)模日益擴(kuò)大,根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)發(fā)布的報(bào)告,2018年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積接近2億 hm2,主要包括玉米、大豆、棉花等[1]。在我國(guó),商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要包括轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因番木瓜。

        番木瓜(Carica papaya L.)又名木瓜,是著名的“嶺南佳果”。番木瓜生育期內(nèi)易受病害侵染,番木瓜環(huán)斑病毒(papaya ring spot virus,PRSV)的肆虐,導(dǎo)致全球各地的番木瓜品質(zhì)和產(chǎn)量大幅度降低,嚴(yán)重影響相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。1991年,F(xiàn)itch等[2]將PRSV病毒編碼外殼蛋白(coat protein,CP)的基因片段轉(zhuǎn)入番木瓜,培育出抗環(huán)斑病毒病的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1等品系,并于1998年5月在夏威夷商業(yè)化生產(chǎn)。由我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)1號(hào)”品系[3],也于2006年獲得安全證書并準(zhǔn)許商業(yè)化生產(chǎn)。Cheng等[4]研發(fā)的轉(zhuǎn)基因番木瓜GM YK品系也在田間表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性。鑒于轉(zhuǎn)基因番木瓜已經(jīng)在我國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn),并且具有較大的市場(chǎng)份額,為保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán),加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的監(jiān)管,建立和優(yōu)化快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法非常必要。

        在轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法中,基于PCR的核酸檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用。合適的DNA提取與純化方法在很大程度上決定了PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可靠性[5]。DNA的提取過程中要減少各種因素對(duì)核酸的破壞與降解作用,盡量去除材料中的蛋白質(zhì)、多糖以及提取過程中使用的有機(jī)溶劑等雜質(zhì)[6]。因而,DNA提取質(zhì)量直接影響后續(xù)PCR檢測(cè)的質(zhì)量和效率。常用的提取DNA的方法有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基硫酸鈉(SDS)法、高鹽低pH法、聚乙烯吡咯烷酮法、試劑盒法等,但這些方法都需要多步操作,耗時(shí)繁瑣[6]。因此,快速、簡(jiǎn)易抽提DNA的方法一直是研究的熱點(diǎn),其中以水稻為材料的報(bào)道較多[7-10];Zou等[11]研究建立的方法可以在30 s內(nèi)從植物、動(dòng)物或微生物材料中提取得到質(zhì)量較高的核酸用于PCR檢測(cè),但該方法需要在抽提過程中用濾紙將DNA轉(zhuǎn)移,對(duì)技術(shù)的要求較高?;谝陨?,本研究建立番木瓜材料基因組DNA的簡(jiǎn)易快速制備的方法,大大提升轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)的效率,為轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)提供重要的技術(shù)儲(chǔ)備。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 植物材料 本研究所用的非轉(zhuǎn)基因番木瓜臺(tái)農(nóng)2號(hào)、轉(zhuǎn)基因番木瓜華農(nóng)1號(hào)材料均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

        1.1.2 試劑 本研究所用制備緩沖液(10 mmol/L Tris,0.5 mmol/L EDTA,0.1 mol/L KCl,pH9.5)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┖椭卣麴s水配置;PCR試劑TaKaRa Taq Hot Start Version與TaKaRa Premix Ex Taq(Probe qPCR)、6×上樣緩沖液,購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

        1.1.3 儀器 本研究所用主要儀器如下:Tissue Lyser高通量組織研磨儀(QIAGEN,德國(guó));臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5415R(Eppendorf,德國(guó));T100TMThermal Cycler PCR熱循環(huán)儀與CFX Connect Real-Time System實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng),普通電泳系統(tǒng)PowerPac Basic與SUB-CELL Model 96,凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR+(BIO-RAD,美國(guó))。

        1.2 方法

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料DNA的制備 根據(jù)不同番木瓜材料,DNA制備方法略有不同。

        葉片材料:使用3-5 mm孔徑的圓形打孔器在葉片上打孔,把切割下來的圓形葉片置于2.0 mL離心管中,加入3顆3-5 mm硬質(zhì)合金鋼珠,使用高通量組織研磨儀勻漿。12 000 r/min離心30 s,1片圓形葉片(約25 mg)加入100 μL制備緩沖溶液,渦旋混勻,65℃加熱10 min,12 000 r/min室溫離心10 min。

        果肉:稱取100-200 mg果肉置于2.0 mL離心管中,加入3顆3-5 mm硬質(zhì)合金鋼珠,使用高通量組織研磨儀勻漿。12 000 r/min離心30 s,每100 mg材料加入200 μL的制備緩沖溶液,渦旋混勻,室溫靜置10 min,12 000 r/min室溫離心10 min。

        吸取經(jīng)過離心后的上清液20 μL,加入制備緩沖溶液進(jìn)行10倍稀釋即為DNA溶液的原液,通過加入制備緩沖溶液進(jìn)行5-25倍稀釋用于PCR檢測(cè)。

        1.2.2 引物與探針 Papain基因PCR方法引物探針參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第323號(hào)-1-2020 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) 番木瓜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法》[12]、NPT II基因PCR方法引物探針參考中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1196-2012 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法》[13]、CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子PCR方法引物探針參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3-2012 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) 調(diào)控元件CaMV 35S啟動(dòng)子、FMV 35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》[14]。所有引物及探針序列信息如表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        表1 轉(zhuǎn)基因木瓜篩選檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR所用引物及探針序列信息Table 1 Primers and probes sequence information used in transgenic papaya real-time PCR detection

        1.2.3 PCR方法 本研究使用的PCR方法包括普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

        普通PCR擴(kuò)增體系包含:25 ng/μL DNA模板2.0 μL,5 U/μL Taq HS DNA聚合酶0.125 μL,10 μmol/L上下游引物各1.0 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL,10×PCR Buffer(Mg2+plus)2.5 μL,重蒸餾水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,35次循環(huán);72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增完成后,在每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入6×上樣緩沖液5.0 μL,混合均勻后取10.0 μL于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束進(jìn)行凝膠成像分析。

        實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系包含:2×TaKaRa Premix Ex Taq(Probe qPCR)10 μL,DNA模 板2.0 μL,10 μmol/L上下游引物各0.8 μL,10 μmol/L探針0.4 μL,重蒸餾水補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋旱谝浑A段95℃ 1 min;第二階段95℃ 5 s;60℃ 30 s,循環(huán)數(shù)45(在第二階段的60℃延伸后采集熒光信號(hào))。

        2 結(jié)果

        2.1 基因組DNA的制備

        本研究制備番木瓜基因組DNA關(guān)鍵步驟主要包括根據(jù)勻漿樣品的量,加入適量的制備緩沖液;對(duì)緩沖液上清進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋。用于制備DNA的番木瓜組織制備流程如圖1所示,葉片的制備主要使用小孔徑打孔器,大約3-5 mm直徑;番木瓜果肉的制備主要采用稱量的方法。

        圖1 葉片、果肉基因組DNA溶液制備流程圖Fig. 1 Genomic DNA preparation process of leaf and fruit

        本方法制備番木瓜基因組DNA溶液由于含有較多的雜質(zhì),不能采用常用的方法對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定,我們對(duì)其質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要以PCR方法進(jìn)行。

        2.2 基因組DNA的普通PCR檢測(cè)

        為了測(cè)試簡(jiǎn)易法制備的基因組的質(zhì)量,通過普通PCR的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)鮮葉片、干葉片以及果肉基因組DNA溶液,分別以原液、5倍、25倍和125倍稀釋液共4個(gè)梯度濃度進(jìn)行番木瓜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain的普通PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示,番木瓜鮮葉片基因組DNA溶液經(jīng)過5-125倍稀釋以后均能擴(kuò)增得到清晰特異的目的條帶,其中125倍稀釋的DNA溶液擴(kuò)增條帶較弱,原液擴(kuò)增條帶與5倍稀釋DNA條帶亮度沒有明顯變化(圖2-A);番木瓜干葉片基因組DNA溶液經(jīng)過稀釋以后,原液擴(kuò)增條帶最亮,5倍稀釋樣品次之,25倍稀釋更弱,125倍稀釋的DNA溶液擴(kuò)增條帶最弱,只能隱約看到條帶(圖2-B);番木瓜果肉基因組DNA溶液PCR結(jié)果顯示,只有DNA原液和經(jīng)過低倍稀釋(5倍)擴(kuò)增的條帶清晰、特異(圖2-C)。說明,本方法建立的快速DNA制備方法獲得的番木瓜基因組DNA,可以應(yīng)用于PCR檢測(cè),并且抽提效果新鮮葉片強(qiáng)于干葉片,強(qiáng)于番木瓜果肉。

        圖2 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain普通PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of endogenous gene Papain

        2.3 基因組DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

        為了驗(yàn)證本研究中的制備緩沖液對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR沒有抑制作用,首先用制備緩沖液稀釋CTAB法提取的番木瓜基因組DNA,設(shè)置共7個(gè)梯度濃度作為梯度標(biāo)準(zhǔn)品(Std1-Std7)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,結(jié)果(表2)顯示,Std1-Std7標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為90.73%,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7(圖3-A),符合定量檢測(cè)要求,表明制備緩沖液可以直接用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中。

        對(duì)使用本方法提取番木瓜鮮葉片、干葉片以及果肉基因組DNA,并以原液5倍、25倍和125倍稀釋液共4個(gè)梯度濃度進(jìn)行Papain基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增。鮮葉片和干葉片樣品提取的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率分別為95.83%和102.09%(表2),相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.991 3(圖3-B)和R2=0.999 4(圖3-C),不同稀釋倍數(shù)的樣品重復(fù)性也較好。果肉樣品提取的DNA,1-25倍稀釋時(shí)重復(fù)性較好;但當(dāng)稀釋倍數(shù)為125倍時(shí),部分樣品出現(xiàn)擴(kuò)增不穩(wěn)定,重復(fù)性較差,部分平行沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,導(dǎo)致了所計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率達(dá)到145.32%(表2),相關(guān)系數(shù)R2=0.987 2(圖3-D),說明果肉樣品可能含有較多的雜質(zhì)影響PCR擴(kuò)增。因而,本方法提取的葉片DNA在25倍以下的稀釋濃度,能滿足實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求,而果肉樣品的基因組DNA制備,高倍稀釋時(shí)不能滿足實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求。

        表2 番木瓜Papain基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCRTable 2 Real-time fluorescence PCR of papaya endogenous Papain gene

        圖3 番木瓜Papain基因?qū)崟r(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Real-time fluorescence PCR standard curve of Papain gene

        2.4 快速制備DNA模板靈敏度驗(yàn)證

        為了進(jìn)一步對(duì)本研究建立基因組DNA制備方法進(jìn)行驗(yàn)證,制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1%、5%轉(zhuǎn)基因番木瓜的鮮葉片、干葉片、果肉樣品,用本方法制備DNA溶液(原液)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分驗(yàn)證。普通PCR電泳結(jié)果顯示,Papain基因在所有的檢測(cè)樣品中都有特異的條帶擴(kuò)增,大小與預(yù)期一致(圖4-A);而CaMV 35S啟動(dòng)子(圖4-B)、NOS終止子(圖4-C)、NPTⅡ基因(圖4-D)在0.1%的低濃度時(shí),擴(kuò)增條帶較弱;在5%的濃度時(shí),擴(kuò)增條帶強(qiáng)清晰特異,與預(yù)期結(jié)果相符。這些結(jié)果表明本方法制備的基因組DNA,在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番木瓜普通PCR方法檢測(cè)時(shí),可以獲得良好的效果。

        圖4 轉(zhuǎn)基因番木瓜普通PCR電泳結(jié)果Fig. 4 PCR electrophoresis results of transgenic papaya

        熒光定量PCR的結(jié)果(表3)顯示:在5%轉(zhuǎn)基因番木瓜的鮮葉片、干葉片、果肉樣品的檢測(cè)中,內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Papain、外源基因CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTⅡ基因均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值,且標(biāo)準(zhǔn)偏差值(SD)范圍在0.010-0.150之間,重復(fù)性良好;在1%樣品檢測(cè)中,不管內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還是外源基因,均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值,且SD值范圍在0.010-0.504之間,重復(fù)性較好;在0.1%樣品檢測(cè)中,不管內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還是外源基因,葉片樣品均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值,Ct值均小于36,且SD值范圍在0.036-0.551之間,重復(fù)性較好;而0.1%的果肉樣品,雖然內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還是外源基因均能得到典型擴(kuò)增曲線和Ct值,但外源基因部分平行擴(kuò)增Ct值大于36,重復(fù)性稍差,如CaMV 35S和NPTⅡ基因的Ct值就差異比較大,SD值分別為1.660和1.415。以上結(jié)果說明用本方法制備的基因組DNA,可以用于不同葉片的檢測(cè)中,但是對(duì)于果肉等含有雜質(zhì)比較多的樣品的檢測(cè),在低含量時(shí)檢測(cè)具有局限性。

        表3 轉(zhuǎn)基因番木瓜實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)與分析Table 3 Data and analysis of real-time fluorescence PCR of transgenic papaya

        3 討論

        目前,已有多個(gè)轉(zhuǎn)基因番木瓜品系被各國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用。在我國(guó),由于轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)1號(hào)”已經(jīng)批準(zhǔn)商業(yè)化種植,對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的管理和檢測(cè)技術(shù)的研究收到越來越多的重視。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的檢測(cè)主要使用基于核酸的檢測(cè)方法,其中PCR方法是目前最成熟、應(yīng)用最多的檢測(cè)方法。本研究建立了快速簡(jiǎn)便的基因組DNA提取方法,與傳統(tǒng)的核酸提取方法(如CTAB法、SDS法、試劑盒法等)相比具有巨大的優(yōu)勢(shì)[6],本研究建立的快速抽提和PCR檢測(cè)方法在特異性和靈敏度方面,可以滿足葉片和果實(shí)等不同組織的檢測(cè)需要。因此,在滿足PCR檢測(cè)要求的前提下,開發(fā)更簡(jiǎn)單高效的轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組DNA提取方法十分必要。

        本方法的關(guān)鍵在于控制加入番木瓜材料的用量與加入制備緩沖液的比例,避免獲得的PCR模板中含過多的雜質(zhì)抑制PCR擴(kuò)增。本方法制備基因組DNA步驟簡(jiǎn)單,僅需一次勻漿和離心,然后進(jìn)行簡(jiǎn)單的稀釋,即可直接獲得基因組DNA溶液用于普通PCR擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增,稀釋范圍從1-25倍均可,適用范圍廣,效果良好,能制備較多的DNA溶液,滿足多次PCR檢測(cè)的需要。本方法與傳統(tǒng)的CTAB或SDS抽提方法相比,操作步驟大幅度減少,節(jié)省了抽提時(shí)間;即使與商業(yè)化的抽提試劑盒相比,也更簡(jiǎn)單。而且,從樣品勻漿、制備PCR模板到PCR擴(kuò)增均可使用96孔方孔板、96孔PCR板、多通道微量移液器等進(jìn)行,更加高效,因而特別適合用于大批量番木瓜材料的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè),能大大提高轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)工作的效率。

        本研究結(jié)果顯示,本方法用于制備轉(zhuǎn)基因番木瓜葉片和果肉樣品基因組DNA溶液效果較好,使用普通PCR方法及實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí),含量低至0.1%的轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組DNA仍然能擴(kuò)增得到清晰的目的條帶或典型擴(kuò)增曲線和Ct值,表明本方法可以用于轉(zhuǎn)基因番木瓜葉片與果肉樣品檢測(cè)。對(duì)于含雜質(zhì)較多的果肉等樣品梯度稀釋時(shí),實(shí)時(shí)熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率超出正常范圍,因此,還需要進(jìn)一步調(diào)整優(yōu)化提取方法和條件,以達(dá)到更好效果。

        4 結(jié)論

        本研究通過探索建立了一套適用于番木瓜轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的快速制備基因組DNA模板的方法,使用該方法可以從各種葉片、果肉等組織提取得到番木瓜基因組DNA模板,獲得的模板能滿足普通PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的要求。

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