章英才 黃月 海源 張媛 扈亞杰 趙夢(mèng)怡

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

棗（Ziziphus jujuba Mill）為鼠李科（Rhamnaceae）、棗屬（Ziziphus Mill）落葉喬木，其果實(shí)的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都很高，是典型的具有藥食兼用的果品之一［1］。近年來，在棗屬植物果實(shí)解剖結(jié)構(gòu)特性［2］、棗果實(shí)維管束解剖結(jié)構(gòu)［3］等方面取得了一定的研究結(jié)果，反應(yīng)了不同棗屬植物的果實(shí)結(jié)構(gòu)存在著異同［4-8］。光合同化物進(jìn)入果實(shí)貯藏積累和運(yùn)輸經(jīng)歷了較復(fù)雜的過程，其中同化物韌皮部卸載過程是決定從“源”到“庫(kù)”果實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要步驟，對(duì)果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)起決定作用［9-10］。植物庫(kù)器官韌皮部卸載途徑主要有共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑兩種［11-12］，近年來果實(shí)生殖貯藏庫(kù)韌皮部同化物的卸載研究取得了顯著的進(jìn)展，揭示了許多果實(shí)同化物卸載的途徑及其卸載機(jī)制［13］。研究表明，冬棗、梨棗和酸棗果實(shí)發(fā)育早期或前期同化物從篩分子的卸出主要采取質(zhì)外體途徑，果實(shí)發(fā)育中期轉(zhuǎn)變?yōu)楣操|(zhì)體途徑，果實(shí)發(fā)育后期重新轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)外體卸載途徑［14-15］。因此，光合同化物在果實(shí)庫(kù)中的卸載，隨著不同類型的果實(shí)、果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期、以及果實(shí)庫(kù)器官的不同組織部位而存在著差異。

韌皮部同化物卸載的研究方法主要有生理方法，如“空種皮杯法”、“卸載穴法”、“漿果杯法”、“組織圓片法”等；植物解剖學(xué)研究方法，如透射電子顯微鏡胞間連絲的超微結(jié)構(gòu)觀察［15］、膠體金免疫電子顯微鏡觀察；熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)，如熒光探針引入示蹤結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡觀察［16-17］；其他研究韌皮部卸載細(xì)胞學(xué)路徑的方法，如顯微注射法、綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)、同位素示蹤放射自顯影技術(shù)等。其中，熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)研究植物體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸具有悠久的歷史，尤其是羧基熒光素酯的應(yīng)用極大的簡(jiǎn)化了韌皮部卸載和韌皮部后運(yùn)輸?shù)臋z測(cè)，并且，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，促進(jìn)了同化物的韌皮部卸載及其在細(xì)胞間運(yùn)輸?shù)难芯浚?6-17］。維管束是棗果實(shí)有機(jī)物和水分運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ?，而韌皮部為同化物卸載和運(yùn)輸?shù)闹饕獔?chǎng)所，在棗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成中具有非常重要的作用。熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)利用熒光染料的特點(diǎn)，使其與果實(shí)維管組織中的化合物結(jié)合而標(biāo)記，從而對(duì)卸載路徑的過程進(jìn)行示蹤。由于棗果實(shí)維管束深埋于組織中，對(duì)維管束在果實(shí)中的分布、果實(shí)維管束的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，是保障熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)研究結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。

靈武長(zhǎng)棗（Ziziphus jujuba Mill cv. Lingwuchangzao）原產(chǎn)于寧夏靈武市，是棗中一個(gè)較優(yōu)良的、經(jīng)過多年自然篩選、具有寧夏地方特色的藥食同源鮮果品種，具有較高的食用及藥用價(jià)值［18］。果實(shí)中同化物的積累受卸載路徑的影響，因此，研究果實(shí)韌皮部同化物卸載和運(yùn)輸?shù)耐緩?，?duì)提高同化物向果實(shí)中運(yùn)輸、闡明同化物積累機(jī)制非常重要［19］。目前，對(duì)靈武長(zhǎng)棗的研究多數(shù)集中于其鮮果保鮮、生物學(xué)特性以及品種培育方面，而對(duì)于棗果實(shí)的顯微結(jié)構(gòu)特征及其維管束的分布和結(jié)構(gòu)研究較少，果實(shí)的顯微結(jié)構(gòu)與其他棗屬植物果實(shí)的異同也未有系統(tǒng)研究，靈武長(zhǎng)棗果實(shí)同化物卸載途徑與冬棗、梨棗和酸棗等棗品種是否存在差異并不清楚。本研究以不同發(fā)育時(shí)期靈武長(zhǎng)棗果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，在前期研究的基礎(chǔ)上［20-21］，采用石蠟切片技術(shù)明確不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)維管束分布、結(jié)構(gòu)特征和變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，通過棗果實(shí)維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應(yīng)用，采用熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)，探討棗果實(shí)維管束韌皮部同化物卸載路徑的研究方法，為棗屬及其他同類果實(shí)同化物韌皮部卸載研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地6年生“靈武長(zhǎng)棗”為供試材料，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每次重復(fù)選擇生長(zhǎng)發(fā)育良好、樹勢(shì)適中、長(zhǎng)勢(shì)和花期相似、栽培管理水平一致的5-10株植株。用毛線于6月10日標(biāo)記同一天開放的花朵，每個(gè)重復(fù)標(biāo)記3 000朵。

在“靈武長(zhǎng)棗”開花坐果到果實(shí)成熟的發(fā)育過程中共設(shè)計(jì)4次實(shí)驗(yàn)，具體分別在果實(shí)膨大前期（7月10日）、快速膨大期（8月9日）、著色期（9月8日）、完熟期（9月28日）左右，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間均設(shè)定于上午9：00-11：00進(jìn)行，按所標(biāo)記植株從樹冠的東、西、南、北4個(gè)方位以及上、中、下、里、外各個(gè)方向選擇標(biāo)記花朵的棗吊作為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行石蠟切片試驗(yàn)和熒光示蹤劑引入試驗(yàn)，其中熒光示蹤劑引入試驗(yàn)后將棗吊采摘用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，以試驗(yàn)部位的棗果實(shí)作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 棗果實(shí)石蠟切片制作及觀察 不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，用刀片分割成合適的小塊，迅速投入FAA（70%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5）固定液中，抽氣至樣品沉底；固定24 h后將樣品從FAA固定液中取出，依次經(jīng)過不同濃度梯度的酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，包埋塊采用石蠟切片法切片，切片厚度8-12 μm；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、復(fù)水、番紅染色（50%酒精溶液配置）、脫水、固綠染色（95%酒精溶液配置）、脫水、透明、加拿大樹膠封片［20-21］，經(jīng)過LEICA顯微鏡下觀察并 拍照。

1.2.2 棗熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)

1.2.2.1 羧基熒光素酯（CFDA）的引入標(biāo)記

（1）羧基熒光素酯（CFDA）母液的配制：用丙酮溶解熒光染料5（6）羧基熒光素酯（5（6）-carboxyfluorescein diacetate，CFDA）（Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品），使得羧基熒光素酯CFDA母液的濃度為25 mg/mL。避光貯存在-20℃。

（2）CFDA母液的稀釋：用含有5 mmol/L Mes-Tris和300 mmol/L山梨醇、pH為5.5的溶液稀釋熒光素母液，使熒光素的濃度為1 mg/mL，得到熒光素稀釋液，備用。

（3）CFDA的引入方法：由于靈武長(zhǎng)棗果柄較短、質(zhì)脆、易斷裂造成果實(shí)脫落，因此選取靠近果柄的短枝作為引入熒光素酯的操作點(diǎn)。具體引入方法如下：方法1：選擇標(biāo)記花朵的棗吊，將靠近果柄的短枝沖洗干凈后擦干，將1.5 mL尖底微量Eppendorf離心管底部用末端纏繞脫脂棉（占據(jù)管體積的2/3）的細(xì)棉線穿過后，將棉線的另一端用一細(xì)針（或縫紉針）從上向下穿過短枝韌皮部，不要?jiǎng)潅虼┩改举|(zhì)部（圖1-A）；用細(xì)鐵絲將Eppendorf管固定并保持豎直（圖1-B）；將棉線纏繞于短枝四周對(duì)該棉線進(jìn)行固定，迅速在針穿進(jìn)和穿出的部位滴加適量2.5 mmol/L EDTA（也可用移液槍滴入傷口處），防止胼胝質(zhì)形成而阻礙運(yùn)輸，在針穿出部位涂抹凡士林防止CFDA溶液流失，用微量注射器向Eppendorf管中注入200 μL CFDA稀釋液（圖1-C）；迅速蓋好離心管蓋子（扎有通氣小孔），并用錫箔紙包好，防止CFDA見光分解，用剪刀剪掉短枝前端的枝條和葉片（圖1-D）。CFDA溶液在大氣壓力下慢慢滲入棉線進(jìn)而進(jìn)入韌皮部。CFDA處理48 h后采摘棗吊，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室。

圖1 CFDA的引入方法1圖示Fig.1 Photos showing the introduction method 1 of CFDA

方法2：選擇標(biāo)記花朵的棗吊，用砂布將靠近果柄的短枝表皮輕輕磨擦后，用水沖洗掉表皮毛，不傷及木質(zhì)部，迅速將棉花團(tuán)纏繞在靠近果柄的短枝上（圖2-A）；用封口膜將棉花團(tuán)封好以免CFDA溶液揮發(fā)，采用微量注射器將配制好的1 mg/mL CFDA溶液200 μL緩慢注入棉花（圖2-B）；立即用封口膜（可再涂抹凡士林）密封針孔防止溶液外滲（圖2-C）；然后用錫箔紙將靠近果柄的短枝部位覆蓋好，防止CFDA見光分解，用剪刀剪掉短枝前端的枝條和葉片（圖2-D）。CFDA在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)48 h后采摘棗吊，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室。

圖2 CFDA的引入方法2圖示Fig.2 Photos showing the introduction method 2 of CFDA

1.2.2.2 洋地黃皂苷的引入處理 洋地黃皂苷對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜有通透作用，用洋地黃皂苷處理作為對(duì)照（處理）。選擇部分標(biāo)記花朵的棗吊，在引入CFDA的同時(shí)，將200 μL左右濃度為80 μg/mL（由二甲基亞砜母液稀釋所得）的洋地黃皂苷，采用前述引入CFDA的方法［見1.2.2.1（3）方法1和方法2］引入果實(shí)（圖3-A-F）。CFDA和洋地黃皂苷引入時(shí)，可以任意采用引入CFDA的方法1或方法2，可以相同也可以不同；如圖3所示，CFDA的引入采用方法1，洋地黃皂苷的引入采用方法2（圖3），CFDA和洋地黃皂苷引入方法不同。處理48 h后采摘棗吊，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室。

圖3 CFDA和洋地黃皂苷同時(shí)引入的方法圖示Fig.3 Photos showing the simultaneous introduction methods of CFDA and digitonin

1.2.2.3 Texas-Red的引入標(biāo)記 德克薩斯紅Texas-Red（磺酰羅丹明101磺酰氯）是一種紅色的活細(xì)胞熒光染料，可以將Texas-Red引入果實(shí)來標(biāo)記木質(zhì)部，從而達(dá)到區(qū)分木質(zhì)部與韌皮部的目的。將部分CFDA標(biāo)記棗果實(shí)果柄浸泡于1 mg/mL Texas-Red溶液中（或?qū)⒐捻g皮部完全去掉，只留下木質(zhì)部），避光標(biāo)記30-40 min，Texas-Red溶液在蒸騰拉力的作用下被吸進(jìn)木質(zhì)部（圖4）。標(biāo)記結(jié)束立即進(jìn)行組織切片置于激光共聚焦顯微鏡CLSM下進(jìn)行觀察。

圖4 Texas-Red標(biāo)記的方法圖示Fig.4 Photos showing the introduction method of Texas-Red

1.2.2.4 組織切片 將試驗(yàn)植株的3次重復(fù)處理的棗吊上采摘的果實(shí)3-5個(gè)，果實(shí)洗凈、擦干，選取帶有維管束的果肉組織分別進(jìn)行徒手縱切或橫切，用體積百分含量為80%的甘油封片（可防止熒光的快速泯滅，同時(shí)價(jià)格低廉節(jié)省材料），低溫避光保存，盡快用激光共聚焦掃描顯微鏡CLSM觀察CFDA和Texas-Red在果實(shí)維管束內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，觀察熒光并拍照。

1.2.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察 用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）分別觀察只引入CFDA、同時(shí)引入CFDA和洋地黃皂苷、同時(shí)引入CFDA和Texas-Red后，CFDA在棗果實(shí)維管束內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和Texas-Red的標(biāo)記情況。CFDA產(chǎn)生的熒光采用488 nm激光激發(fā)，Texas-Red采用543 nm激光激發(fā)，利用CLSM觀察熒光染料的標(biāo)記情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 棗果實(shí)維管束特征分析

膨大前期果實(shí)的維管束數(shù)量較多，尤其是內(nèi)果皮附近的維管束數(shù)量多、分布集中（圖5-A-C）。維管束發(fā)育趨向成熟，此時(shí)有單個(gè)維管束進(jìn)行發(fā)育，也有兩個(gè)維管束背靠背進(jìn)行發(fā)育，木質(zhì)部、形成層、韌皮部可以初步分辨（圖5-B-D）。形成層由多層的扁平細(xì)胞構(gòu)成，將木質(zhì)部與韌皮部分隔開，韌皮部由小的排列緊密的韌皮薄壁細(xì)胞、篩管、伴胞組成，排列較為緊密（圖5-B-D）。

圖5 膨大前期果實(shí)維管束特征Fig.5 Vascular bundles characteristic of fruit during the early bulking period

快速膨大期果實(shí)薄壁組織內(nèi)分布著基本成熟的維管束，由于果實(shí)的快速膨大，致使相同視野內(nèi)維管束的分布減少，此時(shí)期的維管束多為兩兩背靠背式、3個(gè)或4個(gè)圍成圓式發(fā)育，維管束木質(zhì)部、形成層、韌皮部清晰可辨，各維管束木質(zhì)部彼此緊靠，木質(zhì)部的導(dǎo)管細(xì)胞壁木質(zhì)化明顯（圖6-A-B）。韌皮部的篩管與篩胞清晰可辨，由木質(zhì)部向外延伸的形成層和韌皮部的中心基本在一條直線上，三者排列似扇形，形成層與韌皮部的面積寬廣（圖6-C-D）。

圖6 快速膨大期果實(shí)維管束特征Fig.6 Vascular bundles characteristic of fruit during the rapid enlargement period

著色期果實(shí)發(fā)育結(jié)構(gòu)特征基本與快速膨大期相似，此時(shí)中果皮的細(xì)胞空腔進(jìn)一步增大，數(shù)量增多，圍成空腔的薄壁細(xì)胞拉長(zhǎng)，體積增大明顯（圖7-AB）。相同視野內(nèi)的維管束數(shù)量更少，維管束主要有四至八個(gè)圍成并產(chǎn)生多個(gè)分支結(jié)構(gòu)，木質(zhì)部、形成層、韌皮部的排列與快速膨大期基本相同，結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)育成熟，韌皮部篩管與伴胞分化明顯、清晰可辨（圖7）。

圖7 著色期果實(shí)維管束特征Fig.7 Vascular bundles characteristic of fruit during the coloring period

完熟期果實(shí)薄壁細(xì)胞形成的空腔繼續(xù)增大，空腔的分布擴(kuò)散至整個(gè)中果皮（圖8-A-B）。與著色期相比，維管束數(shù)量亦無明顯變化，但普遍出現(xiàn)相鄰維管束鏈接成線，且在維管束橫切中出現(xiàn)縱切現(xiàn)象，可能是由于維管束在后期發(fā)育時(shí)會(huì)出現(xiàn)維管束分叉現(xiàn)象，生長(zhǎng)時(shí)間越長(zhǎng)分叉現(xiàn)象越明顯（圖8-B-D）。

圖8 完熟期果實(shí)維管束特征Fig.8 Vascular bundles characteristic of fruit during the maturation period

2.2 棗果實(shí)維管束熒光示蹤劑引入結(jié)果

5（6）羧基熒光素酯（CFDA）引入韌皮部后，由細(xì)胞內(nèi)源酯酶分解為有熒光信號(hào)的5（6）羧基熒光素（CF），轉(zhuǎn)變?yōu)槟げ煌ㄍ傅臒晒庵甘緞稍陧g皮部長(zhǎng)距離運(yùn)輸。CFDA引入膨大前期果實(shí)48 h后采摘果實(shí)橫切，CLSM觀察到不僅果實(shí)的韌皮部中具有明顯的CF綠色熒光，同時(shí)在周圍薄壁細(xì)胞中也分布著CF綠色熒光（圖9-A1-A3），說明在膨大前期韌皮部和周圍薄壁細(xì)胞之間存在著共質(zhì)體聯(lián)系，果實(shí)韌皮部同化物為共質(zhì)體卸載途徑；并且，韌皮部CF綠色熒光的分布也反映了維管束數(shù)量較多且分布集中，既有維管束單個(gè)發(fā)育，也有兩個(gè)維管束背靠背發(fā)育，其CF綠色熒光分布在外圍，而木質(zhì)部位于中央，熒光示蹤劑分布特征與膨大前期果實(shí)維管束特征一致（圖5）。快速膨大期果實(shí)CF綠色熒光主要局限于果實(shí)的韌皮部中，但韌皮部周圍薄壁細(xì)胞中也分布著少量的CF綠色熒光（圖9-B1），當(dāng)同時(shí)引入CFDA和洋地黃皂苷48 h后，周圍薄壁細(xì)胞中CF綠色熒光明顯增加（圖9-B2），說明快速膨大期果實(shí)主要以質(zhì)外體途徑運(yùn)輸同化物，但也通過共質(zhì)體卸出同化物；并且，韌皮部CF綠色熒光的分布反映了維管束數(shù)量的減少（圖9-B1-B2），由于維管束多為兩兩背靠背式、3個(gè)或4個(gè)圍成圓式發(fā)育，各維管束木質(zhì)部彼此緊靠，排列似扇形（圖6-C-D），因而，維管束縱切CF綠色熒光分布在外圍，而木質(zhì)部分布于中央（圖9-B1-B2）。CFDA引入著色期果實(shí)48 h后綠色熒光局限于果實(shí)的韌皮部中，在韌皮部周圍薄壁細(xì)胞中基本沒有CF綠色熒光（圖9-C1），當(dāng)同時(shí)引入CFDA和洋地黃皂苷48 h后，周圍薄壁細(xì)胞中分布著大量的CF綠色熒光（圖9-C2），說明著色期果實(shí)通過質(zhì)外體途徑運(yùn)輸同化物；并且，韌皮部CF綠色熒光的分布一定程度反映了維管束數(shù)量的減少（圖9-C1-C2），以及多個(gè)維管束形成的多分支結(jié)構(gòu)（圖7-A-D）。完熟期韌皮部CF綠色熒光的分布說明了維管束數(shù)量的減少，維管束縱切CF綠色熒光分布在外圍，而木質(zhì)部分布于中央反映了維管束產(chǎn)生的分支結(jié)構(gòu)（圖9-D1-D2）；并且，Texas-Red紅色的活細(xì)胞熒光染料引入部分已經(jīng)被CFDA標(biāo)記48 h后的完熟期棗果實(shí)，CFDA標(biāo)記且局限于維管束韌皮部（圖9-D1），紅色熒光示蹤劑Texas-Red標(biāo)記木質(zhì)部（圖9-D2），維管束木質(zhì)部與韌皮部清晰分明，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。不同發(fā)育時(shí)期棗果實(shí)維管束熒光示蹤劑引入結(jié)果，反映了熒光示蹤劑的分布特征與維管束分布特征的相關(guān)性。

圖9 棗果實(shí)維管束熒光示蹤圖Fig.9 Fluorescence tracing map of vascular bundles in jujube fruit

3 討論

熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)利用熒光染料的特點(diǎn)，將熒光染料引入棗果實(shí)維管束中，使其與果實(shí)維管組織中的化合物結(jié)合而標(biāo)記，經(jīng)徒手切片或冰凍切片在CLSM下觀察，從而對(duì)卸載路徑的過程進(jìn)行示蹤。由于棗果實(shí)體積較小且維管束深埋于薄壁組織中，較其他切片方式而言，徒手切片為活細(xì)胞觀察但其切片厚度一般不易掌握，往往會(huì)出現(xiàn)切片較厚的情況，在普通顯微鏡下不易識(shí)別維管束的特征，CLSM熒光條件下更不易識(shí)別，為保障徒手切片在CLSM下觀察同化物卸載路徑研究的準(zhǔn)確性，避免盲目觀察產(chǎn)生的錯(cuò)誤。因此，通過石蠟切片技術(shù)首先明確不同發(fā)育時(shí)期棗果實(shí)維管束結(jié)構(gòu)特征、分布和變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，通過棗果實(shí)維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應(yīng)用，探討棗果實(shí)維管束韌皮部同化物卸載路徑，是保障熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)研究結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。邊媛［3］的研究認(rèn)為，棗果實(shí)維管束有核內(nèi)維管束、內(nèi)果皮維管束和中果皮維管束3種類型，均由果柄維管束發(fā)育而來，核內(nèi)維管束直接由果柄中心2條維管束伸入果核形成，內(nèi)果皮和中果皮維管束由果柄其余10條維管束及其分支形成。我們的研究也認(rèn)為，隨果實(shí)的發(fā)育，維管束分支逐漸增加，形態(tài)因分支數(shù)目、分支角度不同，并且維管束均為外韌無限維管束，呈卵圓形，木質(zhì)部導(dǎo)管呈輻射狀緊密排列在維管束內(nèi)側(cè)，韌皮部排列在維管束外側(cè)與木質(zhì)部并生成束。膨大前期果皮維管束韌皮部比較發(fā)達(dá)，為早期內(nèi)果皮木質(zhì)化對(duì)大量物質(zhì)的需求提供了可能，從快速膨大期到著色期、完熟期隨果肉細(xì)胞發(fā)育，維管束分支增多，由最初的2個(gè)、3個(gè)分支增加到4個(gè)分支，與葡萄果實(shí)維管束的發(fā)育相似［22］。認(rèn)為棗果實(shí)發(fā)育過程中維管束分支數(shù)目的增加與果實(shí)膨大生長(zhǎng)相適應(yīng)，為果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

棗果實(shí)韌皮部同化物卸載運(yùn)輸途徑的研究非常重要，相比其他文獻(xiàn)，以圖示的方式全過程展示棗熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)是本文最大的亮點(diǎn)之一。CFDA和Texas-Red是目前應(yīng)用廣泛的熒光染料，Texas-Red可引入棗果實(shí)來標(biāo)記木質(zhì)部，CFDA對(duì)細(xì)胞無毒且化學(xué)惰性，具有膜透性，引入韌皮部后，其運(yùn)輸方式與同化物的卸載方式相類似，是一個(gè)比較理想的共質(zhì)體標(biāo)記物，被用于不同類型庫(kù)器官中同化物的卸載路徑研究。當(dāng)CFDA被裝載到細(xì)胞里，經(jīng)內(nèi)源酯酶分解為膜不通透的共質(zhì)體同化物卸載的熒光指示劑CF，CF與同化物結(jié)合，其與蔗糖的運(yùn)輸途徑也極為相似，能沿著胞間連絲擴(kuò)散，從而對(duì)同化物韌皮部卸載路徑進(jìn)行標(biāo)記。并且結(jié)合具有質(zhì)膜通透作用的洋地黃皂苷的同步引入果實(shí)處理，作為韌皮部質(zhì)外體卸載途徑特征的印證。通過在CLSM下觀察CF和Texas-Red在棗果實(shí)內(nèi)的分布情況，完整的記錄活體細(xì)胞內(nèi)部的連續(xù)變化，進(jìn)而明確棗果實(shí)韌皮部同化物卸載的路徑。在傳統(tǒng)熒光染料活細(xì)胞示蹤法的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用了一種更為有效的、多途徑引入韌皮部熒光示蹤劑CFDA和木質(zhì)部熒光示蹤劑Texas-Red、可快速示蹤棗果實(shí)韌皮部同化物卸載路徑的熒光標(biāo)記方法，熒光染料引入棗果實(shí)不需要專門的設(shè)備，操作方便，在CLSM熒光觀察過程中不需對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理、成本低廉、高效，觀察結(jié)果可靠度高。其特點(diǎn)主要表現(xiàn)在以下方面：（1）活體標(biāo)記，可以追蹤熒光染料在果實(shí)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律；（2）安全，無需使用放射性同位 素；（3）相關(guān)性高的特定示蹤，熒光的分布反映了同化物的卸載路徑；（4）簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單且CLSM觀察結(jié)果可靠；（5）穩(wěn)定性好，進(jìn)入細(xì)胞后熒光不受內(nèi)環(huán)境影響；（6）結(jié)果客觀，熒光染料的引入對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)沒有任何影響；（7）經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，費(fèi)用經(jīng)濟(jì)且效率高。

在熒光示蹤劑引入位點(diǎn)的選擇方面，一類如無花果［16］等果柄較長(zhǎng)、質(zhì)地較堅(jiān)韌結(jié)實(shí)、不容易斷裂的果實(shí)，可采用果柄部位引入熒光示蹤劑研究同化物韌皮部的卸載路徑，果柄是引入熒光示蹤劑的最佳部位；另一類如藍(lán)莓［17］等果柄較短、質(zhì)地不夠堅(jiān)韌結(jié)實(shí)的果實(shí)，通過果穗所在的莖將熒光示蹤劑引入韌皮部。對(duì)于“靈武長(zhǎng)棗”這類棗屬植物來說，由于棗的葉肉細(xì)胞小而緊密，細(xì)胞間隙小，葉表皮覆蓋著蠟質(zhì)，通過摩擦葉片表皮或通過葉片壓力注射等方法很難將熒光素物質(zhì)引入葉片韌皮部；并且，由于木本果樹代謝復(fù)雜，韌皮部流速度慢、距離長(zhǎng)，可能導(dǎo)致熒光示蹤劑因長(zhǎng)時(shí)間引入而淬滅，達(dá)不到理想的標(biāo)記效果，從而影響實(shí)時(shí)追蹤同化物在果實(shí)內(nèi)的卸載和運(yùn)輸情況；另外，由于棗果柄非常短細(xì)、質(zhì)脆、特別容易斷裂造成果實(shí)脫落，通過棗果柄處韌皮部引入熒光示蹤劑操作異常困難，因此選取靠近果柄的短枝作為引入熒光素酯的位點(diǎn)，有利于熒光示蹤劑以較短的距離快速引入果實(shí)，避免了熒光的快速泯滅。

在熒光示蹤劑引入劑量和時(shí)間的選擇方面，無花果［16］采用的劑量為1 mg/mL CFDA溶液200 μL，引入時(shí)間為24 h，Texas-Red引入時(shí)間為1 mg/mL 30 min；而藍(lán)莓［17］采用的劑量為1 mg/mL CFDA溶液200 μL，引入時(shí)間為48 h或72 h，Texas-Red引入時(shí)間為1 mg/mL 40 min左右。由于本實(shí)驗(yàn)方法為定性研究方法，膨大前期果實(shí)體積較小，引入可以采用1 mg/mL CFDA溶液200 μL、80 μg/mL洋地黃皂苷200 μL左右的常規(guī)濃度和劑量，引入時(shí)間選擇48 h的適中時(shí)間；而從快速膨大期到著色期、完熟期隨果實(shí)發(fā)育體積不斷增大，CFDA和洋地黃皂苷引入的劑量也可以適當(dāng)增多，Eppendorf管和引入用的棉花團(tuán)的體積也要相應(yīng)增大，引入時(shí)間也可略微延長(zhǎng)；而對(duì)于Texas-Red引入來說，采用1 mg/mL Texas-Red引入30-40 min，也可以適當(dāng)增加引入的時(shí)間。但不論是CFDA還是Texas-Red，引入時(shí)間都不能過長(zhǎng)，否則會(huì)引起熒光的快速泯滅而影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確。

另外，由于棗吊短枝前端的枝條和葉片，特別是非功能葉片作為庫(kù)存在，能和果實(shí)競(jìng)爭(zhēng)而固定一部分CFDA熒光染料或洋地黃皂苷，使得引入果實(shí)內(nèi)的熒光染料或洋地黃皂苷減少，不能達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，影響CLSM觀察結(jié)果。如果通過加大CFDA熒光染料和洋地黃皂苷用量來彌補(bǔ)，一方面對(duì)果實(shí)有害；另一方面也造成了不必要的浪費(fèi)。因此，在CFDA和洋地黃皂苷引入操作時(shí)，通過剪掉短枝前端的枝條和葉片的方法來避免此情況的發(fā)生。

4 結(jié)論

通過“靈武長(zhǎng)棗”果實(shí)維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應(yīng)用，采用1 mg/mL CFDA溶液200 μL、80 μg/mL洋地黃皂苷200 μL的常規(guī)引入濃度和劑量，選擇48 h的適中引入時(shí)間，Texas-Red采用1 mg/mL濃度引入30-40 min，定性研究了棗果實(shí)維管束韌皮部同化物卸載路徑，以圖示的方式全過程展示棗熒光染料活細(xì)胞示蹤技術(shù)，創(chuàng)新應(yīng)用了具有質(zhì)膜通透作用的洋地黃皂苷的同步引入處理，作為韌皮部質(zhì)外體卸載途徑特征的印證，取得了較好的研究結(jié)果。