董自星，楊爽爽，唐存多，姚倫廣，闞云超

（1.南陽師范學(xué)院昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實驗室和河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點實驗室, 河南南陽 473061；2.南陽師范學(xué)院體育學(xué)院, 河南南陽473061）

磷脂酶是指催化磷脂的各種水解反應(yīng)的一類酶。根據(jù)水解磷脂位置的不同，可以將磷脂酶分為五類：磷脂酶A1、A2、B、C和D。其中，磷脂酶D（Phospholipase D，簡稱PLD，EC 3.1.4.4）是作用于磷脂分子中磷酸與有機堿間磷酰氧鍵（P-O）的一類酶[1]。作為磷酸二酯酶超家族的一員，PLD是催化磷脂水解第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一，參與細胞脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物膜形成等[2]。此外，它還可以催化各種羥基化合物與磷脂堿基結(jié)合形成新的磷脂，這一重要的特性稱為磷脂酶D的堿基交換反應(yīng)（Base exchange reaction），也稱為轉(zhuǎn)磷脂反應(yīng)（Transphosphatidylation）[3]。利用PLD的這一重要特性可以合成稀有磷脂（如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油以及新型甘油醚磷脂等）[4?6]、新型藥物釋放系統(tǒng)[7]等。因此，PLD被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。

磷脂酶D廣泛分布于病毒、動物、植物和微生物中[3]。由于具有較好的轉(zhuǎn)磷脂活性、較廣泛的底物特異性和較強的底物耐受性，微生物來源的磷脂酶D在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用較為廣泛。自20世紀70年代以來，已報道的PLD主要來源于革蘭氏陽性菌，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）[8?10]、輪枝鏈霉菌屬（Streptoverticillium）[11]、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）[12]、芽胞桿菌屬（Bacillus）[13]、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）[14]和 熱 密 卷 菌 屬（Thermocrispum）[15]等。其中，鏈霉菌來源的PLD是目前報道最多的，且它們具有較好的水解和轉(zhuǎn)磷脂活性[1]。一些革蘭氏陰性菌也具有PLD活性，如不動桿菌屬（Acinetobacter）[4]、希瓦氏菌屬（Shewanella）[16]、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）[17]、大腸桿菌屬（Escherichia）[18,19]、沙門氏菌屬（Salmonella）[20]、變形桿菌屬（Proteus）[20]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[20]、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）[21]和弧菌屬（Vibrio）[22]等。此外，少數(shù)酵母菌和絲狀真菌也能生產(chǎn)PLD，包括酵母屬（Saccharomyces）[23]、假絲酵母屬（Candida）[24]、裂 殖 酵 母 屬（Schizosaccaromyces）[25]、曲 霉 屬（Aspergillus）[26]、地霉屬（Geotrichum）[27]和鐮刀菌屬（Fusarium）[28]等。

目前，國外對微生物PLD的研究已較為成熟，一些酶制劑公司已篩選出高產(chǎn)PLD的鏈霉菌菌株。但鏈霉菌較長的生長周期（近7 d）給實際生產(chǎn)和應(yīng)用帶來了許多困難，而且商品化PLD的價格非常昂貴，如Sigma-Aldrich公司的Streptomycessp. PLD酶制劑，每毫克售價約一千元人民幣左右。而目前國內(nèi)由微生物發(fā)酵制備PLD的研究才剛剛起步，基本上都停留在實驗室水平，還沒有相關(guān)的PLD產(chǎn)品。隨著應(yīng)用研究的不斷深入，對微生物PLD的屬性特別是生物活性與生化特征多樣性的需求也越來越迫切。因此，如何獲得催化性能優(yōu)良的PLD，并實現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)成為當(dāng)前研究的核心任務(wù)。除了從自然界中篩選、誘變育種和原生質(zhì)體融合等傳統(tǒng)方法，通過分子克隆與基因重組技術(shù)將pld基因進行克隆表達，也是實現(xiàn)其高效表達的一條有效途徑。本文先對已克隆的微生物PLD的來源、基因序列和轉(zhuǎn)磷脂活性進行了比較，然后同時從分子水平和發(fā)酵水平對其高效表達方面的研究進展進行了分析，并對其未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 微生物磷脂酶D的克隆

獲得具有優(yōu)良催化特性、適合工業(yè)化應(yīng)用的酶源是實現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前已克隆的微生物磷脂酶D大部分來源于細菌（主要是鏈霉菌），少部分來源于酵母和絲狀真菌，但只有細菌來源的PLD被表達（表1）。其中，細菌PLD一般由307～587個氨基酸殘基組成，其單體的相對分子質(zhì)量為29.0～64.0 kDa，而已克隆的酵母和真菌PLD比較大，由833～1823個氨基酸組成，其理論分子量為95.7～204.8 kDa。進化樹的分析表明，已克隆表達的細菌來源PLD可以分為三類：I和III類主要來源于鏈霉菌屬，對磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率為4%～91.4%；而II類PLD則來源于其它細菌，它們對磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率較高，可達到86%～100%（圖1）[4,19]。其中，ArPLD沒有水解活性，只有轉(zhuǎn)磷脂活性，它對磷酯酰絲氨酸和二十二碳六烯酸-磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率和選擇性均為100%，這是目前已報道的唯一具有此優(yōu)良催化特性的磷脂酶D[4]。此外，微生物PLD一般含有兩個高度保守的、與催化活性有關(guān)的HXKX4D（X為任意氨基酸，簡稱HKD）基序，其中一個His是攻擊磷原子的親核基團，而另一個His是酸堿催化劑。由圖2可知，I類PLD含有兩個保守的HKD基序，二者之間相差247～364 aa；II類PLD也含有兩個保守的HKD基序。其中，第一個HKD基序與I類PLD的第一個HKD基序是對應(yīng)的，但第二個HKD不相互對應(yīng)，且兩個HKD基序相差123～216 aa。而III類PLD的兩個HKD基序分別是HXKX3D和HXKX7D[29]，而且它們不是高度保守的，二個基序之間相差12 aa。其中，CpPLD和TsPLD不含有HKD基序，它們中可能參與催化的兩個His用粗體標(biāo)出[15]。

圖1 進化樹描述細菌來源PLDs的親緣關(guān)系Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among bacterial PLDs

表1 微生物來源磷脂酶D的克隆表達Table 1 Various microbial PLDs that have been cloned and expressed

續(xù)表 1

2 微生物磷脂酶D的高效表達策略

2.1 分子水平

2.1.1 表達系統(tǒng)的選擇與優(yōu)化 重組蛋白的表達調(diào)控是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，構(gòu)建表達系統(tǒng)需要特定的元件，它們的配置對蛋白的表達有著重要影響。選擇合適的表達系統(tǒng)（包括表達宿主和表達載體）是高水平生產(chǎn)重組酶的第一步。其中，表達載體通常包括啟動子、信號肽、密碼子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子和拷貝數(shù)等（圖3）。通過對這些基因調(diào)控元件進行優(yōu)化、改造并加以組合，可以提高微生物來源PLD的表達量。迄今為止，已有不少研究者對微生物來源PLD進行了克隆表達的嘗試。由表1可知，目前PLD的異源表達主要是在大腸桿菌中進行的，也有少數(shù)在畢赤酵母、解脂耶氏酵母、變鉛鏈霉菌、谷氨酸棒桿菌以及枯草芽胞桿菌中進行克隆表達的報道。

圖3 微生物PLDs高效表達的相關(guān)策略Fig.3 Strategies for the high-efficiency expression of microbial PLDs

2.1.1.1 PLD在大腸桿菌中的克隆表達 由于生長迅速、培養(yǎng)成本低廉，大腸桿菌成為微生物PLD的主要異源表達系統(tǒng)。但在大腸桿菌中對PLD進行異源表達時，它們對表達宿主有明顯的毒害作用[45]，或影響其細胞生長[9,13]，或引起重組質(zhì)粒大量丟失[39]，這是導(dǎo)致其表達量較低的重要原因。因此，應(yīng)該采取措施減少PLD對細胞的毒性，比如將PLD進行分泌表達或細胞表面展示。目前，在大腸桿菌中克隆表達pld基因時，所采用的質(zhì)粒大多數(shù)不含信號肽，如pETDuet、pET-21a （+）、pET-23a （+）、pET-24a （+）、pET-28a （+）、pET-30b （+）以及pET-32b （+）等。因此，所表達的重組PLD均為胞內(nèi)酶，且酶活較低（表1）。雖然李斌等[10]、Songer等[14]、Iwasaki等[36]以 及Xiong等[37]分 別 嘗 試 采 用PelB或PLD自身信 號肽將ScPLD2、CpPLD和SaPLD2分泌到大腸桿菌細胞外，但獲得的重組PLD主要分布在胞內(nèi)或周質(zhì)空間。而Zambonelli等[9]雖然采用PelB信號肽將SsPLD3在大腸桿菌的胞外進行了表達，但其胞外酶活只有15 mU/mL，且胞內(nèi)也有積累。2017年，陳可泉等[46]進一步根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將該酶進行了密碼子優(yōu)化，使該酶的胞外表達量提高了近20倍。此外，Zhang等[34]通過將自主轉(zhuǎn)運蛋白ADIA-1的序列、信號肽CtxB的N端序列與SgPLD的序列融合后，使其在大腸桿菌的表面進行了展示，其酶活為0.39 U/mL。

選擇合適的表達宿主、降低誘導(dǎo)溫度或?qū)LD表達成包涵體等也是降低其對細胞毒性的重要措施。Xiong等[37]通過使用嚴謹型啟動子PBAD、在表達質(zhì)粒中插入pSC101的par區(qū)域以及大腸桿菌recA突變株等策略保持質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳，同時根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化、補加天冬氨酸或天冬酰胺等、18 ℃飽和誘導(dǎo)以及施加NaCl脅迫，從而緩解了SaPLD2對宿主細胞的毒性，延長了其合成時間，使其PLD在5 L發(fā)酵罐中的酶活和比產(chǎn)率分別達到120 U/mL和4300 U/（L·h），是目前發(fā)酵罐上報道的最高水平。

2.1.1.2 PLD在其它表達系統(tǒng)中的克隆表達 近年來，研究者們也嘗試采用畢赤酵母、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、變鉛鏈霉菌和枯草芽胞桿菌等表達系統(tǒng)對PLD進行高效表達。為減少PLD對細胞的毒性，克隆表達主要是在胞外或細胞表面進行的。2012年，張瑩[39]將ShPLD分別在畢赤酵母、解脂耶氏酵母和變鉛鏈霉菌中進行了分泌表達，搖瓶發(fā)酵水平上，其胞外酶活分別為1.0、0.2和69.12 U/mL，其中變鉛鏈霉菌中的PLD酶活是目前報道的搖瓶發(fā)酵水平上的最高酶活。2019年，劉逸寒等[40]進一步采用Flolp錨定信號序列將該磷脂酶D在畢赤酵母表面進行了展示，使其酶活達到315 U/g細胞干重。此外，該研究團隊還將ScPLD2和S. septatusTCCC 21057來源PLD進行了密碼子優(yōu)化，并分別在畢赤酵母中進行了表面展示和分泌表達，其酶活分別為0.0884 U/mg和2.37 U/mL[35,41]。Matsumoto等[42]和Ogino等[11]分別將SsPLD4和ScPLD3在變鉛鏈霉菌中進行了分泌表達，其胞外酶活分別為9.6 U/mg和55 U/mL （表達量為118 mg/L），純化后的比酶活分別為384和468 U/mg，遠高于商品化PLD的比酶活（30～150 U/mg）[21]。2009年，路福平課題組[19]將EcPLD2在枯草芽胞桿菌的胞外進行了表達，重組酶的胞外酶活為1.68 U/mL。2011年，Nakazawa等[43]利用大腸桿菌-變鉛鏈霉菌穿梭質(zhì)粒將SrPLD在變鉛鏈霉菌中進行了分泌表達，搖瓶水平的酶活為30 U/mL，比野生菌的酶活提高了近90倍。2018年，Huang等[44]進一步將該PLD在枯草芽胞桿菌WB600的胞外進行了表達，胞外酶活為1.8 U/mL；再通過對信號肽、表達載體、核糖體結(jié)合位點以及spacer區(qū)進行優(yōu)化，使其搖瓶中胞外酶活提高了約12.4倍，達到24.2 U/mL，15 L發(fā)酵罐中的酶活達到116.2 U/mL。

綜上所述，PLD對宿主細胞有一定的毒害作用，應(yīng)采用分泌表達、細胞表面展示等方法減少其毒性。而目前微生物來源PLD的異源表達主要是在大腸桿菌的胞內(nèi)進行的，所獲得的重組酶容易形成包涵體，且活性較低，后期分離純化較為困難，難以進一步實現(xiàn)其高水平表達。與大腸桿菌相比，PLD在枯草芽胞桿菌、畢赤酵母、解脂耶氏酵母、變鉛鏈霉菌中的表達量較高，而且更容易實現(xiàn)分泌表達或表面展示。因此，使用這些表達系統(tǒng)可能更有利于實現(xiàn)PLD的高效表達。此外，目前的研究只集中于對一種或幾種表達元件進行優(yōu)化，這也很難提高PLD的表達量，應(yīng)該將它們進行改造、優(yōu)化并加以組合。

2.1.2 分子改造 微生物PLD中含有兩個保守HKD活性基序，這兩個保守序列是酶活性中心，任意氨基酸的改變都會影響PLD的催化活性。因此，通過對這些關(guān)鍵氨基酸殘基進行定點突變，可以提高其催化效率和比酶活，從而可以間接提高其表達量。徐銀鳳等[47]發(fā)現(xiàn)BcPLD只含有一個HKD保守序列，而另外一個是HRD（圖2）。通過定點突變將HRD突變?yōu)镠KD后，使其酶活提高了10%左右。另外，F(xiàn)edeli等[45]將SsPLD3中兩個高度保守的HKD基序中的His167、His440、Lys169和Lys442分別進行定點突變后，其表達量顯著提高，而且突變體的空間結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，但它們完全失活。Yang等[30]的研究也表明，將ScPLD1中保守HKD基序的His187和His200突變?yōu)锳la后，其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變且酶活顯著下降；但若將其突變?yōu)锳sn，突變體的酶活和結(jié)構(gòu)則沒有明顯變化。Ogino等[48]證明了ScPLD3中兩個HKD基序中的GG和GS基序（特別是絲氨酸殘基，圖2）會影響酶的轉(zhuǎn)磷脂活性和穩(wěn)定性，其中突變體G215S、G216S和G216S/S489G的轉(zhuǎn)磷脂活性是野生酶的9～27倍。此外，通過定向進化也可以提高PLD的表達量。Zhang等[34]采用DNA shuffling將大腸桿菌表面展示的SgPLD進行改造后，使其酶活提高了約90%，達到0.074 U/mL。

2.2 發(fā)酵水平

2.2.1 培養(yǎng)基成分優(yōu)化 培養(yǎng)基中的氮源、氮源以及表面活性劑等會影響PLD的表達量（圖3）。大量研究表明，葡萄糖和蛋白胨分別是PLD生產(chǎn)的最佳碳源和氮源。如Chiaki等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在2 L發(fā)酵罐中對重組變鉛鏈霉菌進行發(fā)酵，當(dāng)起始葡萄糖濃度為17.5 g/L，且同時補加葡萄糖和胰蛋白胨時，重組酶ScPLD3的酶活和表達量分別從20 U/mL和42 mg/L提高到55 U/mL和118 mg/L。進一步將該重組菌進行固定化，且同時在起始培養(yǎng)基中添加葡萄糖和胰蛋白胨時，重組酶的胞外表達量提高了1倍[49]。表面活性劑可以提高細胞膜的通透性，從而可以提高蛋白質(zhì)的胞外表達量。Yang等[18]研究了不同的表面活性劑對EcPLD1表達量的影響，其中0.4%曲拉通X-100可以使其胞外酶活從3.2 U/mL提高到13.5 U/mL。此外，曲拉通X-100也對SsPLD4的水解活性有顯著影響[42]。而韓海霞等[50]則發(fā)現(xiàn)30 g/L吐溫20可以使鏈霉菌CA-1的PLD活性提高了4.5倍，達到1.198 U/mL。

2.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 研究表明，發(fā)酵條件也是影響PLD表達量的重要因素之一。所用的發(fā)酵菌株和發(fā)酵設(shè)備不同，則其PLD發(fā)酵條件也不同，應(yīng)該通過優(yōu)化進行確定。劉逸寒等[51]通過單因素實驗對細胞表面展示表達PLD的重組畢赤酵母菌株GS115/pKFS-pld的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件（包括誘導(dǎo)溫度、起始pH、甲醇濃度、裝液量及轉(zhuǎn)速等）進行了優(yōu)化，使其酶活提高了44%。進一步對5 L發(fā)酵罐的分批補料培養(yǎng)條件（包括甘油流加速度、甲醇流加模式）進行優(yōu)化后，使其產(chǎn)酶水平比搖瓶提高了53%。Iwasaki等[36]研究了培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)OD600nm對重組大腸桿菌表達SaPLD2的影響，在最佳培養(yǎng)條件下重組酶的酶活比原來提高了18.3倍，達到了3.47 U/mL。

2.2.3 固定化 固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶可以提高產(chǎn)酶效率、發(fā)酵穩(wěn)定性好、縮短發(fā)酵周期和提高設(shè)備利用率。Ogino等[49]利用生物質(zhì)載體顆粒對重組變鉛鏈霉菌進行固定化，使其能連續(xù)8個批次穩(wěn)定生產(chǎn)PLD，2個批次后其發(fā)酵周期從48 h降低到24 h，酶活提高了8倍多，達到15 U/mL。Fukuda等[52]采用多孔顆粒將S.cinnamoneumNBRC12852固定化后，將其進行連續(xù)分批發(fā)酵，磷脂酶D的生產(chǎn)效率達到57.9 IU/（L·h），比原來提高了1倍多。

3 結(jié)語

目前克隆表達的主要是鏈霉菌PLD，它們對磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率偏低。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以ArPLD為探針，采用基因組挖礦或宏基因組技術(shù)可以獲得催化性能更優(yōu)異、更適合工業(yè)化應(yīng)用的II類PLD酶源，為其大規(guī)模生產(chǎn)提供良好的物質(zhì)材料。目前PLD的異源表達主要是在大腸桿菌中進行的，但PLD對細胞的毒性限制了其表達?？梢試L試其它表達系統(tǒng)，還可以構(gòu)建新的表達系統(tǒng)或多個磷脂酶D基因共表達系統(tǒng)，進而實現(xiàn)其高效制備。此外，目前的研究中只采取了一種或少數(shù)幾種高效表達策略，在提高PLD的表達量方面效果有限。后續(xù)研究應(yīng)同時使用更多策略，如：綜合運用表達元件的分子改造與組合、PLD的分子改造、發(fā)酵工藝優(yōu)化以及固定化等技術(shù)，同時從分子水平和發(fā)酵水平上實現(xiàn)微生物PLD的高豐度表達；同時運用單因素實驗、響應(yīng)面優(yōu)化以及遺傳算法等實驗設(shè)計技術(shù)進一步從發(fā)酵水平上提高PLD的表達量。隨著研究的不斷深入，相信我國微生物PLD的高效制備與工業(yè)應(yīng)用研究必將進入一個新的歷史階段。