孟新濤，潘 儼，鄒淑萍，喬 雪，張 婷, ，張 謙,

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊 830091；2.新疆主要農(nóng)副產(chǎn)品精深加工工程技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊 830091）

牛肉蛋白質(zhì)含量高，風(fēng)味獨(dú)特，脂肪和膽固醇含量低，容易消化吸收，是集營養(yǎng)和保健于一體的特色肉食品[1?2]。然而，鮮牛肉屠宰后生產(chǎn)、流通及銷售等過程中，受外界環(huán)境、微生物及自身酶解等因素的影響，極易發(fā)生氧化分解，導(dǎo)致其營養(yǎng)、風(fēng)味及品質(zhì)變差，造成食用安全性和產(chǎn)品交易價格下降[3?5]。常溫貨架、冷藏貨架及低溫貨架是目前生產(chǎn)中最常見和最廣泛的鮮牛肉流通銷售方式，但不同條件下鮮牛肉的儲藏時限和食用安全性倍受關(guān)注[6?7]。目前，國內(nèi)外學(xué)者多采用針對性較強(qiáng)的理化指標(biāo)，如pH、色澤、持水力、揮發(fā)性鹽基氮和菌落總數(shù)等指標(biāo)對不同儲藏條件下的牛肉儲藏新鮮度、貨架期或儲藏時限進(jìn)行評定或判斷[8?10]，結(jié)果往往受環(huán)境、檢測方法及主觀差異性等因素的影響而造成誤判，且常規(guī)的感官評定和檢測方法無法滿足批量檢驗對評估效率及效果的要求。因此，尋求一種快捷、簡單、準(zhǔn)確性強(qiáng)的鮮牛肉儲藏時限的判斷或評估方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

氣相離子遷移色譜是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種氣體快檢技術(shù)，該項技術(shù)是基于氣相中不同離子在電場中遷移速度的差異來對化學(xué)離子物質(zhì)進(jìn)行表征的一種分析技術(shù)[6]。通過整合氣相色譜和離子遷移色譜在分離和檢測方面的優(yōu)勢，形成具有高分辨率、高靈敏度、分析高效、操作簡便等特點(diǎn)的氣體快檢技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、檢測過程快速高效等特點(diǎn)[11?12]，已在酒[13]、茶葉[14]、雞蛋[15]、油[16]及摻假[17?19]等食品研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，在肉制品摻假檢測[20]、指紋圖譜構(gòu)建[21]及冷凍肉儲藏時間判斷[19]等方面亦被報道，但尚未見在不同條件下鮮牛肉儲藏時限判斷方面的研究。為此，本項目在預(yù)實(shí)驗的基礎(chǔ)上，以排酸后的鮮牛肉為研究對象，定期監(jiān)測不同儲藏條件下產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs），根據(jù)其特征性風(fēng)味物質(zhì)變化時間點(diǎn)預(yù)判鮮牛肉在三種不同條件下的儲藏時限，以期為生產(chǎn)中鮮牛肉的流通銷售、安全食用和生產(chǎn)監(jiān)管提供一種快檢方法，為其實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉 購買于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗場，品種為西門塔爾，取新鮮宰殺牛肉后腿部位，4 ℃排酸24 h，每份牛肉樣品采集后，由塑料包裝袋包裹后放入專用樣品取樣箱，于1 h內(nèi)運(yùn)回新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所肉品分析實(shí)驗室；2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮等所有分離用有機(jī)溶劑Sigma公司。

MQ735絞肉機(jī) 日本博朗公司；Flavour Spec氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 德國G.A.S公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 樣品采集及處理 新鮮牛肉切分后模擬三種貨架儲藏流通溫度，貨架溫度的選擇是根據(jù)超市、冷鮮肉零售店等銷售貨柜實(shí)際儲藏溫度所得。分別用A、B、C表示，樣品A：25～30 ℃，模擬常溫貨架；樣品B：8～10 ℃，模擬冷藏貨架；樣品C：0～1 ℃，模擬低溫貨架。

樣品A：模擬常溫貨架（25～30 ℃），將切割包裝后的牛肉置于25～30 ℃常溫條件儲藏，因儲藏溫度高，致肉質(zhì)發(fā)生生理生化反應(yīng)速度較快，在預(yù)實(shí)驗基礎(chǔ)上，每隔1 h取樣監(jiān)測直至樣品腐爛。將29個監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行對比，選取樣品風(fēng)味具有明顯變化的監(jiān)測點(diǎn)，即0、12、14、16、17.5、20、21.5、23及26 h，用于牛肉常溫貨架指紋圖譜構(gòu)建。

樣品B：模擬冷藏貨架（8～10 ℃），將切割包裝后的牛肉置于8～10 ℃冷藏貨柜儲藏，相對于樣品A，肉質(zhì)發(fā)生生理生化反應(yīng)速度較緩，在預(yù)實(shí)驗基礎(chǔ)上，儲藏前期每隔6 h取樣監(jiān)測，儲藏130 h后每隔2 h取樣，監(jiān)測直至樣品腐爛，將107個取樣點(diǎn)進(jìn)行對比，選取樣品風(fēng)味具有明顯變化的監(jiān)測點(diǎn)，即0、48、96、119、130、142、147、153、159、164及168 h，用于牛肉冷藏貨架指紋圖譜的構(gòu)建。

樣品C：模擬低溫貨架（0～1 ℃），將切割包裝后的牛肉置于0～1 ℃低溫冰箱儲藏，由于溫度接近冰點(diǎn)，肉質(zhì)發(fā)生生理生化反應(yīng)速度較慢，在預(yù)實(shí)驗基礎(chǔ)上，儲藏前期每隔0.5 d取樣，儲藏19.5 d后每隔2 h取樣，監(jiān)測直至樣品腐爛，將160個取樣點(diǎn)進(jìn)行對比，選取樣品風(fēng)味具有明顯變化的監(jiān)測點(diǎn)，即0、3、6、9、12.5、15.5、18.5、19.5、21、23.5、25、26.5、27、29.5 d，用于牛肉低溫貨架指紋圖譜的構(gòu)建。

試驗時，將三種儲藏條件下的鮮牛肉樣品分別從塑料包裝袋取出，攪碎成泥狀后稱取5.00 g置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，備用。每份樣本3個重復(fù)，用于GC-IMS分析。

1.2.2 GC-IMS測定條件 根據(jù)孟新濤等[20?21]的方法進(jìn)行，稍有修改。將頂空進(jìn)樣瓶中的樣品進(jìn)行孵化，使用加熱的進(jìn)樣針抽取瓶內(nèi)的頂空組分，通過Flavour Spec氣相離子遷移色譜儀分析揮發(fā)性組分。通過GC-IMS風(fēng)味分析儀對不同儲藏條件下牛肉中的揮發(fā)性化合物變化進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。孵化溫度55 ℃；孵化時間20 min；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min；進(jìn)樣量1 mL，不分流模式；清洗時間0.50 min；載氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%）；色譜柱溫度45 ℃；進(jìn)樣針溫度60 ℃；色譜運(yùn)行時間21 min，設(shè)置程序流速2.00 mL/min并保持1 min，在10 min內(nèi)線性增至20.00 mL/min，在5 min內(nèi)線性增至100.00 mL/min，100.00 mL/min保持5 min。

2-戊酮（2-Pentanone）、2-己酮（2-Hexanone）、2-庚酮（2-heptanone）、2-辛酮（2-Octanone）、2-壬酮（2-nonanone）作為標(biāo)準(zhǔn)品確定樣品中化合物的保留時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用設(shè)備自帶的LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析軟件，采用GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的2014NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析、LAV中Reporter和Gallery插件程序構(gòu)建揮發(fā)性有機(jī)物的差異圖譜和指紋圖譜；dynamic PCA plug-ins插件程序進(jìn)行PCA處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲藏條件下鮮牛肉特征揮發(fā)性成分的3D差異動態(tài)分析

圖1 是由LAV分析軟件中Reporter插件程序制作的三種不同儲藏方式下牛肉揮發(fā)性成分的3D對比圖。對離子遷移時間和反應(yīng)離子峰的位置進(jìn)行了歸一化處理。整個光譜代表了樣品的所有頂空采集到的化合物。RIP右側(cè)的每個點(diǎn)代表從樣品中提取的揮發(fā)性化合物，顏色表示物質(zhì)的信號強(qiáng)度。白色表示低強(qiáng)度，紅色表示高強(qiáng)度。顏色越深，強(qiáng)度越大。圖1A中，黑色圓圈內(nèi)的部分特征揮發(fā)性成分在常溫儲存14 h出現(xiàn)，并在儲存21.5 h達(dá)到高峰，具有較高的保留時間。圖1B中，當(dāng)8～10 ℃儲存142 h時，黑色圈內(nèi)部分特征物質(zhì)消失，168 h時出現(xiàn)新的離子峰。圖1C中，0～10 ℃儲存19.5 d時，出現(xiàn)一些新的有機(jī)化合物，如黑色的圓圈所示。隨著時間的延長，三種儲藏方式下新的化合物出現(xiàn)的同時，部分化合物濃度增高，部分濃度降低至消失。這主要由于牛肉在不同儲藏過程中發(fā)生復(fù)雜的脂肪酸、氨基酸及碳水化合物等生理生化代謝反應(yīng)所致[22]。由此可見，隨著儲藏時間的延長，不同儲藏條件下的牛肉樣品中揮發(fā)性成分的含量及種類存在較大差異。

圖1 牛肉樣品在不同儲藏條件下的三維地形圖Fig.1 3D topographic plots of fresh beef under different storage conditions

2.2 不同儲藏條件下鮮牛肉特征揮發(fā)性成分的2D差異動態(tài)分析

如圖2所示，利用GC-IMS技術(shù)得到了不同儲藏條件下鮮牛肉揮發(fā)性有機(jī)化合物的二維形態(tài)圖，縱坐標(biāo)表示保留時間，橫坐標(biāo)表示漂移時間，紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP，歸一化后漂移時間為7.22～7.41 ms），紅色點(diǎn)代表反應(yīng)離子峰，所有物質(zhì)在漂移時間為1.0～1.8 ms，保留時間為100～1000 s，所有的有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)在20 min內(nèi)全部檢出，但有些化合物不是由一個信號決定的，是單體、二聚體和三聚體在不同的漂移時間出現(xiàn)，這主要是因為離子（單體）在漂移時形成的，可能與分析物具有較高的質(zhì)子親和力或信號有關(guān)[23?24]。圖2A選取0、14、21.5 h作為代表性譜圖，從所有反應(yīng)離子峰中選取具有代表性的28個信號，利用GC-IMS library seacher 1.0.3軟件中2014NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，可識別出的信號包括6種醛、6種酮、5種醇、2種雜環(huán)、2種酯、1種胺類化合物（見表1）；圖2B選取0、142、168 h作為代表性譜圖，從所有反應(yīng)離子峰中選取具有代表性的52個信號，可識別出的信號包括8種醛、6種酚、8種酯、1種呋喃、10種醇、1種酸、1種醚、7種酮和二惡烷（見表1）；圖2C選取0、19.5、29.5 d作為代表性譜圖，從反應(yīng)離子峰中選取42個信號，可識別出的信號包括7種醛、5種酮、1種酸、6種醇、1種酯、2種雜環(huán)和二惡烷（見表1）。個別識別出但未被定性的化合物沒有在表里列出。

表1 三種儲藏方式下鮮牛肉特征風(fēng)味物質(zhì)定性分析信息Table 1 The information on identified compounds of fresh beef at three storage modes

圖2 鮮牛肉樣品在不同儲藏時間的二維地形圖Fig.2 2D topographic plots of fresh beef under different storage conditions

2.3 不同儲藏條件下鮮牛肉特征揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜的差異

將A、B、C三種儲藏條件下鮮牛肉儲藏過程中的所有離子峰匯總，利用GC-IMS LAV中Gallery插件程序構(gòu)建揮發(fā)性有機(jī)物的指紋圖譜，分析A、B、C在儲藏期內(nèi)揮發(fā)性有機(jī)物的動態(tài)變化情況。

續(xù)表 1

由圖3A可知，鮮牛肉在25～30 ℃儲藏過程中，0～14 h特征揮發(fā)物質(zhì)變化較為緩慢，區(qū)域a中的2-丁酮（單體）、2-丁酮（二聚體）、二惡烷、2-戊酮（二聚體）、2-己酮3-甲基丁醇、環(huán)己酮、γ-丁內(nèi)酯的含量在整個儲藏期內(nèi)無明顯變化，儲藏至14 h時，GCIMS圖譜峰變多，區(qū)域b中丁酸丁酯、己醛（單體）、1-辛烯-3-醇、N-亞硝基二甲胺4種物質(zhì)被檢出，16 h時，區(qū)域c中2-甲基丙醇、乙醇、正丁醛、乙酸乙酯4種物質(zhì)被檢出，含量持續(xù)上升，21 h時，區(qū)域d中乙酸乙酯（二聚體）、丁酸、羥基丙酮3種物質(zhì)被檢出，且相對含量較高?？梢钥闯觯?5～30 ℃條件下，牛肉的特征化合物在儲藏過程中發(fā)生復(fù)雜的變化，尤其是儲藏14 h后出現(xiàn)的醛、酮、醇、酸、酯及胺類等新的小分子特征揮發(fā)性有機(jī)物，可能由于脂肪氧化產(chǎn)生的糖代謝、氨基酸代謝及美拉德反應(yīng)所致，隨著濃度的不斷增大，最終導(dǎo)致酸敗味或有毒物質(zhì)（N-亞硝基二甲胺）的產(chǎn)生[22?24]。

圖3 不同儲藏條件下鮮牛肉的特征風(fēng)味指紋圖譜Fig.3 The gallery plots of aroma compounds in fresh beef under different storage conditions

從圖3B可以看出，鮮牛肉在8～10 ℃條件下儲藏時，區(qū)域a中壬醛（單體）、壬醛（二聚體）、2-甲氧基苯酚、乙酸己酯、順-乙酸-3-己烯酯、2-正戊基呋喃、苯甲醛（單體）、苯甲醛（二聚體）、5-甲基-2-呋喃、甲醇（單體）、5-甲基-2-呋喃甲醇（二聚體）、庚醛（單體）、丁酸丙酯、正戊酸、己醛（單體）、2,3-丁二醇戊醛、2,3-戊二酮、乙二醇二甲醚等16種揮發(fā)性物質(zhì)僅在牛肉宰殺排酸后新鮮狀態(tài)下被檢出，儲藏至48 h后消失；儲藏至119 h，牛肉中的2-甲基丁酸甲酯、乙酸乙酯、2-甲基丙醇、正丁醛、2-乙基-1-己醇、己醛（二聚體）、異丙醇、戊醇、2-戊酮（單體）、正己醇（二聚體）、1-辛烯-3-醇、丁酸丁酯、2-丁酮（單體）、2-戊酮（二聚體）、丙醇、2-丁酮（二聚體）、2-己酮等15種揮發(fā)性物質(zhì)變化較小，相對含量較為穩(wěn)定；儲藏至142 h時，區(qū)域b中異丁醇、乙酸乙酯（單體）、正己醇、2-庚酮等8種有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)被檢出，且隨儲藏時間的延長，相對含量不斷增加，變化規(guī)律性較強(qiáng)[25?26]。揮發(fā)性物質(zhì)出現(xiàn)變化可能與屠宰后的牛肉脂肪組織代謝活動有關(guān)，隨著儲藏時間的延長，代謝活動逐漸衰減，直至部分脂類化合物逐漸消失[27?29]；也可能與牛肉儲藏過程中部分化合物作為反應(yīng)底物參與美拉德反應(yīng)有關(guān)[30?32]。此實(shí)驗結(jié)果與傅忙娟等[29]利用GS-MS技術(shù)判斷冷藏豬肉和羊肉的新鮮度所選用的乙酸乙酯、正己醇等特征揮發(fā)性有機(jī)物較為一致，但預(yù)判時間存在一定的差異，這可能由于檢測對象、檢測方法及儲藏條件不同所致。

由圖3C可以看出，鮮牛肉在在0～1 ℃低溫環(huán)境儲藏過程中，揮發(fā)性化合物整體變化不大，相對含量也基本保持穩(wěn)定，己醛（單體）、壬醛、二惡烷、2-戊酮（單體）、2-乙基呋喃、2-丁酮、乙酸（單體）、丙酮、3-甲硫基丙醛、戊醇（單體）、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-甲基丁醛、乙酸（二聚體）、正己醇（單體）、正己醇（二聚體）、3-甲基丁醇、庚醛、正丁醛、戊醇（二聚體）、辛醛、2-庚酮（單體）等28種物質(zhì)存在于整個儲藏期內(nèi)。當(dāng)鮮牛肉儲藏至19.5 d時，區(qū)域a中2-庚酮（二聚體）2-戊酮（二聚體）、異丙醇、乳酸乙酯、異丁醇、甲硫醇、六甲基環(huán)三硅氧烷、己醛（二聚體）等10種物質(zhì)被檢測出，且濃度隨冷藏時間的延長不斷增加，甲硫醇、六甲基環(huán)三硅氧烷具有難聞刺激性氣味，對鮮牛肉貨架期劣變產(chǎn)生較大的影響。相比常溫25～30 ℃和冷藏8～10 ℃條件下，揮發(fā)性成分在全過程中含量變化不明顯，且難找出規(guī)律。離子信號峰難找出規(guī)律，可能是因為冰鮮試驗儲存時間太長，長期低溫儲藏會抑制酶的活性，如脂氧合酶和醇酰轉(zhuǎn)移酶，它們是酯芳香代謝的關(guān)鍵酶，會導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)減少[19]。

2.4 基于主成分分析的特征分析

依據(jù)圖3（A、B、C）構(gòu)建的三種儲藏方式下鮮牛肉特征風(fēng)味物質(zhì)動態(tài)變化的離子遷移色譜指紋圖譜，采用dynamic PCA plug-ins插件程序進(jìn)行PCA處理，觀察同一儲藏方式下鮮牛肉特征風(fēng)味動態(tài)變化特征。由圖4A可以看出，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了64%，鮮牛肉在25～30 ℃儲藏條件下，各樣品組間和組內(nèi)樣品間特征風(fēng)味具有一定的差異，0～14 h、16～20 h、21～26 h儲藏的鮮牛肉樣品分別相對集中于一定的范圍內(nèi)，但各組之間具有明顯的間距，表明不同儲藏時間的樣品特征風(fēng)味物質(zhì)特異性較明顯。由圖4B可以看出，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了69%，鮮牛肉在8～10 ℃儲藏條件下，0～142 h鮮牛肉樣品間特征風(fēng)味差異不明顯，但儲藏時間相同的樣品重復(fù)性較好，147～168 h樣品相對集中于一定范圍內(nèi)，與0～142 h的樣品具有明顯的差異，樣品間的聚集度較高，表明8～10 ℃儲藏142 h可能為鮮牛肉風(fēng)味物質(zhì)變化的特征拐點(diǎn)。由圖4C可以看出，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了74%，鮮牛肉在0～4 ℃儲藏條件下，0～19.5 d鮮牛肉不同儲藏時間樣品相對集中于一定的范圍內(nèi)，21～29.5 d不同儲藏時間樣品分布較為分散，但同一儲藏時間樣品間的聚集度較高，表明樣品間的重復(fù)性好。

圖4 不同儲藏方式下鮮牛肉特征風(fēng)味氣相離子遷移色譜指紋圖譜PCA分析結(jié)果Fig.4 PCA results for classification analysis of characteristic flavor of Fresh beef under different storage conditions

3 結(jié)論

本文采用GC-IMS技術(shù)，分析了排酸后的鮮牛肉在常溫貨架（25～30 ℃）、冷藏貨架（8～10 ℃）和低溫貨架（0～1 ℃）三種不同貨架儲藏流通條件下特征風(fēng)味物質(zhì)動態(tài)變化規(guī)律，構(gòu)建了不同條件下鮮牛肉的特征風(fēng)味指紋圖譜。25～30 ℃條件下儲藏14 h，丁酸丁酯、2-己酮、1-辛烯-3-醇、丁酸丙酯（單體）4種物質(zhì)可被檢出，為其貨架期風(fēng)味變化的特征標(biāo)記物質(zhì)；8～10 ℃條件下儲藏142 h，異丁醇、乙酸乙酯（單體）、正己醇、2-庚酮等8種有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)被檢出，為其貨架期風(fēng)味變化的特征標(biāo)記物質(zhì)；0～1 ℃條件儲藏19.5 d，2-庚酮（二聚體）2-戊酮（二聚體）、異丙醇、乳酸乙酯、異丁醇、甲硫醇、六甲基環(huán)三硅氧烷、己醛（二聚體）等10種揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)被檢測出，為其貨架期風(fēng)味變化的特征標(biāo)記物質(zhì)。該結(jié)果與侯寶申[33]、關(guān)文強(qiáng)等[34]等采用傳統(tǒng)微生物、色澤、揮發(fā)性鹽基氮及理化指標(biāo)綜合評價的方法研究確定鮮牛肉常溫和冰鮮保鮮期時限較為接近。表明，采用GCIMS快速檢測技術(shù)預(yù)判鮮牛肉不同條件下的儲藏時限具有一定的可行性。本文為生產(chǎn)中鮮牛肉的流通銷售、安全食用和生產(chǎn)監(jiān)管提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。