孔夢潔，張 嬌，李家興，胡婉峰, ，徐曉云，潘思軼

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢 430070）

荸薺（Eleocharis tuberosa）作為我國特有的一種水生蔬菜，因其脆嫩、甘甜多汁等特點而受到眾多消費者的喜愛[1?2]。但荸薺帶有的淤泥和復(fù)雜的表面結(jié)構(gòu)，增加了消費者的食用難度[3]。鮮切荸薺食用方便，能滿足消費市場的多元要求，近年來廣受消費者的青睞。

鮮切荸薺由于在加工過程中受到了嚴(yán)重的機械損傷，汁液外溢，使得酶和底物暴露于空氣之中，因此極易誘發(fā)果蔬組織褐變和一系列生理生化反應(yīng)，降低鮮切荸薺的感官質(zhì)量和營養(yǎng)價值[4]。有研究表明，導(dǎo)致鮮切荸薺黃化的主要物質(zhì)可能為黃酮類和蒽醌類物質(zhì)的混合物[5?6]，這些物質(zhì)主要是通過苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的，該途徑有多種酶共同參與，其中苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）作為苯丙烷代謝途徑第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶[7]，能將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為氨和肉桂酸，其活性的表達(dá)直接影響果蔬體內(nèi)多酚類化合物的合成[8]。也有研究者認(rèn)為鮮切荸薺的褐變與酶促氧化褐變有關(guān)[9]，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和 過 氧 化 物 酶（peroxidase，POD）均能作用于多酚類物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)變?yōu)轷?，醌類物質(zhì)再進一步聚合形成褐色素，促使褐變的產(chǎn)生。目前，鮮切荸薺的護色方法主要有氣調(diào)保鮮及熱處理[10]、丁香酚[11]、乙醇[12?13]、檸檬酸[14?15]處理等方法。這些保鮮手段都能在一定程度上延長鮮切荸薺的貯藏期，但會對品質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)生不良影響[15?16]。同時，隨著消費者對食品安全的日益關(guān)注，人們對綠色環(huán)保、高效的保鮮加工手段的需求越來越迫切。

高壓二氧化碳（high-pressure carbon dioxide technology，HPCD）技術(shù)作為一種新型非熱加工技術(shù)，能有效避免熱加工過程造成的很多弊端，在果蔬加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，能夠最大限度地保持果蔬功能成分、營養(yǎng)成分和色澤[17?19]。同時，有研究表明，HPCD處理可以使果蔬汁中PPO、POD等褐變相關(guān)酶發(fā)生聚集和分解，二三級結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致相關(guān)酶活性降低或喪失[20?21]，從而達(dá)到理想的護色效果。目前HPCD技術(shù)的應(yīng)用研究主要集中在抑制果蔬汁褐變領(lǐng)域，而在鮮切果蔬領(lǐng)域的應(yīng)用及其對褐變控制機理的研究鮮有報道。本文以極易發(fā)生褐變的鮮切荸薺為研究對象，研究HPCD對鮮切荸薺的褐變抑制及貯藏品質(zhì)的影響，為控制鮮切荸薺褐變的發(fā)生，延長其貯藏期提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，也為其他鮮切果蔬的褐變控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)城菜市場；鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、L-苯丙氨酸、H2O2、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、碳酸氫鈉 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑 生物試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸 分析純，上海源葉生物科技有限公司。

HA3000-30超臨界反應(yīng)裝置 江蘇華安科研儀器有限公司；G200組織研磨儀 卡尤迪生物科技有限公司；Thermo Multskan GO 全自動酶標(biāo)儀 美國Thermo 公司；HU-910IV-M標(biāo)準(zhǔn)型pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；5804 R離心分離機 德國 Eppendorf 公司；YS3060 3nh高精度色差計 蘇州九聯(lián)科技有限公司；TA.XT plus物理特性測試儀英國SMS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮切荸薺處理及貯藏 經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)較高壓強和較長時間的高壓二氧化碳處理會導(dǎo)致樣品在貯存過程中出現(xiàn)汁液流失現(xiàn)象，因此將本實驗的處理壓強設(shè)定為1、2、4 MPa，處理時間為5 min，具體處理方法如下：荸薺經(jīng)清洗去皮后，放入已預(yù)熱（31 ℃）的高壓二氧化碳反應(yīng)釜中，待達(dá)到所需壓強和處理時間后。取出置于4 ℃冰箱中貯存，分別在0、2、4、6、8 d隨機取樣進行色澤和硬度測定，同時將部分樣品立即用液氮冷凍，再放置于?80 ℃冰箱貯存，用于其他指標(biāo)的測定。每組選用90個果實，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 色澤測定 鮮切荸薺的色澤采用色差計進行測定。黑板、白板進行校正后，隨機選取6個荸薺并且每個荸薺上選擇五個點進行測定后取平均值。

1.2.3 硬度測定 參照田維娜[22]方法，采用質(zhì)構(gòu)儀測定樣品硬度，具體參數(shù)設(shè)置如下: P/5圓柱測試探頭，采用TPA操作模式，測試前速率為5.0 mm/s，測試速率為2.0 mm/s，測試后速率為2.0 mm/s，時間為5.00 s，壓力為10 g。每個處理測定20片荸薺樣品，結(jié)果取平均值。

1.2.4 PPO活性測定 參照Zhang等[23]方法，稱取2 g樣品，加 入8 mL磷酸緩 沖液（PBS，pH6.8，0.2 mol/L），充分研磨后，于10000×g下離心20 min，上清液即為PPO粗酶液。取上清液100 μL于酶標(biāo)條（PBS作為空白對照），加入200 μL鄰苯二酚（0.2 mol/L），在420 nm下測定反應(yīng)體系3 min內(nèi)的吸光值變化。定義每分鐘內(nèi)，吸光值每變化0.001，為1個單位的PPO酶活，記作1 U。

1.2.5 POD活性測定 參照Zhang等[23]方法，稱取2 g樣品，加入8 mL磷酸緩沖液（PBS，pH 6.8，0.2 mol/L），充分研磨后，于10000×g下離心20 min，上清液即為POD粗酶液。取上清液100 μL于酶標(biāo)條（PBS作為空白對照），同時加入100 μL雙氧水（2%）和100 μL愈創(chuàng)木酚（0.25 mol/L），在470 nm下測定反應(yīng)體系3 min內(nèi)的吸光值變化。定義每分鐘內(nèi)，吸光值每變化0.001，為1個單位的POD酶活，記作1 U。

1.2.6 PAL活性測定 參照Zhang等[23]方法，稱取5 g樣品加入0.5 g PVP和15 mL硼酸緩沖液（BBS，0.2 mol/L，pH 8.7，含0.05 mmol/Lβ-巰基乙醇），充分研磨后，于10000×g下離心20 min，上清液即為PAL粗酶液。取上清液1 mL（BBS作為空白對照），加入2 mL BBS和1 mL苯丙氨酸（0.2 mol/L），37 ℃水浴下反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后迅速加入200 μL鹽酸（6 mol/L）終止反應(yīng)，于290 nm處測定吸光值。定義每小時，吸光值每變化0.001，為1個單位的PAL酶活，記作1 U。

1.2.7 總酚含量測定 總酚含量采用福林酚法[24]測定。稱取2 g樣品，加5 mL 50%甲醇，充分研磨后，于12000×g離心15 min。取0.5 mL 上清液加入1 mL的福林酚試劑、2 mL 7.5% Na2CO3溶液，避光90 min，760 nm測定吸光值。取不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)上述同樣的方法，測定吸光值，進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。得到線性回歸方程：y=14.561x+0.0663，R2=0.9947，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 25對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，采用originPro8.5繪圖軟件作圖。每次實驗至少進行三個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPCD處理對鮮切荸薺褐變的抑制

荸薺經(jīng)過鮮切處理之后，由于受到機械損傷，極易發(fā)生褐變現(xiàn)象[25]。如圖1所示，對照組鮮切荸薺經(jīng)過8 d的貯藏之后已經(jīng)嚴(yán)重褐變，失去了食用價值。經(jīng)1 MPa處理之后的鮮切荸薺，在貯藏8 d后出現(xiàn)了輕微的褐變現(xiàn)象。而經(jīng)2 MPa和4 MPa處理后的鮮切荸薺在整個貯藏期內(nèi)都沒出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，保持了較高的商品價值。從圖1可以直觀地感受到HPCD處理可有效抑制鮮切荸薺的褐變，維持其較高的商品價值。

圖1 HPCD處理對鮮切荸薺褐變的抑制效果（4 ℃，8 d）Fig.1 The inhibitory effect of HPCD processing on fresh-cut CWC browning（storage at 4 ℃ for 8 days）

2.2 HPCD處理對鮮切荸薺色澤的影響

L*值的大小反映的是樣品表面的亮度，L*值越大樣品表面越明亮。b*值反映的是樣品表面的藍(lán)黃值，當(dāng)b*為正值時，其值越大表明樣品表面顏色越黃；b*為負(fù)值時，其絕對值越大表明樣品表面藍(lán)色程度越深。由圖2 a可以看出，未處理組鮮切荸薺的L*值在第2 d開始出現(xiàn)急劇的降低，表明未處理組隨著貯藏期的延長，鮮切荸薺表面逐漸出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。經(jīng)HPCD處理后的鮮切荸薺，在整個貯藏期內(nèi)的L*值變化較為緩慢，在貯藏的第8 d仍然保持較高的L*值。由圖2 b可以看出，未處理組鮮切荸薺在整個貯藏期內(nèi)的b*值變化較大，為正值，表明鮮切荸薺發(fā)生黃化。經(jīng)過1 MPa處理的鮮切荸薺的b*值在第6 d開始逐漸增加，這與貯藏后期出現(xiàn)的褐變現(xiàn)象一致。4 MPa處理組的b*值在整個貯藏期內(nèi)基本保持不變。鮮切荸薺L*值與b*值在整個貯藏期中的變化表明，HPCD處理可以有效抑制鮮切荸薺的褐變。

圖2 HPCD處理對鮮切荸薺色澤的影響Fig.2 Effects of HPCD treatment on the color in fresh-cut CWC during storage

2.3 HPCD處理對鮮切荸薺硬度的影響

如圖3所示，鮮切荸薺的硬度隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。未處理組鮮切荸薺的硬度在貯藏4 d后出現(xiàn)了急劇降低。經(jīng)1 MPa和2 MPa處理后的鮮切荸薺在貯藏周期內(nèi)硬度變化較小。在貯藏6 d時，1 MPa和2 MPa處理的鮮切荸薺的硬度分別為未處理組的1.19和1.21 倍。而經(jīng)較高的壓強（4 MPa）處理的鮮切荸薺的硬度在貯藏后期急劇降低，表明此處理條件對鮮切荸薺的硬度有不利的影響。

圖3 HPCD 處理對鮮切荸薺硬度的影響Fig.3 Effects of HPCD treatment on the hardness in fresh-cut CWC during storage

2.4 HPCD處理對鮮切荸薺PPO活性的影響

PPO在酶促褐變中扮演著重要的角色，在氧氣存在的情況下，多酚氧化酶可以催化酚類物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)又會進一步聚合導(dǎo)致顏色進一步加深[26?27]。由圖4可以看出，多酚氧化酶的活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與未處理組相比，HPCD處理后PPO的活性在第0 d出現(xiàn)了降低，且抑制效果與處理壓強呈正比。經(jīng)HPCD處理后的果汁中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果，這可能是由于HPCD處理會改變PPO的構(gòu)象，同時CO2在水溶液中的溶解度較高，形成碳酸造成酶所處環(huán)境pH的改變，進而改變了PPO的活性[28?29]。但隨著貯藏時間的延長，處理組PPO的活性顯著高于未處理組（P＜0.05），并在隨后的貯藏期內(nèi)始終高于未經(jīng)處理組。

圖4 HPCD處理對鮮切荸薺PPO活性的影響Fig.4 Effects of HPCD treatment on the activities of polyphenol oxidase in fresh-cut CWC during storage

2.5 HPCD處理對鮮切荸薺POD活性的影響

POD在果蔬的光合作用、呼吸作用以及生長素氧化等生理活動中起重要的作用，與果蔬的成熟衰老有著較為復(fù)雜的關(guān)系。POD可以H2O2為電子受體催化酚類物質(zhì)氧化，與果蔬的色澤密切相關(guān)[27,30]。由圖5可知，在整個貯藏期內(nèi)，鮮切荸薺中的POD活性先呈現(xiàn)上升的趨勢，在第2 d達(dá)到最高活性之后，逐漸降低。而經(jīng)4 MPa處理之后，鮮切荸薺中POD活性最高峰在第4 d出現(xiàn)，可以看出，HPCD處理會在一定程度上推遲POD活性峰值的出現(xiàn)。第0 d，HPCD處理與未處理組相比未見顯著差異（P＞0.05），隨著貯藏周期的延長POD呈現(xiàn)激活的狀態(tài)。第4 d，經(jīng)4 MPa處理后的鮮切荸薺中POD活性顯著升高，為未處理組的1.67倍（P＜0.05）。

圖5 HPCD處理對鮮切荸薺POD活性的影響Fig.5 Effects of HPCD treatment on the activities of peroxidase in fresh-cut CWC during storage

2.6 HPCD處理對鮮切荸薺PAL活性的影響

PAL是植物苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵限速酶，催化L-苯丙氨酸脫氨轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，生成的反式肉桂酸可以作為合成其他酚類物質(zhì)的底物[8]。因此，PAL活性對植物中酚類物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物的含量起著決定性作用。由圖6可知，未處理組PAL活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并在4 d達(dá)到最高活性。第4 d，經(jīng)1 MPa和2 MPa處理后的PAL活性分別為對照組的51.2%、40.9%，表明HPCD處理可以顯著抑制PAL活性（P＜0.05）。經(jīng)4 MPa處理后的PAL活性在整個貯藏期內(nèi)并沒顯著的變化（P＞0.05），而經(jīng)1 MPa處理后的PAL活性在貯藏后期逐漸增加。

圖6 HPCD處理對鮮切荸薺PAL活性的影響Fig.6 Effects of HPCD treatment on the activities of phenylalanine ammonialyase in fresh-cut CWC during storage

2.7 HPCD處理對鮮切荸薺總酚含量的影響

果蔬組織中酚類是酶促褐變發(fā)生的根本基礎(chǔ)[31]，酚類物質(zhì)作為酶促褐變的底物已經(jīng)在蘋果[26]、蓮藕[32]、馬鈴薯[33]等多種果蔬的研究中得到證實。由圖7可知，隨著貯藏長時間的延長，對照組鮮切荸薺中的多酚含量逐漸增加，這可能是由于PAL活性的增加促進了多酚物質(zhì)的積累。HPCD處理組在貯藏后期顯著抑制多酚含量的積累。在6 d，經(jīng)2 MPa和4 MPa處理的鮮切荸薺中多酚含量僅為未處理組的30%和24%。經(jīng)4 MPa處理后，鮮切荸薺中多酚類物質(zhì)含量在整個貯藏期內(nèi)變化不顯著（P＞0.05）。因此，HPCD處理可以通過抑制PAL活性，降低鮮切荸薺中多酚類的合成，從而有效保持鮮切荸薺的色澤。

圖7 HPCD處理對鮮切荸薺總酚含量的影響Fig.7 Effects of HPCD treatment on the contents of total phenols in fresh-cut CWC during storage

3 結(jié)論

HPCD處理可以有效地抑制鮮切荸薺的褐變，2 MPa處理有效地減緩硬度和L*值的降低，激活PPO、POD，使鮮切荸薺的抗逆能力有一定的提高，延長貯藏期。同時抑制苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶PAL活性，降低鮮切荸薺中酚類物質(zhì)的合成和積累，抑制鮮切荸薺在貯藏過程中的褐變。因此2 MPa處理可以延緩鮮切荸薺貯藏品質(zhì)劣變的進程。