孫宏萊，時得友，李麗麗，夏 俊，扎依湄科N.V.，斯克里普琴科N.V.，劉德江,

（1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.中-烏農(nóng)林技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用國際合作聯(lián)合實驗室，黑龍江佳木斯 154007；3.烏克蘭國家科學院M.M.格里什科國家植物園，烏克蘭基輔 01014）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta（Sieb.et Zucc.）Planch.ex Miq.）是獼猴桃科獼猴桃屬的多年生大型落葉藤本植物，其果實表皮無毛，口感細膩，富含多種氨基酸等生物活性物質(zhì)[1]。該植物主要分布于我國東北三省、華北、西北各省區(qū)，在國外如俄羅斯、日本等也有分布[2]。查閱國內(nèi)外文獻可知軟棗獼猴桃擁有多種藥理活性成分[3?4]，總?cè)剖擒洍棲J猴桃中的主要藥理活性成分之一，具有抗腫瘤[5?10]、抗氧化[11]、抗炎[12?13]和降血糖[14]等藥理作用，其中抗腫瘤活性最強[5?10]。

該研究以佳木斯大學農(nóng)林實驗實習基地修剪下來的軟棗獼猴桃枝條為原料，通過超聲提取法提取總?cè)疲砸掖紳舛?、液料比、提取時間、超聲功率4因素設(shè)計了四因素三水平共29個實驗點優(yōu)化總?cè)铺崛」に?。此外，非固醇消炎藥因其解熱?zhèn)痛的作用而在臨床上廣泛用于治療炎癥，但食用會對胃腸道和腎臟造成損傷，因此，尋找天然物質(zhì)代替非固醇消炎藥已成為研究的熱點問題[15?16]。本研究后續(xù)以抑制透明質(zhì)酸酶活性、牛血清白蛋白變性程度為因素，進而考察所制得總?cè)频捏w外抗炎活性能力，旨在為軟棗獼猴桃資源的進一步研究和工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

軟棗獼猴桃枝條 采于佳木斯大學農(nóng)林實驗實習基地（46°46′58″N, 130°21′6″E）；齊墩果酸標準品成都普思生物科技股份有限公司；牛血清白蛋白、透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸酶（500 U）、雙氯芬酸鈉、Ehrlich試劑 上海源葉生物科技有限公司；乙酰丙酮 麥克林；無水氯化鈣 天津市凱通化學試劑有限公司；5%香草醛-冰乙酸 現(xiàn)配現(xiàn)用；高氯酸、無水乙醇、石油醚 均為分析純；試驗所用蒸餾水 均為實驗室自制。

UV-8000紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；101-1A電熱鼓風干燥箱、DZ-2BCIV真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；JFSD-70實驗室粉碎磨 上海嘉定糧油儀器有限公司；YCHH0301電動振篩機 宜昌市夷陵區(qū)華恒設(shè)備制造廠；800Y全能小鋼磨 永康市鉑歐五金制品有限公司；FA2004電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗 昆山市超聲儀器有限公司；L-550臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SJIA-5FE真空冷凍干燥機寧波市雙嘉儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料的處理 用清水將軟棗獼猴桃枝條洗凈，于電熱鼓風干燥箱內(nèi)烘干，將烘干后的軟棗獼猴桃枝條粉碎后過50目電動振篩機，得到的粉末塑封保存。

1.2.2 軟棗獼猴桃枝條總?cè)频奶崛?準確稱取3.00 g干燥至恒重的軟棗獼猴桃枝條粉末于錐形瓶中，按一定液料比加入乙醇溶液，連續(xù)超聲提取，離心（4000 r/min，10 min），抽濾，濾液減壓濃縮至一定體積，加入10～15倍體積的石油醚于1000 mL分液漏斗中萃取脫脂，重復萃取3次，冷凍干燥得粗總?cè)品勰?。稱取適量的凍干粉末，加入一定的乙醇溶液于容量瓶中定容，配成樣品，備用。

1.2.3 齊墩果酸標準曲線的建立 準確稱取真空干燥至恒重的齊墩果酸標準品2 mg于10 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容后搖勻，得濃度為0.2 mg/mL齊墩果酸標準溶液。精密移取齊墩果酸標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL的具塞試管中，于60 ℃恒溫水浴鍋中揮干，流水冷卻，分別加入新配制的5%香草醛-冰乙酸試液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，立即振蕩混勻，于60 ℃水浴鍋加熱15～20 min，流水冷卻10 min，加入5 mL冰乙酸，搖勻后于紫外可見分光光度計中進行全波長掃描，確定548 nm處為最大吸收波長，于此波長下測定吸光度值，以齊墩果酸質(zhì)量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線。按下式計算總?cè)频奶崛×浚?/p>

式中：N為總?cè)铺崛×浚╩g/g）；m為樣品中總?cè)瀑|(zhì)量（mg）；A為稀釋倍數(shù)（1000）；M為軟棗獼猴桃枝條粉末干重（g）。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 乙醇濃度對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液90 mL。設(shè)置超聲溫度60 ℃，提取時間40 min，超聲功率300 W，考察乙醇濃度對AABTT提取量的影響。

1.2.4.2 液料比對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，分別加入30、60、90、120、150 mL 60%乙醇溶液，液料比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。設(shè)置超聲溫度60 ℃，提取時間40 min，超聲功率300 W，考察液料比對AABTT提取量的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，加入90 mL 60%乙醇溶液。分別設(shè)置超聲溫度40、50、60、70、80 ℃，提取時間40 min，超聲功率300 W，考察超聲溫度對AABTT提取量的影響。

1.2.4.4 提取時間對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，加入90 mL 60%乙醇溶液。分別設(shè)置提取時間20、30、40、50、60 min，超聲溫度60 ℃，超聲功率300 W，考察提取時間對AABTT提取量的影響。

1.2.4.5 超聲功率對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，加入90 mL 60%乙醇溶液。分別設(shè)置超聲功率200、250、300、350、400 W，超聲溫度60 ℃，提取時間40 min，考察超聲功率對AABTT提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計優(yōu)化軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康捻憫?yīng)面試驗，綜合考慮各因素對AABTT的影響可知：超聲溫度的影響最小，因而直接選用超聲溫度為50 ℃，選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）、超聲功率（D）作為試驗因素，以軟棗獼猴桃枝條中總?cè)频奶崛『繛轫憫?yīng)值。依據(jù)Box-Benhnken Design（BBD）試驗設(shè)計原理進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，共29組實驗，中心實驗為12、14、21、23、29組，其余組為非中心實驗。詳情見表1。三維頂點為A、B、C、D的取值，零點為區(qū)域中心點，重復5次零點實驗用以估計實驗誤差[17]。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 透明質(zhì)酸抑制試驗 精密移取濃度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的樣品溶液各0.5 mL，分別加入305 U/mL的透明質(zhì)酸酶液0.5 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 min，加入CaCl2溶液0.1 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 min，加入0.5 mg/mL透明質(zhì)酸鈉溶液0.5 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)40 min，室溫靜置10 min，加入蒸餾水0.5 mL、NaOH溶液0.1 mL、乙酰丙酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，立即冰浴冷卻10 min，室溫靜置10 min，加入Ehrlich試劑1 mL，振蕩后加入無水乙醇至8 mL，室溫靜置30 min，于530 nm處測定吸光度值，以雙氯芬酸鈉作為對照。

式中：M為透明質(zhì)酸酶活性抑制率（%）；A為蒸餾水與透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鈉混合溶液的吸光度值；B為蒸餾水與醋酸緩沖液的吸光度值；C為樣品與透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鈉混合溶液的吸光度值；D為樣品與醋酸緩沖液的吸光度值。

1.2.7 抑制牛血清白蛋白變性試驗 精密移取濃度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的樣品溶液各0.5 mL，分別加入1 %的牛血清白蛋白溶液各5 mL，使用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.3，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 min，加熱至51 ℃恒溫培養(yǎng)20 min，于660 nm處測定吸光度值，以雙氯芬酸鈉作為對照。

牛血清白蛋白變性抑制率的計算公式為：

式中：N為牛血清白蛋白變性抑制率（%）；E為牛血清白蛋白與樣品混合溶液的吸光度值；F為牛血清白蛋白與蒸餾水的吸光度值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實驗數(shù)據(jù)重復3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)（average）±標準差（SD）形式表示，采用SPSS 21.0、Excel 2010、Origin 85軟件分析處理所得數(shù)據(jù)，采用CalcuSyn Demo軟件計算半抑制率IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊墩果酸標準曲線

以齊墩果酸質(zhì)量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線，作圖得到總?cè)茲舛龋╔）與吸光度值（Y）的線性回歸曲線，回歸方程為：Y=6.2925X?0.0787，相關(guān)系數(shù)r=0.9991，表明總?cè)频臐舛扰c吸光度值的標準曲線線性關(guān)系良好，如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標準曲線Fig.1 Standard curve of Oleanolic acid

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖2可知，當濃度低于70%時，隨著乙醇濃度的升高，軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×侩S之增大，當濃度高于70%時，總?cè)铺崛×恐饾u下降。可能是因為總?cè)频娜芙庑耘c溶劑的極性有關(guān)，70%乙醇溶液極性可能剛好適合總?cè)迫芙?，因此較低較高的乙醇濃度都不利于其充分的溶解[18]。因而選擇60%、70%、80%作為響應(yīng)面的優(yōu)化水平。

圖2 乙醇濃度對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.2 Effect of ethanol concentration on total triterpenes extraction

2.2.2 液料比對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖3可知，當液料比小于30:1 mL/g時，隨著液料比的增大，軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×侩S之增大，當液料比大于30:1 mL/g時，總?cè)铺崛×恐饾u下降。原因可能為溶劑體積過小，總?cè)茻o法徹底溶解，但溶劑體積過大，還會溶出其他的雜質(zhì)[19]。因而選擇20:1、30:1、40:1 mL/g作為響應(yīng)面的優(yōu)化水平。

圖3 液料比對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.3 Effect of liquid-solid ratio on total triterpenes extraction

2.2.3 超聲溫度對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖4可知，當溫度低于50 ℃時，隨著超聲溫度的升高，軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×侩S之增大，當溫度高于50 ℃時，軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×恐饾u下降。原因可能為乙醇是易揮發(fā)性溶劑，超聲溫度越高乙醇揮發(fā)的速率越快，或者溫度過高會影響總?cè)平Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[20?21]。考慮不同溫度下總?cè)铺崛×康淖兓淮?，因此確定響應(yīng)面法優(yōu)化時適宜的超聲溫度為50 ℃。

圖4 超聲溫度對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.4 Effect of ultrasonic temperature on total triterpenes extraction

2.2.4 提取時間對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖5可知，當時間小于30 min時，隨著提取時間的增長，軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×侩S之增大，當時間大于30 min時，總?cè)铺崛×恐饾u下降。原因可能為提取時間過長會破壞總?cè)频慕Y(jié)構(gòu)使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了部分轉(zhuǎn)化，或者溶出了更多的雜質(zhì)[22?23]。因而選擇20、30、40 min作為響應(yīng)面的優(yōu)化水平。

圖5 提取時間對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.5 Effect of extraction time on total triterpenes extraction

2.2.5 超聲功率對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖6可知，當超聲功率小于350 W時，隨著超聲功率的增大，軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×侩S之增大，當超聲功率大于350 W時，總?cè)铺崛×恐饾u下降。原因可能為超聲功率達到一定強度可以產(chǎn)生更好的空化效果，但功率過大可能會破壞總?cè)频慕Y(jié)構(gòu)[24]。因而選擇300、350、400 W作為響應(yīng)面的優(yōu)化水平。

圖6 超聲功率對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.6 Effect of ultrasonic power on total triterpenes extraction

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性檢驗 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到以軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×浚╕）為目標函數(shù)的二次多項回歸方程：Y=57.31+2.87A+1.42B+0.56C?0.53D+0.38AB+0.65AC+3.63AD+2.45 BC+2.40BD+1.07CD?5.51A2?3.34B2?2.11C2?1.89D2

由ANOVA分析（詳情見表3）可知，模型F=31.52，P＜0.0001，建立的模型極顯著（P＜0.01）；失擬項F=2.77，P=0.1692，失擬項不顯著（P＞0.05）。表明所選用的二次多項模型的擬合程度良好。模型R2=0.9693，表明該回歸方程相關(guān)性較好，Radj2=0.9385，表明實驗數(shù)據(jù)93.85%的變異性可用此回歸模型來解釋。各因素對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊懘笮椋阂掖紳舛龋ˋ）＞液料比（B）＞提取時間（C）＞超聲功率（D）。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Varivance analysis results

2.3.2 交互因素分析 響應(yīng)面圖和等高線圖可以直觀的反映出各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，等高線的形狀反映出兩因素間交互作用的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著無促進作用，橢圓形表示交互作用顯著存在促進作用[2]。

由圖7可知，乙醇濃度和液料比對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊懀崛r間固定在30 min，超聲功率固定在350 W，總?cè)频奶崛×侩S乙醇濃度和液料比的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，乙醇濃度對應(yīng)的曲面坡度較液料比的陡峭，說明乙醇濃度對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笥谝毫媳?。等高線呈圓形，表示乙醇濃度和液料比交互作用不顯著，兩因素間無促進作用，與回歸方程中AB項方差分析結(jié)果正相符。

圖7 乙醇濃度與液料比對總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.7 Response surface and contour plots of the interactive effects of ethanol concentration and liquid-solid ratio on total triterpenes extraction

由圖8可知，乙醇濃度和提取時間對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊懀毫媳裙潭ㄔ?0:1 mL/g，超聲功率固定在350 W，總?cè)频奶崛×侩S乙醇濃度和提取時間的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，乙醇濃度對應(yīng)的曲面坡度較提取時間的陡峭，說明乙醇濃度對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笥谔崛r間。等高線呈圓形，表示乙醇濃度和提取時間交互作用不顯著，兩因素間無促進作用，與回歸方程中AC項方差分析結(jié)果正相符。

圖8 乙醇濃度與提取時間對總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.8 Response surface and contour plots of the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on total triterpenes extraction

由圖9可知，乙醇濃度和超聲功率對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊?，液料比固定?0:1 mL/g，提取時間固定在30 min，總?cè)频奶崛×侩S乙醇濃度和超聲功率的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，乙醇濃度對應(yīng)的曲面坡度較超聲功率的陡峭，即超聲功率較低時，等高線比較平緩，乙醇濃度對總?cè)频奶崛×坑绊懖惶@著，但超聲功率達300 W時，等高線排列緊密，乙醇濃度對總?cè)频奶崛×坑酗@著影響。同時發(fā)現(xiàn)乙醇濃度對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笥诔暪β?。等高線呈橢圓形，表示乙醇濃度和超聲功率交互作用顯著，兩因素間存在促進作用，與回歸方程中AD項方差分析結(jié)果正相符。

圖9 乙醇濃度與超聲功率對總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.9 Response surface and contour plots of the interactive effects of ethanol concentration and ultrasonic power on total triterpenes extraction

由圖10可知，液料比和提取時間對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊懀掖紳舛裙潭ㄔ?0%，超聲功率固定在350 W，總?cè)频奶崛×侩S液料比和提取時間的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，液料比對應(yīng)的曲面坡度較提取時間的陡峭，即提取時間較低時，等高線比較平緩，液料比對總?cè)频奶崛×坑绊懖惶@著，但提取時間達30 min時，等高線排列緊密，液料比對總?cè)频奶崛×坑酗@著影響。同時發(fā)現(xiàn)液料比對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笥谔崛r間。等高線呈橢圓形，表示液料比和提取時間交互作用顯著，兩因素間存在促進作用，與回歸方程中BC項方差分析結(jié)果正相符。

圖10 液料比與提取時間對總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.10 Response surface and contour plots of the interactive effects of liquid-solid ratio and extraction time on total triterpenes extraction

由圖11可知，液料比和超聲功率對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊懀掖紳舛裙潭ㄔ?0%，提取時間固定在30 min，總?cè)频奶崛×侩S液料比和超聲功率的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，液料比對應(yīng)的曲面坡度較超聲功率的陡峭，即超聲功率較低時，等高線比較平緩，液料比對總?cè)频奶崛×坑绊懖惶@著，但超聲功率達300 W時，等高線排列緊密，液料比對總?cè)频奶崛×坑酗@著影響。同時發(fā)現(xiàn)液料比對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笥诔暪β?。等高線呈橢圓形，表示液料比和超聲功率交互作用顯著，兩因素間存在促進作用，與回歸方程中BD項方差分析結(jié)果正相符。

圖11 液料比與超聲功率對總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.11 Response surface and contour plots of the interactive effects of liquid-solid ratio and ultrasonic power on total triterpenes extraction

由圖12可知，提取時間和超聲功率對軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×康挠绊?，乙醇濃度固定?0%，液料比固定在30:1 mL/g，總?cè)频奶崛×侩S提取時間和超聲功率的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，提取時間對應(yīng)的曲面坡度較超聲功率的陡峭，說明提取時間對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笥诔暪β?。等高線呈圓形，表示提取時間和超聲功率交互作用不顯著，兩因素間無促進作用，與回歸方程中CD項方差分析結(jié)果正相符。

圖12 提取時間與超聲功率對總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖和等高線Fig.12 Response surface and contour plots of the interactive effects of extraction time and ultrasonic power on total triterpenes extraction

2.3.3 最佳工藝驗證試驗 試驗得出超聲提取法提取AABTT的理論條件為：乙醇濃度76.83%，液料比39.78:1 mL/g，提取時間40.00 min，超聲功率400.00 W，在此理論條件下，總?cè)铺崛×繛?9.9151 mg/g。考慮到實際操作性，將試驗條件調(diào)整為，乙醇濃度77%，液料比40:1 mL/g，提取時間40 min，超聲功率400 W。為檢驗響應(yīng)面法所得最優(yōu)工藝條件的可靠性，重復3次試驗，所得平均提取量為58.42±0.36 mg/g，該結(jié)果與理論最大值接近，說明所得最優(yōu)工藝參數(shù)準確可靠，表明該模型可以較好地預測軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×俊?/p>

2.4 透明質(zhì)酸酶抑制效果

通過透明質(zhì)酸酶活力抑制實驗評估樣品的抗炎活性[25]。由圖13可知，AABTT對透明質(zhì)酸酶活力的抑制作用隨其濃度的增大而逐漸增強，質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，透明質(zhì)酸酶活力抑制率達81.48%±0.48%。用CalcuSyn Demo軟件計算AABTT的透明質(zhì)酸酶活力抑制率IC50為0.90 mg/mL，陽性對照雙氯芬酸鈉的IC50為0.39 mg/mL。

圖13 AABTT對透明質(zhì)酸酶活力的抑制效果Fig.13 Inhibitory effects of AABTT on hyaluronidase activity

2.5 牛血清白蛋白抑制活性

以牛血清白蛋白為模型蛋白，通過檢測牛血清白蛋白的變性抑制率，間接反映AABTT的抗炎活性[26]。由圖14可知，AABTT對牛血清白蛋白變性的抑制作用隨其濃度的增大而逐漸增強，質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，牛血清白蛋白變性抑制率達71.09%±0.39%。用CalcuSyn Demo軟件計算AABTT的牛血清白蛋白變性抑制率IC50為1.06 mg/mL，陽性對照雙氯芬酸鈉的IC50為0.42 mg/mL。

圖14 AABTT對牛血清白蛋白變性的抑制效果Fig.14 Inhibitory effects of AABTT on bovine serum albumin degeneration

3 討論與結(jié)論

響應(yīng)面法作為一種能有效解決多變量因素的數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法，彌補了正交試驗只能組合因素水平、無法優(yōu)化最佳工藝的缺點，本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken響應(yīng)面法對軟棗獼猴桃枝條總?cè)频某曁崛》ㄌ崛l件進行優(yōu)化，建立數(shù)學模型，研究表明乙醇濃度、液料比、提取時間、超聲功率均對軟棗獼猴桃枝條總?cè)频奶崛×坑幸欢ㄓ绊?，影響大小為，乙醇濃度＞液料比＞提取時間＞超聲功率。利用模型方程最終確定軟棗獼猴桃枝條總?cè)频淖罴烟崛」に嚄l件為，乙醇濃度77%，液料比40:1 mL/g，提取時間40 min，超聲功率400 W，在此條件下實際測得總?cè)铺崛×繛?8.42±0.36 mg/g。結(jié)果與理論值擬合度良好，表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃枝條總?cè)铺崛×繑?shù)據(jù)合理可靠，可為后續(xù)軟棗獼猴桃枝條總?cè)频倪M一步研究和發(fā)展提供依據(jù)。

透明質(zhì)酸酶活力抑制率達到81.48%±0.48%、牛血清白蛋白變性抑制率達到71.09%±0.39%，比陽性對照雙氯芬酸鈉抗炎活性略低，但都表現(xiàn)出了較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示，軟棗獼猴桃枝條總?cè)颇軌蛞种仆该髻|(zhì)酸酶的活性，防止透明質(zhì)酸（玻尿酸）分解，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；抑制牛血清白蛋白的變性，保護蛋白質(zhì)復雜的空間結(jié)構(gòu)，防止其生理功能的喪失，初步證實了軟棗獼猴桃枝條總?cè)拼嬖谝欢ǖ目寡谆钚?，可有效的減少炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展，維持生命活動的正常生理功能，但其抗炎作用機制還有待研究，為今后研究測定其對各類炎癥因子的抑制作用及相關(guān)機制提供了實驗基礎(chǔ)。