萬(wàn) 敏,姚于飛,付王威,吳睿婷,游慧婷,景 智,李文娟,
(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西南昌 330006;3.南昌大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,江西南昌 330006)
山臘梅常見于安徽、江蘇、江西、福建和貴州等地,是江西省上饒市婺源縣山區(qū)特色資源[1]。山蠟梅的嫩葉,可經(jīng)加工制作而成的功能性綠茶,因資源珍稀、功效奇特,被譽(yù)為“綠葉黃金”,命名為黃金茶。黃金茶為不發(fā)酵茶,通過(guò)揉捻等工藝制得,民間一直將其作為清涼解暑,健胃消食,治腹脹痛,止咳除煩的“藥食同源”的天然食材,經(jīng)常飲用對(duì)身體具有一定的防護(hù)作用,現(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí),黃金茶具有良好的止咳平喘、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)消化、減少體脂等作用[2]。黃金茶的活性成分繁復(fù),主要含有揮發(fā)油、多糖、生物堿、黃酮、香豆素、鯊肌醇、東莨菪苷、異嗪皮啶等物質(zhì)。黃金茶香味濃郁,揮發(fā)油含量高,被認(rèn)為是黃金茶中的主要活性成分[3]。目前有關(guān)茶飲品的活性功能研究中,抗氧化能力是體現(xiàn)其功效的重要指標(biāo)[4]。大量研究已證實(shí),有效清除自由基,抑制活性氧的形成的作用,是綠茶多種活性功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)黃金茶揮發(fā)油的抗氧化活性研究未見報(bào)道。
目前,揮發(fā)油的提取方法研究較多,如水蒸氣蒸餾法[6]、同時(shí)蒸餾萃取法[7]、超臨界流體萃取[8]、固相微萃取技術(shù)[9]等。常規(guī)提取黃金茶揮發(fā)油的方法主要集中在水蒸氣蒸餾法,此方法設(shè)備要求不高,操作簡(jiǎn)單,但得率較低[10?11]。同時(shí)蒸餾萃取法優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單,操作方便,溶劑用量較少,安全環(huán)保,缺點(diǎn)是試驗(yàn)所需溫度較高,揮發(fā)油部分成分易揮發(fā),且揮發(fā)油組分復(fù)雜,當(dāng)蒸餾溫度過(guò)高時(shí),樣品會(huì)發(fā)生水解、氧化或熱分解現(xiàn)象[12]。超臨界流體萃取法是比較新穎和熱門的提取方法,提取得率較高,但設(shè)備要求也較高,生產(chǎn)會(huì)比較受到限制[13?14]。微波輔助水蒸氣蒸餾法被定義為從植物中提取揮發(fā)油的一種替代方法,微波輔助萃取具有諸多優(yōu)點(diǎn),選擇性高、溶劑消耗量少等,且易于操作,適用面較廣[15?16],但微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油相關(guān)研究未見文獻(xiàn)報(bào)道用。
因此,本文主要研究在微波輔助水蒸氣蒸餾法提取過(guò)程中微波時(shí)間、料液比和水蒸氣蒸餾時(shí)間對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響,從而選出提取黃金茶揮發(fā)油最佳工藝。并且,本實(shí)驗(yàn)在金茶揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,應(yīng)用GC-MS對(duì)黃金茶揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析同時(shí),進(jìn)一步研究黃金茶揮發(fā)油的抗氧化作用,旨在為黃金茶的綜合利用提供新的技術(shù)支撐和理論參考。
黃金茶 由江西省婺源婺源縣龍塢山蠟梅專業(yè)合作社于2019年6月采摘山臘梅嫩葉,并制備而成;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;正己烷、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉、菲啰嗪 均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)于西隴化工股份有限公司。
METTLER TOLEDO AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;Anke TGL-16G-A高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;M1-L201B型微波爐 美的制冷家電集團(tuán);SKM型數(shù)顯恒溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;UT6紫外可見分光光度計(jì) 屹譜儀器制造(上海)有限公司;Milli-Q plus超純水儀 購(gòu)于美國(guó)Millipore公司;7890A-5975C GC-M聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司。
1.2.1 黃金茶揮發(fā)油的制備 稱取40 g黃金茶樣品,超純水浸泡后微波處理,待冷卻后應(yīng)用于水蒸氣蒸餾法提取,分別以微波時(shí)間(5、10、15、20和25 min)、料液比(1:20、1:25、1:30、1:35和1:40 g/mL)和水蒸氣蒸餾時(shí)間(2、3、4、5和6 h)的3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn),考察單因素對(duì)微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。提取過(guò)程中保持微沸狀態(tài),收集餾出液,加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥,得到黃金茶揮發(fā)油,計(jì)算得率。
1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)
1.2.2.1 微波時(shí)間對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品,在超純水中用料液比1:30 g/mL浸泡,分別以微波時(shí)間(5、10、15、20和25 min)對(duì)樣品進(jìn)行微波處理,待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h,考察微波時(shí)間對(duì)微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。
1.2.2.2 料液比對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品,在超純水中用料液比(1:20、1:25、1:30、1:35和1:40 g/mL)浸泡,微波處理10 min,待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h,考察料液比對(duì)微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。
1.2.2.3 水蒸氣蒸餾時(shí)間對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品,在超純水中用料液比1:30 g/mL浸泡,微波處理10 min,待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取2、3、4、5和6 h,考察水蒸氣蒸餾時(shí)間對(duì)微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。
1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)確定微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的最佳生產(chǎn)工藝,試驗(yàn)因素為微波時(shí)間、料液比和水蒸氣蒸餾時(shí)間。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。正交試驗(yàn)完成后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),分別稱取黃金茶3份,根據(jù)優(yōu)化提取工藝驗(yàn)證,計(jì)算其揮發(fā)油得率,取三次平均值與正交試驗(yàn)結(jié)果比較,得到的揮發(fā)油在0~4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental factors and levels
1.2.4 黃金茶揮發(fā)油得率的計(jì)算
式中,m1:黃金茶揮發(fā)油重量,g;m0:黃金茶重量,g;W,黃金茶揮發(fā)油得率,%。
1.2.5 GC-MS分析黃金茶揮發(fā)油組成
1.2.5.1 樣品的前處理 精密量取最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油7.5 μL,加入1.5 mL正己烷,并用無(wú)水硫酸鈉除水,5000 r/min離心10 min,取上清液得到待測(cè)溶液,通過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析。
1.2.5.2 色譜條件 HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱(250 μm×30 m, 0.25 μm),載氣為高純氮?dú)?,柱流量?.0 mL·min?1,進(jìn)樣量為1 μL,分流進(jìn)樣,分流比20:1,進(jìn)樣口溫度280 ℃,升溫程序:柱溫70 ℃,保持2 min,10 ℃·min?1的速率升至100 ℃,隨后以2 ℃·min?1的速率升至123 ℃并保持3 min,再以5 ℃·min?1的速率升至160 ℃,10 ℃·min?1的速率升至220 ℃,2 ℃·min?1的速率升至230 ℃并保持5 min。
1.2.5.3 質(zhì)譜條件 接口溫度280 ℃,電子轟擊(EI)能量70 eV,離子源溫度230 ℃,MS回級(jí)桿溫度150 ℃溶劑延遲7 min,全掃描,質(zhì)荷比20~500 amu。結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫(kù)并查閱文獻(xiàn)對(duì)揮發(fā)油組分進(jìn)行鑒定,采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。
1.2.6 黃金茶揮發(fā)油抗氧化活性測(cè)定
1.2.6.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 參考尹術(shù)華等[17]和Nuengchamnong等[18],現(xiàn) 配 濃 度 為2×10?4mol/L的DPPH自由基溶液,取最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油和BHT分別用無(wú)水乙醇稀釋為10.00、20.00、40.00、60.00、80.00和100.00 mg/mL待測(cè)液,分別取0.05 mL樣品溶液加入2 mL EP管中,然后加入0.2 mL DPPH自由基溶液,再加入0.05 mL乙醇渦旋混勻,避光30 min,517 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ),記為A2;對(duì)照組將0.2 mL DPPH自由基溶液更換為0.2 mL乙醇進(jìn)行試驗(yàn),517 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ),記為A1;空白組將0.05 mL黃金茶揮發(fā)油更換為0.05 mL乙醇進(jìn)行試驗(yàn),517 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ),記為A0。
根據(jù)公式計(jì)算清除率I(%):
1.2.6.2 還原力的測(cè)定 參考Zhao等[19]和吳楊洋等[20],測(cè)定前將最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油、BHT分別用無(wú)水乙醇稀釋成10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/mL濃度的待測(cè)液。把0.75 mL的1%的鐵氰化鉀溶液、0.75 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和0.75 mL的待測(cè)液相互混合,在向其中加入0.75 mL的10%的三氯乙酸,在4 ℃的條件下離心10 min(3000 r/min)。離心后取1.5 mL上清液,加入1.5 mL的蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液,完全混勻后,在室溫下靜置反應(yīng)10 min。然后在700 nm處測(cè)定其吸光度,記錄吸光度值為A,用蒸餾水做空白調(diào)零。
1.2.6.3 金屬離子螯合能力 參考劉瓊等[21]實(shí)驗(yàn),最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油用無(wú)水乙醇稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg/mL 濃度的黃金茶揮發(fā)油待測(cè)液,乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2)用超純水稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg/mL濃度的乙二胺四乙酸二鈉待測(cè)液,分別配好實(shí)驗(yàn)使用試劑,50 μmol/L的FeSO4溶液、0.15 mol/L的NaCl溶液和300 μmol/L的菲啰嗪。分別取0.2 mL待測(cè)液加入4 mL EP管中,依次加入0.2 mL FeSO4溶液、1.4 mL NaCl溶液和0.2 mL菲啰嗪,混勻,靜置10 min,562 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2;對(duì)照組將0.2 mL待測(cè)液更換為0.2 mL超純水進(jìn)行試驗(yàn),562 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)0;空白組將0.2 mL菲啰嗪更換為0.2 mL NaCl溶液進(jìn)行試驗(yàn),562 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。
根據(jù)公式計(jì)算樣品對(duì)金屬鐵離子的螯合活性I(%):
采用Excel、SPSS 22.0軟件處理和分析微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù),并作圖。
2.1.1 微波時(shí)間的確定 由圖1可知,隨著微波時(shí)間的增加,黃金茶揮發(fā)油得率有所增加,但幅度不大。當(dāng)微波時(shí)間超過(guò)10 min之后,黃金茶揮發(fā)油得率緩慢降低,微波時(shí)間為25 min時(shí),得率快速下降。這可能是因?yàn)槲⒉▽?duì)黃金茶茶葉細(xì)胞破壞其細(xì)胞膜的作用,微波處理時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞被破壞的程度就越大,被釋放到環(huán)境中的活性化合物也越多,從而揮發(fā)油得率增加。但當(dāng)處理黃金茶揮發(fā)油的微波時(shí)間超過(guò)10 min之后,由于內(nèi)部過(guò)熱,極性水導(dǎo)致植物體內(nèi)的壓力梯度增加細(xì)胞被劇烈破壞,細(xì)胞壁破裂,從而油更容易被釋放到周圍溶液當(dāng)中去,從而降低了黃金茶揮發(fā)油得率[22]。因此最佳微波時(shí)間為10 min。
圖1 微波時(shí)間對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effects of microwave time on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv
2.1.2 料液比的確定 從圖2可知,料液比越高,黃金茶揮發(fā)油得率越高,但料液比超過(guò)1:30時(shí),黃金茶揮發(fā)油得率降低。這是因?yàn)榱弦罕容^低時(shí),茶葉與水接觸面積較小,浸潤(rùn)度較低,不利于揮發(fā)油釋放,導(dǎo)致得率較低,也容易發(fā)現(xiàn)結(jié)焦現(xiàn)象。隨著料液比的增加,更多的極性水進(jìn)入黃金茶茶葉細(xì)胞,水在加熱時(shí)迅速升溫,加快細(xì)胞破裂使得揮發(fā)油能較多的被水蒸氣帶出,得率增加。但當(dāng)料液比過(guò)高時(shí),黃金茶揮發(fā)油在水中的溶解變大,導(dǎo)致部分油損失在水介質(zhì)中,且液面過(guò)厚也會(huì)影響微波的吸收[22]。因此最佳料液比為1:30。
圖2 料液比對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv
2.1.3 水蒸氣蒸餾時(shí)間的確定 由圖3可知,隨著水蒸氣蒸餾時(shí)間的增加,黃金茶揮發(fā)油得率增加。當(dāng)水蒸氣蒸餾時(shí)間超過(guò)5 h之后,黃金茶揮發(fā)油得率降低。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[23],推測(cè)隨著時(shí)間的增加,黃金茶揮發(fā)油不斷的隨著水蒸氣從黃金茶茶葉中分離出來(lái),但過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間導(dǎo)致?lián)]發(fā)油被破壞或除介質(zhì),使得黃金茶揮發(fā)油得率下降。因此,最佳水蒸氣蒸餾時(shí)間為5 h。
圖3 水蒸氣蒸餾時(shí)間對(duì)黃金茶揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Effects of steam distillation time on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv
以黃金茶揮發(fā)油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),每次試驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值。通過(guò)表2可知,微波時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率影響最大,其他依次是水蒸氣蒸餾時(shí)間、料液比,最佳工藝是A2B2C2,即微波時(shí)間10 min,料液比1:25 g/mL,水蒸氣蒸餾時(shí)間5 h。由表3可知,微波時(shí)間、水蒸氣蒸餾時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著(P<0.01),這與極差分析結(jié)果一致。根據(jù)優(yōu)化提取工藝驗(yàn)證,揮發(fā)油得率分別為1.7987%、1.7684%、1.7706%,平均值為1.7792%,高于正交試驗(yàn)結(jié)果,重現(xiàn)性好,確定優(yōu)化提取工藝為A2B2C2。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test
表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Tests of Between-Subjects effects
對(duì)黃金茶揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析,共分離出23個(gè)峰,并采用面積歸一化法計(jì)算黃金茶揮發(fā)油各組分相對(duì)含量,總離子流圖見圖4,黃金茶揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)顯示,有21種成分被鑒定出,鑒定出的物質(zhì)成分占總峰的93.27%,黃金茶揮發(fā)油主要以萜類化合物為主,是該揮發(fā)油香氣的主要成分。在鑒定出的化合物中,相對(duì)含量在1%以上的有15種,占被檢測(cè)物質(zhì)總量的88.75%,其中(1-甲基-4-丙-1-烯-2-基環(huán)己基)乙酸酯的含量達(dá)到50.67%,其次是α-蒎烯(6.92%)、α-乙酸松油酯(5.77%)、環(huán)氧化蛇麻烯II(3.96%)、偽檸檬烯(3.21%)、右旋大根香葉烯(3.12%)等。
圖4 黃金茶揮發(fā)油的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion flow chromatography of Chimonanthus nitens Oliv essential oil
表4 黃金茶揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv
目前黃金茶揮發(fā)油組分的相關(guān)檢測(cè)研究未見報(bào)道。徐年軍等[10]報(bào)道了山臘梅葉中揮發(fā)油成分分析,與本實(shí)驗(yàn)獲得的黃金茶揮發(fā)油的組分對(duì)比發(fā)現(xiàn)主要成分相似,但也有一定的差異,主要體現(xiàn)在成分(1-甲基-4-丙-1-烯-2-基環(huán)己基)乙酸酯的不同,黃金茶中該乙酸酯含量為50.67%。與山臘梅相比,黃金茶揮發(fā)油成分的差異因素,可能與黃金茶的制備或揮發(fā)油的提取過(guò)程有關(guān):原材料山臘梅葉中醇類物質(zhì)在熱環(huán)境下氧化合成為酯類物質(zhì),但確切的因素需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
2.4.1 黃金茶揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用DPPH自由基的還原能力能使深紫色溶液被中變成無(wú)色或淺黃色,這可以作為評(píng)價(jià)抗氧化的方法[24?25]。結(jié)果表明,在各濃度梯度中黃金茶揮發(fā)油呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,如圖5所示,其清除DPPH自由基能力隨著濃度的升高而增大,黃金茶揮發(fā)油的IC50為81.60 mg/mL,當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/mL時(shí),清除作用達(dá)到56.13%,而2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的清除率達(dá)到95.42%,與BHT相比較,黃金茶揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用低于BHT的抗氧化作用。以上結(jié)果顯示,黃金茶揮發(fā)油具有一定DPPH自由基的清除作用。
圖5 DPPH自由基清除作用Fig.5 DPPH free radical scavenging effect
2.4.2 黃金茶揮發(fā)油對(duì)還原力的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,黃金茶揮發(fā)油在10 mg/mL時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照組還原力最為接近,當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí),還原力處于緩慢上升的趨勢(shì),黃金茶揮發(fā)油濃度在40~50 mg/mL時(shí)還原力呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì),但相比較于BHT,黃金茶揮發(fā)油對(duì)鐵離子的還原能力較弱。以上結(jié)果表明黃金茶揮發(fā)油具有較強(qiáng)的還原力。
圖6 還原力的測(cè)定Fig.6 Reduction force determination
2.4.3 黃金茶揮發(fā)油對(duì)金屬離子螯合能力的測(cè)定 如圖7所示,黃金茶揮發(fā)油對(duì)金屬離子螯合能力的IC50為17.16 mg/mL,且黃金茶揮發(fā)油對(duì)亞鐵離子螯合能力隨呈現(xiàn)劑量依賴性,當(dāng)濃度達(dá)到40 mg/mL時(shí),金屬離子螯合能力達(dá)到81.06%,此時(shí),EDTA的金屬離子螯合能力達(dá)到93.94%,與EDTA相比,黃金茶揮發(fā)油的金屬離子螯合能力較低。以上結(jié)果可知黃金茶揮發(fā)油具有的螯合亞鐵離子能力。
圖7 金屬離子螯合能力Fig.7 Chelating ability of metal ions
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確認(rèn)微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的最優(yōu)工藝為微波時(shí)間10 min,料液比1:25 g/mL,水蒸氣蒸餾時(shí)間5 h,此條件下黃金茶揮發(fā)油得率為1.7792%。通過(guò)GCMS分析可知黃金茶揮發(fā)油中含有21種化學(xué)成分,其主要成分是為酯類化合物和萜類化合物。從抗氧化實(shí)驗(yàn)可以看出黃金茶揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除能力、還原力和金屬離子螯合能力都呈現(xiàn)出抗氧化作用。以上結(jié)論說(shuō)明,黃金茶揮發(fā)油是一種具有抗氧化作用的有待開發(fā)的天然活性物質(zhì),但由于黃金茶揮發(fā)油的組成成分豐富,其抗氧化機(jī)理及清除自由基活性成分分析仍需進(jìn)一步研究。