商 桑，高倫江，曾小峰，曾順德，刁 源，尹旭敏，陳一龍

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，重慶 401329）

李子已成為重慶第2大主栽水果，栽培面積達(dá)100萬畝以上，產(chǎn)量超50萬噸，重慶李子栽培品種主要為青脆李、脆紅李等，已成為重慶巫山、酉陽、萬州等地精準(zhǔn)扶貧、鄉(xiāng)村振興的重要支柱產(chǎn)業(yè)。特別是“巫山脆李”已成為著名的區(qū)域公共品牌，品牌價值超20億。青脆李皮薄肉脆、味甜汁多，營養(yǎng)豐富，富含多種維生素、氨基酸及礦物質(zhì)，深受人們喜愛[1?3]。但青脆李是典型的呼吸躍變型果實(shí)，且重慶地區(qū)青脆李成熟期正值7～8月盛夏，由于環(huán)境溫度較高，采后極易發(fā)生后熟現(xiàn)象，在常溫運(yùn)輸中2～3 d便會發(fā)生軟化、褐變以及腐爛等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[1]，迫切需要保鮮和精深加工來支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

目前，以李子為原料的產(chǎn)品開發(fā)主要集中在果汁[4?5]、果酒[6?7]、果醋[8]、果脯[9]、蜜餞[10]、果干[11?12]及果糕[13]等，而有關(guān)青脆李益生菌飲品開發(fā)方面鮮有報(bào)道。許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品或地域特色食品，如泡菜、酸乳、奶酪、奶酒等，都有益生菌的存在[14]。隨著人類對益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)物與健康關(guān)系認(rèn)識的不斷深入，益生菌發(fā)酵食品受到了越來越多的關(guān)注。益生菌可改善人體腸道菌群平衡、改善乳糖不耐癥、提高機(jī)體免疫力、合成營養(yǎng)素、預(yù)防食物過敏、降低血脂和保護(hù)肝臟、提高人體健康水平等[15?18]。乳制品是益生菌應(yīng)用最多、最為成熟的食品領(lǐng)域，但乳制品中含有較高的脂肪和膽固醇，且還存在乳蛋白過敏、乳糖不耐受等健康風(fēng)險(xiǎn)，限制了益生菌發(fā)酵乳制品的消費(fèi)[19]?；诠返姆侨橐嫔l(fā)酵食品的開發(fā)受到越來越多的關(guān)注[20?21]，水果富含糖類、有機(jī)酸、維生素、多酚、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，是益生菌發(fā)酵的理想基質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，許多常見水果原料如蘋果[22]、桑葚[23?24]、石榴[25]、獼猴桃[26]、櫻桃[27]、檸檬[28]、橙[29]等益生菌發(fā)酵產(chǎn)品，其葡萄糖、果糖濃度下降，乳酸等有機(jī)酸含量增加，酯類、酮類和醇類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)增加，抑菌活性、抗氧化能力及抗敏活性提高，不僅增加了益生功效，而且增進(jìn)了產(chǎn)品的風(fēng)味，且極大豐富了我國飲料和果蔬制品的種類。研發(fā)青脆李益生菌飲品，對提升青脆李精深加工產(chǎn)品檔次具有重要意義。篩選青脆李益生菌飲品適宜發(fā)酵菌種、適宜的發(fā)酵工藝參數(shù)及冷藏品質(zhì)變化規(guī)律，可為青脆李益生菌飲品生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青脆李原料 產(chǎn)自重慶酉陽；益生菌嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，1.1854）、植物乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，1.2469）、嗜熱鏈球菌（Lactobacillus acidophilus，1.2471）選購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 奧博星生物技術(shù)有限公司。

SA-1600-2JZ多功能超凈工作臺 上海稼豐園藝用品有限公司；DJ2-4.0雙道打漿機(jī) 江蘇靖江食品機(jī)械制造有限公司；TG-1850醫(yī)用離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度計(jì) 日本Atago愛拓；無菌塑料一次性培養(yǎng)皿（90 mm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 斜面冷藏保存的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌分別用接種針各取一環(huán)，分別接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，獲得發(fā)酵用菌種，3000 r/min離心15 min去上清液、無菌水洗滌、二次離心，再去上清液備用。

1.2.2 青脆李原漿制備 將青脆李洗凈、晾干后采用雙道打漿機(jī)破碎取汁盛放于不銹鋼發(fā)酵桶內(nèi)備用。

1.2.3 青脆李益生菌飲品適宜菌株篩選

1.2.3.1 青脆李益生菌飲品優(yōu)勢發(fā)酵菌株篩選 擴(kuò)大活化后的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌（1:1:1）分別以0.5‰質(zhì)量比接種量接種于青脆李原漿中，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)3 d，每隔8 h定時測定青脆李益生菌飲品的pH變化情況。

1.2.3.2 混合菌株不同接種比例對生長速度的影響 優(yōu)選后的混合菌株按照1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、2:1:1、2:2:1比例混合，按0.5‰質(zhì)量比接種量接種于青脆李原漿中，37 ℃下培養(yǎng)3 d，定時測定其活菌落總數(shù)。

1.2.4 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝研究單因素優(yōu)化

1.2.4.1 菌株添加量對青脆李益生菌飲品感官評分的影響 以感官評分作為考察青脆李益生菌飲品發(fā)酵品質(zhì)的特征指標(biāo)。37 ℃，發(fā)酵3 d條件下，發(fā)酵接種量0.1‰、0.3‰、0.5‰、0.7‰、0.9‰、1.1‰（質(zhì)量比）為單因素實(shí)驗(yàn)，確定菌株添加量最佳水平范圍。

1.2.4.2 發(fā)酵溫度對青脆李益生菌飲品感官評分的影響 以感官評分作為考察青脆李益生菌飲品發(fā)酵品質(zhì)的特征指標(biāo)。0.5‰接種量，發(fā)酵3 d條件下，發(fā)酵溫度20、25、30、35、40 ℃為單因素實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度最佳水平范圍。

1.2.4.3 不同發(fā)酵時間對青脆李益生菌飲品感官評分的影響 以感官評分作為考察青脆李益生菌飲品發(fā)酵品質(zhì)的特征指標(biāo)。0.5‰接種量下，25 ℃條件下，發(fā)酵時間24、32、40、48、56、64、72 h為單因素實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵時間最佳水平范圍。

1.2.5 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳水平范圍，以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、接種量（C）及空白（D）為自變量進(jìn)行正交試驗(yàn)，以感官評分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)L9（34）因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment

1.2.6 冷藏對青脆李益生菌飲品貯藏品質(zhì)的影響在4 ℃冷藏條件，分別于5、10、15、20、25、30 d定期測定可滴定酸、pH、可溶性固形物、還原糖及活菌落總數(shù)，考察冷藏時間對青脆李益生菌飲品貯藏品質(zhì)影響情況。

1.2.7 指標(biāo)測定

1.2.7.1 活菌落總數(shù) 稀釋涂布法測定活菌群總數(shù)[30]：無菌條件下取25 mL青脆李益生菌飲品，加入225 mL無菌生理鹽水中，振搖，制成10?1的均勻稀釋液，再取1 mL稀釋液加入9 mL無菌生理鹽水中，制成10?2稀釋液，并繼續(xù)進(jìn)行梯度稀釋至10?8。在進(jìn)行梯度稀釋的同時，分別吸取該稀釋度的稀釋液1 mL于兩個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入47 ℃左右的MRS瓊脂培養(yǎng)基并混勻，待培養(yǎng)基凝固后，于37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，選擇菌落總數(shù)在30～300個的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7.2 總酸含量 采用酸堿滴定法測定（GB/T 12456-2008 食品中總酸的測定）。

1.2.7.3 pH 采用pH計(jì)測定。

1.2.7.4 可溶性固形物含量 采用手持糖度計(jì)測定。

1.2.7.5 還原糖含量 采用直接滴定法測定（GB5009.7-2016食品中還原糖的測定）。

1.2.7.6 青脆李益生菌汁感官評價 選取長期喜食益生菌酸奶及益生菌發(fā)酵果汁且年齡25-30歲，男女各半的嗜好型評定人員組成評定小組，從青脆李益生菌飲品色澤、氣味、口感等方面綜合進(jìn)行評定，滿分為10分，取平均分進(jìn)行評定[31]，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 青脆李益生菌飲品感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for fermented Prunus americana juice

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青脆李益生菌飲品適宜菌株篩選

2.1.1 青脆李益生菌飲品優(yōu)勢發(fā)酵菌株篩選 圖1結(jié)果表明，各發(fā)酵菌株組合發(fā)酵青脆李原漿，其pH值隨著發(fā)酵時間的延長，前期下降較快、后期下降較慢。72 h下嗜酸乳桿菌發(fā)酵青脆李原漿其pH下降32.54%、植物乳桿菌下降29.19%、嗜熱鏈球菌下降28.60%、三菌株混合發(fā)酵下降35.31%。從菌株對益生菌飲品pH值影響考慮，認(rèn)為植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢發(fā)酵菌株組合。

圖1 不同益生菌對青脆李益生菌飲品pH的影響Fig.1 The influence of different probiotics on the pH value of fermented Prunus americana juice

表3 感官評分結(jié)果顯示，植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌優(yōu)于其他三種益生菌株單獨(dú)使用。綜合圖1和表3結(jié)果認(rèn)為植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌可作為優(yōu)勢菌株進(jìn)一步開展發(fā)酵工藝及參數(shù)優(yōu)化。

表3 不同益生菌對青脆李益生菌飲品的感官評價Table 3 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana juice with different probiotics bacterias

2.1.2 混合菌株不同接種比例對生長速度的影響圖2結(jié)果表明，不同混合菌株比例其菌落總數(shù)隨發(fā)酵時間延長初期呈上升趨勢，后期呈緩慢增長趨勢。菌落總數(shù)最高可達(dá)3.48×109，最低也有2.97×109，均達(dá)到109數(shù)量級，與獼猴桃[26]益生菌發(fā)酵汁菌落總數(shù)相當(dāng)，超過乳酸菌飲料[32]106CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)?？傮w看來對菌落總數(shù)影響均不明顯。本著方便原則，選擇植物乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌=1:1:1開展后續(xù)工作。

圖2 接種比例對菌株生長速率的影響Fig.2 The change of inoculation ratio on the growth rate of strainsn

2.1.3 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝研究單因素優(yōu)化

2.1.3.1 菌株添加量對青脆李益生菌飲品感官評分的影響 接種量較低和較高時，對發(fā)酵感官均影響較大。接種量過低，發(fā)酵時間較長，發(fā)酵速度較慢，風(fēng)味物質(zhì)形成較少，產(chǎn)酸量低且容易受到雜菌污染；接種量過高，較難控制發(fā)酵速度，發(fā)酵產(chǎn)品容易偏酸，且發(fā)酵風(fēng)味過于濃郁，發(fā)酵速度雖能加快但微生物細(xì)胞易衰老，且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[33]。圖3結(jié)果表明，隨著接種量的增加，感官評分逐漸上升，然后呈下降趨勢，接種量0.3‰時感官評分為8.2、0.5‰時8.7，0.7‰時8.9，感官評分高低反應(yīng)益生菌飲料色澤、氣味和口感的優(yōu)劣，綜合考慮確定最適菌株添加量范圍0.5‰～0.7‰。

圖3 接種量對青脆李益生菌飲品感官評價的影響Fig.3 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different inoculation

2.1.3.2 發(fā)酵溫度對青脆李益生菌飲品感官評分的影響 發(fā)酵溫度影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，以及產(chǎn)品的酸度和風(fēng)味[34]。圖4結(jié)果表明，發(fā)酵溫度過低，代謝不活躍，產(chǎn)酸不足，使酸甜不協(xié)調(diào)；發(fā)酵溫度越高代謝越旺盛，產(chǎn)酸越快，但過高，導(dǎo)致口感過酸而不愉悅[35]；隨著發(fā)酵溫度的上升，感官評分由上升趨勢轉(zhuǎn)為下降趨勢。發(fā)酵溫度20 ℃時感官評分為8.1、25 ℃時8.4，30 ℃時8.3，感官評分高低反應(yīng)益生菌飲料色澤、氣味和口感的優(yōu)劣，綜合考慮確定最佳發(fā)酵溫度范圍20～30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對青脆李益生菌飲品感官評價的影響Fig.4 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different temperature

2.1.3.3 不同發(fā)酵時間對青脆李益生菌飲品感官評分的影響 發(fā)酵時間與發(fā)酵食品的風(fēng)味品質(zhì)密切相關(guān)，發(fā)酵時間過短，則發(fā)酵菌株還處于自身生長階段，代謝物質(zhì)較少；發(fā)酵時間過長，則造成代謝物質(zhì)積累產(chǎn)生異味[36]。圖5結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，青脆李益生菌飲品感官評分呈先上升后下降趨勢。發(fā)酵時間32 h感官評分為8.3、40 h時8.6，48 h時8.9，感官評分高低反應(yīng)益生菌飲料色澤、氣味和口感的優(yōu)劣，綜合考慮最佳發(fā)酵時間范圍40～48 h。

圖5 發(fā)酵時間對青脆李益生菌汁感官評價的影響Fig.5 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different time

2.2 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表4可知，正交試驗(yàn)結(jié)果R值可以看出，各因素對青脆李益生菌飲品感官的影響順序?yàn)锳（溫度）＜B（時間）＜C（接種量）。從各因素K值可以看出，溫度、時間、接種量3因素試驗(yàn)最佳組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間44 h，接種量0.7‰。采取A2B2C3驗(yàn)證試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)青脆李益生菌飲品感官評價分值達(dá)到9.2，證實(shí)此組合為較優(yōu)的試驗(yàn)方案。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 L9（34）Orthogonal test design and results

2.3 冷藏對青脆李益生菌飲品貯藏品質(zhì)的影響

2.3.1 冷藏對青脆李益生菌飲品可滴定酸、pH變化的影響 圖6結(jié)果表明，4 ℃冷藏條件下總酸含量緩慢增加，pH值趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)橘A藏過程益生菌菌株處于衰亡期，隨著代謝產(chǎn)物積累和生長環(huán)境的惡劣，產(chǎn)酸速度則趨于變緩，pH值也相對穩(wěn)定。

圖6 4 ℃冷藏對青脆李益生菌飲品總酸、pH影響Fig.6 The change of acid and pH in the condition of 4 ℃ refrigeration

2.3.2 冷藏對青脆李益生菌飲品可溶性固形物、還原糖含量的影響 圖7結(jié)果表明，4 ℃冷藏條件青脆李益生菌飲品可溶性固形物含量隨冷藏時間的推移緩慢下降，但總體上變化不大?？赡茉蚴乔啻嗬钤瓭{中含有的大量原果膠在酸性條件下水解為果膠，水溶性果膠的增加彌補(bǔ)了益生菌發(fā)酵過程消耗的葡萄糖和果糖，造成可溶性固形物的變化不明顯。由于青脆李益生菌飲品中還原糖的水解和消耗的速度達(dá)到了一個平衡，所以還原糖含量相對穩(wěn)定。

圖7 4 ℃冷藏對青脆李益生菌飲品還原糖、可溶性固形物影響Fig.7 The change of reducing sugar and soluble solids in the condition of 4 ℃ refrigeration

2.3.3 冷藏對青脆李益生菌飲品活菌落總數(shù)的影響圖8結(jié)果表明，青脆李益生菌飲品4 ℃冷藏條件活菌落總數(shù)隨儲存時間的延長逐漸降低，冷藏20 d活菌落總數(shù)為8.6×107CFU·mL?1，滿足活性乳酸菌飲品要求[37]。冷藏30 d活菌數(shù)仍有2.0×106CFU·mL?1，與國家標(biāo)準(zhǔn)GB19302[38]規(guī)定發(fā)酵乳的乳酸菌數(shù)應(yīng)不少于1×106CFU·mL?1相當(dāng)。

圖8 4 ℃冷藏對青脆李益生菌飲品活菌數(shù)的影響Fig.8 The number of viable bacteria in the condition of 4 ℃ refrigeration

3 結(jié)論與討論

益生菌菌株是影響果汁發(fā)酵的關(guān)鍵因素，不同益生菌菌株對果汁理化特性和營養(yǎng)組成的適應(yīng)能力不同，其在果汁中的生長與發(fā)酵性能也存在較大差異，對獼猴桃[26]、蘋果[39]發(fā)酵的風(fēng)味以及營養(yǎng)成分的影響也不相同。本研究通過初篩發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌1.1854、植物乳桿菌1.2469、嗜熱鏈球菌1.2471及三菌株組合發(fā)酵能顯著降低青脆李原漿pH值，三菌株組合發(fā)酵活菌落總數(shù)、感官評分占優(yōu)，最優(yōu)工藝條件植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌1:1:1混合菌株接種量0.7‰、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間44 h下，獲得青脆李益生菌飲品感官評分9.1（滿分10分）；說明所篩選的復(fù)合益生菌菌株適合青脆李原漿發(fā)酵，可用于青脆李益生菌飲品的開發(fā)?；罹鷶?shù)是益生菌發(fā)酵食品的一個重要指標(biāo)，成為菌株篩選與工藝優(yōu)化的首選考察指標(biāo)。但活菌數(shù)測定程序復(fù)雜、耗時長，考慮用簡單、快速的指標(biāo)替代。常采用可滴定酸含量、pH反映乳酸菌在果汁中的生長與發(fā)酵情況[40]。本研究初篩主要考察發(fā)酵青脆李益生菌飲品pH值和感官評分，目的在于快速篩選對青脆李原漿發(fā)酵能力強(qiáng)、有利于保持或提高青脆李營養(yǎng)功能的益生菌菌株。

除菌株對果汁的適應(yīng)性和發(fā)酵能力外，菌株對發(fā)酵風(fēng)味的影響也至關(guān)重要，感官評分常作為菌株篩選與工藝優(yōu)化的考察指標(biāo)[41]。本研究以感官評分為指標(biāo)進(jìn)行菌株復(fù)篩和和發(fā)酵青脆李原漿工藝優(yōu)化，獲得了發(fā)酵青脆李益生菌飲品適宜菌株組合以及最佳發(fā)酵工藝條件。

益生菌發(fā)酵果汁活菌落數(shù)在貯存過程中的變化與貯藏溫度密切相關(guān)，本研究表明，4 ℃冷藏條件下存放20 d活菌數(shù)仍在8.6×107CFU·mL?1，30 d達(dá)2.0×106CFU·mL?1，與國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定發(fā)酵乳的乳酸菌數(shù)應(yīng)不少于1×106CFU·mL?1相當(dāng)，說明低溫貯存有利于活菌數(shù)的保持，青脆李益生菌飲品采用低溫保藏和冷鏈流通；在4 ℃冷藏條件下其可滴定酸、pH值、可溶性固形物含量、還原糖含量均基本保持穩(wěn)定，相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)是否與貯藏溫度有關(guān)，還有待進(jìn)一步探索。