江友婭，陳 琦，張 露，高 雪,

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；2.重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司，重慶 400061）

前期糖尿病也被稱(chēng)為中度高血糖癥，主要包括葡萄糖耐量損傷和空腹血糖損傷，是處于正常人群和糖尿病人群之間的一種中間狀態(tài)。據(jù)2018年統(tǒng)計(jì)，全球的前期糖尿病患者約有四億七千萬(wàn)人[1]。研究顯示，前期糖尿病患者因心血管疾病、腎臟疾病和全因死亡率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血糖正常的人[2]。前期糖尿病在后期會(huì)發(fā)展為糖尿病，糖尿病屬于一種代謝性疾病，是由胰島素分泌受損或胰島素功能障礙所致，它對(duì)人類(lèi)身體造成的危害僅次于心血管疾病和癌癥[3]。上世紀(jì)八十年代，世界上只有1.08億的糖尿病患者，截止到2015年，糖尿病人口數(shù)量已接近約4.22億，2011年聯(lián)合國(guó)非傳染性疾病問(wèn)題高級(jí)別會(huì)議后設(shè)定的全球防控目標(biāo)之一是到2025年，將成人糖尿病年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率的上升控制在2010年的水平，推測(cè)到2025年僅少數(shù)國(guó)家可達(dá)到該防控目標(biāo)[4]。2017年對(duì)中國(guó)糖尿病的發(fā)生率和相關(guān)死亡率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明中國(guó)的糖尿病發(fā)生率已從上世紀(jì)80年代的1%提高到現(xiàn)在約11%[5]；截止到2017年，國(guó)內(nèi)糖尿病患者數(shù)量已接近約1.1億人，患病率居世界第一[6]。由此可見(jiàn)，糖尿病已經(jīng)威脅到了全球的公共健康。抑制α-葡萄糖苷酶活性在治療糖尿病中起著重要作用，α-葡萄糖苷酶是與餐后寡糖分解有關(guān)的一種關(guān)鍵酶。目前，市場(chǎng)上還缺乏安全有效的降糖或預(yù)防糖尿病的功能性成分，如阿卡波糖等常見(jiàn)合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑就具有腹脹、腹瀉以及皮膚過(guò)敏等副作用[7]，所以，現(xiàn)在亟需在天然產(chǎn)物中尋找和開(kāi)發(fā)更加安全有效的降糖的功能性成分。

芫花素（Genkwanin，5,4'-二羥基-7-甲氧基黃酮）屬于黃酮類(lèi)化合物[8]，來(lái)源豐富。我國(guó)天然藥物化學(xué)家曾廣方從瑞香科植物芫花的干燥花蕾中首次分離出芫花素[9]。此后，研究人員從迷迭香、益母草和黃芩等藥食兩用植物中分離得到芫花素[10?12]。根據(jù)研究結(jié)果顯示[13?14]，芫花素對(duì)調(diào)節(jié)免疫、緩解疼痛、抗炎和抗腫瘤等方面具有一定的作用。由此可以看出，研究芫花素在開(kāi)發(fā)功能性分子方面具有一定的前景。但是，目前關(guān)于芫花素對(duì)預(yù)防糖尿病或前期糖尿病的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，以芫花素為研究對(duì)象，研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用和機(jī)理。前期采用體外酶活實(shí)驗(yàn)法和酶動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制類(lèi)型，后期采用熒光猝滅法進(jìn)一步探究芫花素與α-葡萄糖苷酶之間的相互作用機(jī)理。為將芫花素開(kāi)發(fā)為降糖功能性成分提供一定的理論依據(jù)，也為功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芫花素（純度≥98%） 普菲德生物有限公司；α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，99%） 美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖98%，TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司；二甲亞砜 分析純，重慶川東化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純，成都市科龍化工試劑廠。

ALC-210.4電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YP502N電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)pH計(jì) 寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-DH500-S-II電熱恒溫箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；VORTEX-5震蕩機(jī) 海門(mén)市其林貝爾儀器制造廠；SB-5200D超聲波清洗機(jī) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Infinite M2000酶標(biāo)儀 帝肯貿(mào)易有限公司；F-2500全波長(zhǎng)掃描式式多功能讀數(shù)儀、Finnpipette F3微型移液器 賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定參照Guilin等[15]的方法并加以改進(jìn)。將100 μL不同濃度（0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75 mg/mL）的芫花素溶液與50 μL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液混合，然后分別加入50 μL 0.6 mg/mL底物（PNPG），混合物于37 ℃下孵育30 min，空白對(duì)照組使用磷酸緩沖液（0.01 mol/L pH=6.8）與二甲亞砜以1:1體積比混合的溶液替代樣品。吸光度值在405 nm下被檢測(cè)。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。抑制率計(jì)算如下：

式中：A空白表示不加芫花素的紫外吸光度值；A樣品表示加入芫花素反應(yīng)后體系的紫外吸光度值。

1.2.2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定根據(jù)郭時(shí)印等[16]的方法并加以改進(jìn)。固定α-葡萄糖苷酶的濃度為0.5 U/mL，選擇芫花素0、0.1、0.3 mg/mL三個(gè)濃度梯度，分別加入不同質(zhì)量濃度（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL）的 底 物（PNPG），其中α-葡萄糖苷酶、芫花素和底物添加量分別為50、100和50 μL，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min，使用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度值。將反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）對(duì)底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S]）作圖，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法研究芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型。

1.2.3 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用 采用楊麗珍等[17?18]的方法并加以改進(jìn)。分別移取0.5 U/mLα-葡 萄 糖 苷 酶 溶 液180 μL和2.6384×10?3mol/L芫花素溶液0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL，使芫花素溶液終濃度為0、1.0148×10?4、2.0296×10?4、3.0443×10?4、4.0591×10?4、5.0739×10?4、6.0887×10?4、7.1035×10?4、8.1185×10?4mol/L，最后用磷酸緩沖液（0.01 mol/L pH=6.8）與二甲亞砜以1:1體積比混合的溶液將反應(yīng)體積補(bǔ)足至260 μL，作為α-葡萄糖苷酶-芫花素混合體系。在291、310 K兩個(gè)溫度下孵育30 min。將280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，狹縫寬度設(shè)定為2 nm。掃描各樣品在298～370 nm處的熒光光譜。

1.2.4α-葡萄糖苷酶熒光猝滅類(lèi)型的推斷 熒光猝滅包括靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種[19]。芫花素和α-葡萄糖苷酶相互作用后，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度變化可以由Stern-volmer方程說(shuō)明：

式中：F0表示α-葡萄糖苷酶在不加芫花素的情況下的熒光強(qiáng)度；F表示α-葡萄糖苷酶在加入芫花素后的熒光強(qiáng)度；Kq表示在猝滅過(guò)程中的速率常量，L/（mol·s）；τ0表示當(dāng)芫花素不存在時(shí)，熒光分子的平均壽命（10?8s）；[Q]表示芫花素的濃度，mol/L；Ksv表示熒光猝滅常量，L/mol。

1.2.5 熒光猝滅中結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算熒光猝滅時(shí)，假設(shè)酶上面有n個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)和小分子相互作用，則其結(jié)合常數(shù)、熒光強(qiáng)度、猝滅劑濃度和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)之間的關(guān)系能用雙對(duì)數(shù)方程表示為：

式中：KA表示復(fù)合物形成的結(jié)合常數(shù)；n表示猝滅過(guò)程中的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.2.6 芫花素與α-葡萄糖苷酶相互作用力類(lèi)型的確定 靜電力、疏水作用力、范德華力和氫鍵等作用力能夠使酶與小分子或者生物大分子結(jié)合，從而形成復(fù)合物。Rahman等[20]研究表明不同的小分子藥物和生物大分子之間的主要作用力類(lèi)型也不盡相同。因此兩分子之間的主要作用力類(lèi)型可以根據(jù)兩者間相互作用的吉布斯自由能ΔG、焓變?chǔ)和熵變?chǔ)等熱力學(xué)參數(shù)來(lái)確定。相關(guān)計(jì)算如下：

式中：R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T1、T2分別為291、310 K；K1、K2分別291、310 K下的KA。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，圖表使用Origin 8.0繪制，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外α-葡萄糖苷酶的抑制活性

如圖1所示，芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著芫花素濃度的增加而明顯增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。在0.0625～0.75 mg/mL濃度范圍內(nèi)，芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。

圖1 芫花素和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of genkwanin and acarbose on αglucosidase

2.2 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型的動(dòng)力學(xué)方程見(jiàn)式（6），其動(dòng)力學(xué)特征主要為Km增大，Vmax不變，而由雙倒數(shù)圖可以得到Km和Vmax值，其中1/Vmax=縱軸截距，Km/Vmax=斜率[21]，如圖2所示，隨著芫花素質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)速率的倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)呈線性關(guān)系，三條線相交于縱軸，即Vmax基本不變；斜率隨著芫花素濃度的增加而增大，即Km逐漸增大，故可判定芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖2 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweave-Burk雙倒數(shù)圖Fig.2 Lineweaver-Burk plots of α-glucosidase inhibition by genkwanin

式中：V表示酶促反應(yīng)的速率，ΔA/min；Vmax表示酶促反應(yīng)的最大速率，ΔA/min；Km表示米氏常數(shù)，mol/L；[S]表示底物濃度，mg/mL。

2.3 熒光猝滅光譜分析

2.3.1 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用 圖3和圖4分別為溫度為291和310 K時(shí)，不同濃度的芫花素存在時(shí)，0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶的熒光光譜變化情況。由圖3和圖4可知，當(dāng)芫花素的濃度低于8.1185×10?4mol/L時(shí)，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度隨著芫花素濃度的增加而逐漸降低，說(shuō)明當(dāng)芫花素的濃度增加時(shí)，體系中α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生了規(guī)律性的猝滅[22]，因此從另一方面也證實(shí)了芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[23?24]。加入了不同濃度的芫花素后，α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)約為308 nm，不同濃度體系的最大發(fā)射峰都沒(méi)有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移[25]，這說(shuō)明了不同濃度的芫花素與α-葡萄糖苷酶在相互作用時(shí)，僅僅影響了能發(fā)生熒光猝滅的α-葡萄糖苷酶殘基的微環(huán)境，表明芫花素與α-葡萄糖苷酶之間可能無(wú)明顯的共價(jià)鍵生成，從而使其最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生明顯的位移[26]。

圖3 291 K時(shí)芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig.3 Effect of genkwanin on the fluorescence spectrum of αglucosidase at 291 K

圖4 310 K時(shí)芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig.4 Effect of genkwanin on the fluorescence spectrum of αglucosidase at 310 K

2.3.2 熒光猝滅機(jī)理的推斷 將不同濃度（2.0296×10?4、3.0443×10?4、4.0591×10?4、5.0739×10?4、6.0887×10?4、8.1185×10?4mol/L）的芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光F0/F?1作圖，由圖5可知，F(xiàn)0/F?1和芫花素的終濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。Stern-volmer方程見(jiàn)1.2.4中的式（2），其中直線的斜率即為猝滅常量Ksv，直線的斜率也為Kqτ0，熒光分子的平均壽命τ0為10?8s，根據(jù)Stern-volmer方程計(jì)算的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。由表1可知，當(dāng)溫度升高時(shí)，猝滅常數(shù)Ksv有減小的趨勢(shì)，由此可以判斷出在芫花素的作用下，α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅[16]。與此同時(shí)，291和310 K下對(duì)應(yīng)的猝滅過(guò)程中的速率常數(shù)Kq分別為5.630×1013和5.582×1013L/（mol·s），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生物分子的最大碰撞擴(kuò)散速率常數(shù)（2.0×1010L/（mol·s）），而文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)速率常數(shù)Kq大于最大碰撞擴(kuò)散速率常數(shù)時(shí)為靜態(tài)猝滅[27]，因此可以進(jìn)一步判定芫花素和α-葡萄糖苷酶形成了無(wú)熒光或者熒光信號(hào)較弱的復(fù)合物而導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅。

圖5 不同溫度下芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of α-glucosidase fluorescence quenching by genkwanin

表1 不同溫度下芫花素與α-葡萄糖苷酶作用的相關(guān)參數(shù)Table 1 Reaction kinetic parameters between genkwanin and α-glucosidase at different temperatures

2.3.3 芫花素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 在不同的溫度下，以芫花素的終濃度（2.0296×10?4、3.0443×10?4、4.0591×10?4、5.0739×10?4、6.0887×10?4、8.1185×10?4mol/L）對(duì)應(yīng)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的lg[Q]對(duì)lg（F0/F?1）做雙對(duì)數(shù)圖（如圖6），并進(jìn)行線性回歸，直線方程見(jiàn)1.2.5的式（3），其中斜率=結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，縱軸截距=lgKA，方程的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2，由表2可知，在溫度291和310 K時(shí)，芫花素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別約為2.8和2.2。同時(shí)，隨著溫度升高，芫花素與α-葡萄糖苷酶之間的結(jié)合常數(shù)KA值隨之減小，說(shuō)明溫度的升高不利于芫花素和α-葡萄糖苷酶之間所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。

圖6 芫花素與α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)圖Fig.6 Double logarithmic diagram of fluorescence quenching between genkwanin and α-glucosidase

表2 芫花素與α-葡萄糖苷酶作用雙對(duì)數(shù)方程參數(shù)Table 2 Double logarithmic equation parameters of genkwanin interacted with α-glucosidase

2.3.4 芫花素與α-葡萄糖苷酶相互作用力類(lèi)型 根據(jù)圖6求得291、310 K下的結(jié)合常數(shù)K1、K2以及通過(guò)方程可求得各項(xiàng)熱力學(xué)參數(shù)（結(jié)果見(jiàn)表3）。由表3可知在291、310 K下芫花素與α-葡萄糖苷酶的吉布斯自由能ΔG都為負(fù)數(shù)，說(shuō)明芫花素與α-葡萄糖苷酶復(fù)合物的形成是一個(gè)自發(fā)進(jìn)行的過(guò)程。焓變?chǔ)為負(fù)值，熵變?chǔ)為負(fù)值，說(shuō)明芫花素與α-葡萄糖苷酶之間所形成的復(fù)合物主要是通過(guò)氫鍵和范德華力相結(jié)合。

表3 芫花素與α-葡萄糖苷酶作用體系熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of genkwanin interacted with α-glucosidase

3 結(jié)論

本研究探討了芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，體外酶活抑制實(shí)驗(yàn)表明了芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用，抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，在0.0625～0.75 mg/mL之間，芫花素抑制α-葡萄糖苷酶較陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖更明顯。芫花素在氫鍵和范德華力為主要作用力下自發(fā)地與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行結(jié)合，在溫度291和310 K時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別約為2.8和2.2，該復(fù)合物的形成使α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅。

綜上所述，芫花素可以較好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有較大的應(yīng)用潛力，該研究期望為降糖功能性成分研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為功能性食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究提供參考依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)芫花素的水溶性較差，所以想要充分開(kāi)發(fā)利用芫花素，其生物利用度方面有待于進(jìn)一步探討。