黃怡芳，呂潔婷，陳綿綿，程昌勇,宋厚輝

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，簡稱單增李斯特菌)是一種人畜共患革蘭陽性菌，該菌適應(yīng)低溫、低pH、高鹽等應(yīng)激環(huán)境并通過被污染的食物如肉類、海鮮、乳制品和蔬菜水果等傳播給人類[1-3]。李斯特菌感染后可引起腸胃炎、敗血癥、腦膜炎及孕婦的流產(chǎn)，受感染患者的病死率高達(dá)30%[4-5]。因?yàn)閱卧隼钏固鼐母咧滤缆始叭蚍秶鷥?nèi)中毒性病例的頻發(fā)，所以預(yù)防李斯特菌病對(duì)于公共衛(wèi)生安全具有重大意義[6]。

作為一種胞內(nèi)寄生菌，單增李斯特菌有多個(gè)關(guān)鍵毒力因子參與感染細(xì)胞的過程。首先通過菌體蛋白內(nèi)化素A(InlA)和內(nèi)化素B(InlB)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)菌體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、侵襲[7]。細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞后被吞噬泡內(nèi)化，在hly基因編碼的李斯特菌溶血素O(LLO)和2種磷脂酶(PlcA和PlcB)的參與下，溶解吞噬泡的雙層膜結(jié)構(gòu)，從而逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)開始復(fù)制和增殖[8-9]。其中，PlcB(由lmo0250編碼)作為重要毒力蛋白之一，在單增李斯特菌感染、吞噬體逃逸、激發(fā)宿主機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。

單增李斯特菌在感染過程中能夠通過操縱相關(guān)信號(hào)分子通路或調(diào)控宿主相關(guān)蛋白來逃逸機(jī)體的免疫應(yīng)答[11-12]?；诖它c(diǎn)，本研究通過同源重組的方式構(gòu)建plcB基因缺失株及含plcB的酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，為篩選與毒力因子PlcB相互作用的宿主蛋白提供依據(jù)和工具，為進(jìn)一步深入了解李斯特菌逃逸宿主天然免疫的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞來源本試驗(yàn)用到的菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存，主要包括：單增李斯特菌EGD-e、大腸桿菌DH5α、溫度敏感性載體pKSV7、整合型穿梭載體pIMK2、小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、小鼠成纖維細(xì)胞(L929)等。LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌培養(yǎng)，BHI培養(yǎng)基用于李斯特菌培養(yǎng)，除特殊說明外，本試驗(yàn)菌株的培養(yǎng)條件均為37℃振蕩培養(yǎng)。試驗(yàn)涉及引物見表1。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.2 主要試劑酵母單缺添加劑(dropout supplement-Trp,SDO)、酵母顯色底物(X-alpha-Gal,X-α-Gal)和金擔(dān)子素A(aureobasidin A,Aba)均購于Clotech公司；0.003%的腺嘌呤硫酸鹽酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPDA)、LB培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基分別購于生工生物工程(上海)有限公司、Oxoid公司；胎牛血清(FBS)和杜爾培養(yǎng)基(DMEM)、KOD plus Neo PCR酶、限制性核酸內(nèi)切酶、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒分別購自Thermo Fisher Scientific、Toyobo、NEB、碧云天公司、上?；哿枭锟萍加邢薰竞吞旄萍加邢薰?。所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3plcB缺失株構(gòu)建

1.3.1ΔplcB重組缺失質(zhì)粒構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫下載plcB基因序列(Gene ID：987036)及其上下游基因序列，通過Snapgene軟件在plcB基因上下游各約500 bp處設(shè)計(jì)引物(ΔplcB-a/ΔplcB-b和ΔplcB-c/ΔplcB-d)，PCR擴(kuò)增同源臂序列。利用重疊PCR方法將上下游同源臂連接獲得用于同源重組的目的片段，將其克隆至pKSV7載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,測(cè)序成功后獲得重組質(zhì)粒pKSV7-PlcB。

1.3.2ΔplcB缺失株篩選和驗(yàn)證 將上述重組質(zhì)粒pKSV7-PlcB電轉(zhuǎn)入EGD-e感受態(tài)細(xì)胞中，通過溫度和氯霉素抗性雙重選擇壓力進(jìn)行同源重組克隆篩選，利用引物(ΔplcB-a-front/ΔplcB-d)對(duì)篩選出的重組克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證(缺失株應(yīng)比野生株小870 bp 左右)，最終經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證所缺失的基因序列與預(yù)期設(shè)計(jì)相符后得到ΔplcB缺失株，并通過Western blot(WB)驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平。

1.4 CΔplcB回補(bǔ)株構(gòu)建通過Biocyc查詢得知plcB與其他基因共用mpl啟動(dòng)子，通過Vector NTI軟件在mpl上游啟動(dòng)子區(qū)及plcB完整基因下游設(shè)計(jì)引物(CΔplcB-/CΔplcB-b和CΔplcB-c/CΔplcB-d)并擴(kuò)增序列，經(jīng)雙酶切連接等步驟將其克隆至單增李斯特菌整合型質(zhì)粒pIMK2，獲得重組質(zhì)粒pIMK2-PlcB，測(cè)序鑒定后，將重組質(zhì)粒用電擊方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)ΔplcB缺失株，構(gòu)建得到回補(bǔ)突變株，并通過WB驗(yàn)證表達(dá)水平。

1.5 胞內(nèi)增殖試驗(yàn)用單增李斯特菌野生株EGD-e以及ΔplcB基因缺失株和回補(bǔ)株感染RAW264.7(MOI=1∶5)，30 min后用10 mmol/L PBS(pH7.4)洗滌3次，加入預(yù)冷的二餾水裂解細(xì)胞，將細(xì)菌倍比稀釋至合適梯度，點(diǎn)板并放置37℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌感染RAW264.7細(xì)胞1 h后，加入50 mg/L慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)1 h以殺死胞外細(xì)菌，然后利用上述同樣方法裂解細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，此時(shí)記為2 h。加入5 mg/L慶大霉素后，分別于2,5,8 h收集細(xì)菌，點(diǎn)板計(jì)數(shù)，最后統(tǒng)計(jì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)并繪制折線圖。

1.6 空斑試驗(yàn)用單增李斯特菌野生株EGD-e、ΔplcB基因缺失株及回補(bǔ)突變株感染L929細(xì)胞(MOI=1∶2.5)，1 h后用10 mmol/L PBS(pH7.4)洗滌3次，加入50 mg/L慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)1 h以殺死胞外細(xì)菌，再用10 mmol/L PBS(pH7.4)洗滌3次后加入含終濃度為0.7% Agar、5 mg/L慶大霉素和含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基3 mL，凝固后倒置培養(yǎng)2 d，用4%甲醛固定，棄去瓊脂，用水洗凈殘余瓊脂后，用5%結(jié)晶紫染色，觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.7plcB酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒構(gòu)建通過Vector NTI軟件在plcB基因(去除plcB信號(hào)肽)上設(shè)計(jì)引物(plcB-BD-F/plcB-BD-R),PCR擴(kuò)增后將其克隆至pGBKT7-BD載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,測(cè)序成功后獲得重組質(zhì)粒pGBKT7-BD-PlcB。

1.8 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒自激活及毒性試驗(yàn)

1.8.1自激活檢測(cè)試驗(yàn) 將pGBKT7-BD-PlcB誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母菌株后，稀釋100倍后涂布在SDO培養(yǎng)基，含pGBKT7-BD空載體的Y2HGold酵母菌株為陰性對(duì)照，培養(yǎng)3 d后觀察并拍照。

1.8.2誘餌蛋白毒性試驗(yàn) 將pGBKT7-BD-PlcB誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母菌株后，調(diào)至相同D值，稀釋到合適梯度點(diǎn)板，觀察兩者菌落量及菌落大小差異。

1.9 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒蛋白表達(dá)將pGBKT7-BD-PlcB誘餌質(zhì)粒、pGBKT7-BD空載體、pGBKT7-53(陽性對(duì)照)、pGBKT7-lam(陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)化至酵母菌，在5 mL SDO液體培養(yǎng)基內(nèi)30℃振蕩過夜培養(yǎng)后，1∶100轉(zhuǎn)接至YPDA培養(yǎng)基，30℃搖至D600=0.4～0.6，4℃離心后棄上清，用Cracking buffer裂解液裂解菌液后，超聲破碎，離心后取上清用含β-巰基乙醇的Loading Buffer定量，用WB方法對(duì)樣品進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 ΔplcB及CΔplcB重組菌的構(gòu)建由圖1可知，用引物(ΔplcB-a/ΔplcB-b)擴(kuò)增獲得plcB上游同源臂(圖1A1)，用引物(ΔplcB-c/ΔplcB-d)擴(kuò)增獲得下游同源臂(圖1A2)。重疊PCR得1 012 bp目的片段(圖1A3)。電轉(zhuǎn)后的pKSV7-PlcB菌落在42℃同源重組后，用引物(plcB-a-front/plcB-d)擴(kuò)增菌落得到1 102 bp陽性片段(圖1B1,2)，EGD-e為陽性對(duì)照(圖1B3)。在30℃?zhèn)鞔齪KSV7質(zhì)粒后，挑單菌落分別在含氯霉素抗性BHI液體培養(yǎng)基和瓊脂平板上培養(yǎng)，2 d均不生長，證明pKSV7質(zhì)粒已丟失。

根據(jù)CΔplcB重組質(zhì)粒構(gòu)建方法，用引物(CΔplcB-a/CΔplcB-b和CΔplcB-c/CΔplcB-d)擴(kuò)增菌落獲得上游同源臂(圖1C1)和下游同源臂(圖1C2)。通過重疊PCR獲得1 012 bp目的片段。得到CΔplcB重組質(zhì)粒目的片段1 243 bp(圖1D1)。用引物(CΔplcB-a/CΔplcB-d)擴(kuò)增電轉(zhuǎn)入ΔplcB感受態(tài)的pIMK2-PlcB單菌落，得到陽性條帶1 243 bp(圖1E1～8)，以上均與預(yù)期條帶相符。經(jīng)測(cè)序及WB驗(yàn)證ΔplcB和CΔplcB蛋白表達(dá)水平(圖1F)，ΔplcB無法表達(dá)蛋白，CΔplcB可表達(dá)蛋白，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，得到ΔplcB缺失株和CΔplcB回補(bǔ)株。

A.ΔplcB重組質(zhì)粒構(gòu)建(M.DL2000 DNA Marker，1.plcB上游同源臂，2.plcB下游同源臂，3.plcB目的片段)；B.ΔplcB缺失株驗(yàn)證(1,2.ΔplcB PCR篩選，3.EGD-e陽性對(duì)照)；C,D.CΔplcB重組質(zhì)粒構(gòu)建(1.mpl啟動(dòng)子，2.plcB全長，3.CΔplcB目的片段)；E.CΔplcB回補(bǔ)突變株驗(yàn)證(1～8.CΔplcB PCR 驗(yàn)證)；F.WB鑒定ΔplcB及CΔplcB突變株

2.2 體外生長曲線測(cè)定及細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)繪制EGD-e、ΔplcB和CΔplcB在37℃培養(yǎng)條件下的生長曲線，結(jié)果顯示EGD-e、ΔplcB和CΔplcB的生長規(guī)律無明顯差異，表明缺失plcB基因并不影響李斯特菌正常的生長速率(圖2A)。EGD-e、ΔplcB和CΔplcB感染RAW264.7細(xì)胞后0.5,2.0 h，ΔplcB細(xì)菌感染量少于野生株及回補(bǔ)株；感染后5.0 h，ΔplcB數(shù)量相較與回補(bǔ)株差異顯著(P<0.05)且與野生株相比差異極顯著(P<0.01)，而回補(bǔ)株在巨噬細(xì)胞里的增殖能力得到部分恢復(fù)，表明缺失plcB基因減弱了細(xì)菌的胞內(nèi)增殖能力(圖2B)。

*示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001。下同

2.3 李斯特菌空斑試驗(yàn)用EGD-e、ΔplcB及CΔplcB感染L929細(xì)胞(MOI=1∶2.5)，ΔplcB的空斑大小相較于野生株和回補(bǔ)株差異極顯著(P<0.001)，且CΔplcB的空斑直徑與野生株相比無顯著差異(P<0.05)，缺失plcB基因后空斑形成能力減弱，表明ΔplcB降低了在細(xì)胞間的遷移能力(圖3A，B)。

圖3 EGD-e、ΔplcB和CΔplcB在L929細(xì)胞中遷移試驗(yàn)(A)及空斑直徑分析(B)

2.4 酵母雙雜交自激活、毒性試驗(yàn)及蛋白表達(dá)試驗(yàn)將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-BD-PlcB及空載體(陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞并涂布于各種缺陷培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，SDO均有白色菌落(圖4A1，4)，SDO/X-α-Gal均不變藍(lán)(圖4A2，5)，SDO/X-α-Gal/Aba(圖4A3，6)均不長菌，表明該質(zhì)粒未在酵母中發(fā)生自激活。稀釋菌落至合適梯度，在SDO固體培養(yǎng)基中點(diǎn)板驗(yàn)證，菌落數(shù)量及大小均無明顯差異(圖4B7，8)，表明該誘餌質(zhì)粒在酵母中無毒性。

將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-BD-PlcB的酵母感受態(tài)細(xì)胞接種至5 mL SDO液體培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后收集沉淀，用酵母裂解液裂解沉淀后，用Myc標(biāo)簽抗體對(duì)蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)質(zhì)粒pGBKT7-BD-PlcB的酵母能夠表達(dá)PlcB蛋白，蛋白大小為51.3 kDa(圖4C)。

圖4 誘餌質(zhì)粒的自激活(A)、毒性試驗(yàn)(B)、蛋白表達(dá)試驗(yàn)(C)

3 討論

磷脂酶PlcB由289個(gè)氨基酸構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域主要分為信號(hào)肽、前肽和成熟肽3部分。單增李斯特菌進(jìn)入宿主細(xì)胞被吞噬泡內(nèi)化后，菌體分泌磷脂酶PlcB后其信號(hào)肽將會(huì)被切除，在pH為酸性的吞噬泡中前肽被Mpl金屬蛋白酶(mpl基因編碼產(chǎn)物)切割加工從而激活，進(jìn)而幫助菌體逃逸吞噬體，在細(xì)胞間增殖擴(kuò)散[13-15]。研究表明，李斯特菌在Hep-2和HeLa細(xì)胞感染過程中缺失LLO后，PlcB的活性水平?jīng)Q定了吞噬泡的裂解效率；在Henle 407細(xì)胞中缺失LLO后，使PlcB高水平表達(dá)利于病原菌的胞間擴(kuò)散感染[16-18]。

由于在李斯特菌感染及介導(dǎo)宿主諸多生物學(xué)機(jī)制中LLO的研究較為成熟，而另一種重要毒力因子磷脂酶PlcB的感染生物學(xué)功能研究報(bào)道較少[19-22]，本研究構(gòu)建了PlcB缺失株及回補(bǔ)株，開展了該缺失株和回補(bǔ)株體外生存能力、在巨噬細(xì)胞RAW264.7中的增殖能力、在成纖維細(xì)胞L929間的遷移能力試驗(yàn)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了磷脂酶PlcB在李斯特菌胞內(nèi)感染和生存過程中發(fā)揮了重要作用，其功能主要是協(xié)助細(xì)菌逃逸吞噬體并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)增殖，本研究為進(jìn)一步完善單增李斯特菌逃逸宿主的細(xì)胞天然免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

酵母雙雜交系統(tǒng)是將2種蛋白基因構(gòu)建至酵母表達(dá)質(zhì)粒中并通過兩者相互作用激活下游轉(zhuǎn)錄因子來檢測(cè)2個(gè)蛋白之間直接作用的工具[23-24]。酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子可以分為2部分：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)，BD可以與啟動(dòng)子的上游激活序列(UAS)結(jié)合，AD則與RNA聚合酶結(jié)合來啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，兩者單獨(dú)作用時(shí)無法激活轉(zhuǎn)錄因子，只有同時(shí)存在才能發(fā)揮激活效應(yīng)[25-27]。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，誘餌蛋白與BD融合構(gòu)建誘餌重組蛋白質(zhì)粒，獵物蛋白與AD融合構(gòu)建獵物重組蛋白質(zhì)粒，將2種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，AD與BD在空間上無限接近，若此時(shí)激活了下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，表明2種蛋白能發(fā)生相互作用[28-30]。為探究磷脂酶PlcB在感染宿主細(xì)胞的過程中是否能與宿主蛋白相互作用從而影響菌體在細(xì)胞中增殖，本研究構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-BD-PlcB,該質(zhì)粒對(duì)酵母Y2HGold細(xì)胞無毒性、無自激活反應(yīng)且能穩(wěn)定表達(dá)蛋白，因此重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-BD-PlcB可用于酵母雙雜交文庫的篩選。本次試驗(yàn)為進(jìn)一步篩選與磷脂酶PlcB發(fā)生相互作用的宿主蛋白奠定了基礎(chǔ)。