賈紅豆

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生物技術(shù)中心，黑龍江 大慶163319)

乳腺炎是奶牛中最常見的傳染病之一。該病的特征是細(xì)菌和真菌感染引起的乳腺組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)下降，從而給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。此外，乳腺炎還存在治療費(fèi)用高昂和廣泛的流行等問題，嚴(yán)重影響患病奶牛的福利和健康[3]。牛乳腺上皮細(xì)胞是牛奶蛋白合成和分泌的主要部位，也是抵抗病原細(xì)菌的主要防線。一旦病原菌進(jìn)入乳房，就會(huì)誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，并且導(dǎo)致局部乳腺炎癥。牛乳腺炎最常見的致病性病原體是革蘭陰性菌大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌以及革蘭陽性菌無乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌[4]。革蘭陰性細(xì)菌釋放的脂多糖(LPS)被認(rèn)為是牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥的重要刺激因素[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的釋放[7]。反過來，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步加重了與乳腺炎有關(guān)的病理和炎癥反應(yīng)。多年以來，乳腺炎的治療主要采用抗生素治療，早期效果良好，但隨著時(shí)間的流逝，致病菌會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性和更多的藥物殘留，嚴(yán)重危及奶牛及人類健康。此外，疫苗的預(yù)防效果不理想，對乳腺炎的預(yù)防和治療也提出了更高的挑戰(zhàn)，因此，迫切需要尋找和開發(fā)治療奶牛乳腺炎的新藥物。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中藥對奶牛乳腺炎性具有明顯的治療效果，而且能避免藥物殘留等問題。因此，篩選出具有治療奶牛乳腺炎的中藥，并闡明其作用機(jī)理具有十分重要的臨床意義。茶多酚是綠茶提取物，含有許多生物學(xué)功能的關(guān)鍵成分，具有包括抗炎、抗氧化和抗癌等作用。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以通過抑制NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用[8]。目前，茶多酚對奶牛乳腺炎是否具有防治作用尚不清楚，本試驗(yàn)通過研究茶多酚對奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，并闡明其潛在的分子機(jī)制，為篩選治療奶牛乳腺炎的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑DMEM/F12培養(yǎng)基購自SIGMA(D8437-500ML)；CCK-8試劑盒購自Dojindo, Kumamoto(CK04)；IKKβ激酶活性檢測試劑盒購自GenMed Scientifics Inc.(GMS50162.4)；RNAiso Plus購自TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.(D9108A)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.(RR047A)；蛋白裂解液購自Beyotime Institute of Biotechnology(P0013)；BCA試劑盒法購自Applygen Technologies(P1511)；p-IκB α購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-271980)；IκBα購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-166588)；p65購自Santa Cruz Biotechnology(sc-8008)；β-actin購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-166748)；p-p65購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-47778)。

1.2 試驗(yàn)分組與處理使用混有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的條件下對奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)進(jìn)行培養(yǎng)。(1)對照組:MAC-T細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h。(2)LPS組:MAC-T細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，更換含有1 mg/L LPS無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。(3)茶多酚組:MAC-T細(xì)胞在含有茶多酚(50，100，200 mg/L)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；(4)茶多酚+LPS組：MAC-T細(xì)胞在含茶多酚(50，100，200 mg/L)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，更換含1 mg/L LPS的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。

1.3 細(xì)胞活力檢測使用CCK-8試劑盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)檢測細(xì)胞活力。將細(xì)胞10× 104個(gè)/mL接種于96孔板，細(xì)胞按照1.2處理后，添加CCK-8試劑孵育4 h，之后用酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific,Grand 79 Island,NY)測D450 nm值。

1.4 IKK-β活性測定MAC-T細(xì)胞經(jīng)處理后，IKK-β活性采用IKK-β激酶活性檢測試劑盒(GMS50162.4;GenMed Scientifics Inc.,Wilmington,DE)方法進(jìn)行檢測。

1.5 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCRMAC-T細(xì)胞經(jīng)處理后，利用RNAiso Plus(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.,Dalian,China)提取細(xì)胞中的RNA，隨后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后采用7500 real-time PCR系統(tǒng)檢測各目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)量。利用2-ΔΔCt計(jì)算目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 蛋白提取和Western blotMAC-T細(xì)胞經(jīng)處理后，使用蛋白裂解液(P0013,Beyotime Institute of Biotechnology,Jiangsu,China)提取總蛋白。采用BCA試劑盒法(P1511,Applygen Technologies,Beijing,China)檢測蛋白質(zhì)量濃度。使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，并電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，之后將PVDF膜與特異一抗(p-IκB-α，IκB-α，NF-κB，p-NF-κB和β-actin)及相應(yīng)的二抗孵育后檢測蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 茶多酚對MAC-T細(xì)胞活力的影響為了檢測茶多酚對MAC-T細(xì)胞是否毒性作用，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，50，100，200 mg/L茶多酚對MAC-T細(xì)胞的活力沒有顯著性影響(圖1)。后續(xù)試驗(yàn)選用無毒性影響的中劑量100 mg/L 茶多酚。

圖1 茶多酚對MAC-T細(xì)胞活力的影響

2.2 茶多酚對IKK-β活性的影響與對照組相比，LPS組細(xì)胞中IKK-β活性顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，茶多酚+LPS組中IKK-β活性顯著降低(P<0.05)(圖2)。

*示P<0.05，下同

2.3 茶多酚對p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB和NF-κB蛋白表達(dá)量的影響與對照組相比，LPS組細(xì)胞中p-IκB-α/IκB-α比值顯著升高(P<0.05)(圖3A，B)。與LPS組相比，茶多酚+LPS組中p-IκB-α/IκB-α比值顯著下降(P<0.05)(圖3A，B)。與p-IκB-α/IκB-α變化趨勢一致，LPS組細(xì)胞中p-NF-κB/NF-κB比值顯著高于對照組(P<0.05)(圖3A，C),而茶多酚+LPS組中p-NF-κB/NF-κB比值顯著低于LPS組(P<0.05)(圖3A，C)。

A.p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB和NF-κB蛋白條帶；B.p-IκB-α和IκB-α的比值；C.p-NF-κB和NF-κB的比值

2.4 茶多酚對TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)量的影響與對照組相比，LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，茶多酚+LPS組中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A.TNF-α mRNA表達(dá)量；B.IL-6 mRNA表達(dá)量；C.IL-1β mRNA表達(dá)量

3 討論

乳腺炎以乳腺組織損傷為特征，且促炎性細(xì)胞因子(主要是TNF-α、IL-6和IL-1β)水平升高。LPS是大腸桿菌的主要毒力因子，在奶牛乳腺炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，NF-κB是介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要信號(hào)通路[9]。通常情況下，抗生素是治療乳腺炎的主要藥物，但是由于耐藥性和殘留物導(dǎo)致牛奶質(zhì)量下降和產(chǎn)量下降。因此，尋求安全有效的抗炎藥物是緩解奶牛乳腺炎的重要方法。茶多酚是茶葉提取物，因其具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[8]，己被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和獸醫(yī)領(lǐng)域。本試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚可以通過抑制NF-κB通路降低TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生而保護(hù)奶牛乳腺上皮細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)的炎性損傷。

炎性細(xì)胞因子的過度分泌在奶牛乳腺炎的發(fā)病過程中具有關(guān)鍵作用。細(xì)胞因子作為細(xì)胞間化學(xué)信使參與調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可導(dǎo)致奶牛乳腺炎誘導(dǎo)TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量增加[11]。體外LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞也可以導(dǎo)致這些促炎細(xì)胞因子表達(dá)量上升[12-13]。因此，減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能是治療乳腺炎的有效策略。據(jù)報(bào)道，茶多酚可以降低大鼠心肌細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)量[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚預(yù)處理可以顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達(dá)量，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。

NF-κB蛋白是一種核轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白的激活在乳腺炎的發(fā)展中具有十分重要的作用[14-15]。當(dāng)細(xì)胞受到各種化學(xué)和機(jī)械信號(hào)刺激時(shí)，IKK-β被迅速激活，導(dǎo)致IκB-α磷酸化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解[16]，然后將NF-κB磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[17]。因此，抑制NF-κB的激活可能是治療乳腺炎的關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以降低心肌細(xì)胞中NF-κB的結(jié)合活性[8]，從而減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以減少LPS誘導(dǎo)的IKK-β的活性，并降低IκB-α和NF-κB的磷酸化水平，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。這些結(jié)果表明，茶多酚預(yù)處理可改善LPS誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活，這可能有助于緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚可通過抑制NF-κB通路的激活而緩解LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，說明茶多酚可能成為防治奶牛乳腺炎的藥物。