于成東，哈 卓，王 政，李 凱，李秋璇，孟 媛，李亭玉，于 桐，金 鑫*，魯會(huì)軍*，金寧一*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130122)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為二十面體對(duì)稱(chēng)、無(wú)囊膜的單股、閉合、環(huán)狀 DNA 病毒[1]。據(jù)報(bào)道，已鑒定出3種豬圓環(huán)病毒，其中包括PCV1、PCV2和PCV3。PCV1是由TISCHER等[1]在1974年于豬腎傳代細(xì)胞系PK-15中發(fā)現(xiàn)并分離，對(duì)豬群沒(méi)有致病性；PCV2最早是由ELLIS等[2]在1991年于加拿大發(fā)現(xiàn)的，對(duì)豬群有較強(qiáng)的致病性，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原；PCV3是2016年美國(guó)科研人員通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)，從患有皮炎與腎病綜合征(PDNS)和繁殖障礙的母豬及流產(chǎn)胎兒中鑒定出的豬圓環(huán)病毒[3]。

2019年，中國(guó)學(xué)者從湖南省患有嚴(yán)重臨床癥狀的豬中鑒定出了一種新型圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)4型病毒(PCV4)。PCV4基因組全長(zhǎng)1 770 bp，與水貂圓環(huán)病毒的同源性最高。對(duì)PCV4的2個(gè)主要基因進(jìn)行了分析，其中長(zhǎng)度為891 bp的ORF1主要編碼復(fù)制酶蛋白(Rep蛋白)；ORF2長(zhǎng)度為687 bp，編碼衣殼蛋白(Cap蛋白)[4]。Cap蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，含有多個(gè)抗原表位，是病毒的重要免疫原區(qū)域。

據(jù)報(bào)道，中國(guó)湖南省、河南省與山西省均檢測(cè)出PCV4，但在意大利與西班牙并未檢測(cè)出該病毒[4-6]。PCV4病毒作為一種新發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒，由于發(fā)現(xiàn)時(shí)間較短，對(duì)其存在的時(shí)間、感染率、流行情況及致病性并不明確。豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病并稱(chēng)為世界三大豬病，每年對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]，而中國(guó)作為PCV4的首次檢出地，面臨著更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，對(duì)PCV4進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，建立有效的抗原、抗體檢測(cè)方法并對(duì)其進(jìn)行更加深刻的基礎(chǔ)研究，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)新發(fā)PCV的防控具有重要意義。Cap蛋白作為PCV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其在對(duì)PCV4的監(jiān)測(cè)與抗病毒方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)旨在構(gòu)建pET28a-PCV4-Cap原核表達(dá)載體，制備PCV4 Cap蛋白，為建立PCV4血清流行病學(xué)檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及主要試劑pET28a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Trans1 T1、FastPfu Fly DNA聚合酶、Blue PlusⅡ Protein Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)宿主菌BL21(DE3)PLySs購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ，T4DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；IPTG、DL2000 DNA Marker、λ-EcoT14Ⅰdigest Marker購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)AxyPrep公司。

1.2 基因、引物的設(shè)計(jì)與合成以本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增的內(nèi)蒙PCV4毒株P(guān)CV4/CN/NM1/2017(GenBank登錄號(hào)為：MT882410)的ORF2基因序列為參考，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行ORF2基因合成。應(yīng)用Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)去掉Cap蛋白N端信號(hào)肽特異性引物，分別在引物的上下游分別加入BamHⅠ與XhoⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物P1:5′-CGCGGATCCCACGCGCGTTTCATGC-GTGA-3′；下游引物P2:5′-CGGCTCGAGAACCCTGTTTCGGGTAGTTAA-3′。

1.3 目的基因的擴(kuò)增以合成的基因質(zhì)粒為模板，對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：ddH2O 13.5 μL；5× FastPfu Fly Buffer 5 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；；FastPfu Fly DNA聚合酶 0.5 μL；上游引物P1 1 μL(10 μmol/L)；下游引物P2 1 μL(10 μmol/L)；模板 2 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對(duì)目的片段切膠回收備用。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PCV4-Cap的構(gòu)建與鑒定將經(jīng)PCR擴(kuò)增后目的片段的膠回收產(chǎn)物與pET-28a載體，使用BamHⅠ與XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，膠回收雙酶切產(chǎn)物，將回收的Cap基因與pET-28a載體，使用T4連接酶于16℃條件下連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落，37℃ 震蕩培養(yǎng)12 h，進(jìn)行質(zhì)粒小量提取，對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-PCV4-Cap。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，接種于5 mL卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12 h。以1∶200的比例接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至D600達(dá)到0.5左右時(shí)，加入 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液進(jìn)行超聲處理。

1.6 重組Cap蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化

1.6.1最適表達(dá)溫度優(yōu)化 按照1∶200的比例將保存的重組菌接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)D600達(dá)到0.5左右時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于26，37℃條件下分別誘導(dǎo)6 h，收集菌液樣本，制備蛋白樣，使用12.5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.6.2最適IPTG誘導(dǎo)濃度 按照1∶200的比例將保存的重組菌接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)D600達(dá)到0.5左右時(shí)，加入終濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)8 h，收集菌液，制備蛋白樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，篩選IPTG最適誘導(dǎo)濃度。

1.6.3最佳誘導(dǎo)時(shí)間 按照1∶200的比例將保存的表達(dá)菌接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，220 r/min 震蕩培養(yǎng)至D600為0.5左右時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于37℃條件下分別誘導(dǎo)2，4，6，8，10，12 h，制備蛋白樣，使用12.5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.7 重組Cap蛋白的表達(dá)形式驗(yàn)證將誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行收集，5 000 r/inm離心10 min，棄去上清，將沉淀用PBS重懸后，低溫條件下進(jìn)行超聲破碎，將破碎后的菌液5000 r/min 離心10 min，收集上清，沉淀用與上清等量的PBS重懸，并取出適量樣本，加入5×SDS-PAGE上樣液，沸水煮10 min，而后通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.8 Western blot驗(yàn)證將1.5中所得誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白樣本，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，半干法恒壓15 V轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂乳室溫封閉2 h；TBST洗滌3次；使用1∶3 000稀釋的鼠源His抗體，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次；使用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗1∶5 000稀釋?zhuān)覝胤跤?5 min；TBST洗滌3次，每次10 min，而后進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1 PCV4Cap基因的擴(kuò)增使用設(shè)計(jì)的Cap基因特異性擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，最終得到567 bp的目的片段產(chǎn)物，與預(yù)期效果相同(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1,2.PCV4 Cap基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3.空白對(duì)照

2.2 pET28a-PCV4-Cap 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將擴(kuò)增的PCV4Cap基因片段與pET-28a載體連接，獲得重組質(zhì)粒后，將質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ與XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示載體與目的基因分別出現(xiàn)在預(yù)期位置，PCV4Cap基因成功連接至pET-28a載體(圖2)。同時(shí)將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，連接至載體的PCV4Cap基因，無(wú)堿基突變與缺失。

1.pET28a-PCV4-Cap重組質(zhì)粒;2.pET28a-PCV4-Cap質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;M1.DL2000 DNA Marker;M2.λ-EcoT14 I digest Marker

2.3 pET28a-PCV4-Cap重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.3.1優(yōu)化最適表達(dá)溫度 將重組菌分別置于26，37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示26℃幾乎沒(méi)有蛋白表達(dá)，pET28a-PCV4-Cap重組蛋白在37℃條件下，表達(dá)量更高，更適宜表達(dá)(圖3)。

M.Blue PlusⅡProtein Marker;1.pET-28a空載體蛋白;2.重組蛋白誘導(dǎo)前;3.26℃誘導(dǎo)pET28a-PCV4-Cap蛋白表達(dá);4.37℃誘導(dǎo)pET28a-PCV4-Cap蛋白表達(dá)

2.3.2優(yōu)化最佳IPTG誘導(dǎo)濃度 將重組菌于37℃條件下，分別加入終濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示在0.2 mmol/L 的IPTG條件下，pET28a-PCV4-Cap重組蛋白就已經(jīng)呈現(xiàn)很高的表達(dá)量，而后的幾個(gè)IPTG濃度梯度與0.2 mmol/L濃度IPTG誘導(dǎo)相比并無(wú)明顯變化。從節(jié)約成本的方面進(jìn)行考慮，故選取0.2 mmol/L的IPTG為最佳誘導(dǎo)濃度(圖4)。

M.Blue PlusⅡ Protein Marker;1.pET-28a空載體蛋白;2～7.誘導(dǎo)濃度分別為0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L

2.3.3優(yōu)化最佳誘導(dǎo)時(shí)間 于37℃、0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，分別在誘導(dǎo)后0，2，4，6，8，10，12 h，取不同時(shí)間段取等量菌液，制蛋白樣品，通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后6 h時(shí)蛋白的表達(dá)量最高(圖5)。

M.Blue PlusⅡ Protein Marker;1.pET-28a空載體蛋白;2～8.誘導(dǎo)時(shí)間分別為0,2,4,6,8,10,12 h

2.4 pET28a-PCV4-Cap重組蛋白表達(dá)形式驗(yàn)證收集誘導(dǎo)后菌體，5 000 r/min離心10 min后，用適量PBS重懸菌體沉淀，低溫條件下超聲，使用600 W 功率，超聲5 s，間歇7 s，總計(jì)15 min。4℃條件下，5 000 r/inm 離心10 min，沉淀用與上清等量PBS重懸，分別取上清與沉淀制備蛋白樣后，SDS-PAGE電泳顯示，pET28a-PCV4-Cap蛋白均以包涵體形式表達(dá)(圖6)。

M.Blue PlusⅡ Protein Marker;1.pET-28a空載體蛋白;2.pET28a-PCV4-Cap蛋白誘導(dǎo)前;3.pET28a-PCV4-Cap蛋白超聲上清;4.pET28a-PCV4-Cap蛋白超聲沉淀

2.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Western blot驗(yàn)證收取誘導(dǎo)后菌液，進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果顯示，重組蛋白在誘導(dǎo)前具有少量表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)后能夠出現(xiàn)大量表達(dá)，在約27 kDa處出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期結(jié)果相同(圖7)。

M.Blue PlusⅡ Protein Marker;1.pET-28a空載體蛋白;2.重組蛋白誘導(dǎo)前;3.重組蛋白誘導(dǎo)后

3 討論

2016年國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)更新的圓環(huán)病毒科分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)表明，圓環(huán)病毒屬內(nèi)物種劃分的標(biāo)準(zhǔn)是全基因組核苷酸同源性小于80%[8]。通過(guò)Cap和Rep蛋白完整的基因組及核苷酸序列分析，進(jìn)一步證明了PCV4屬于單獨(dú)的進(jìn)化枝，是圓環(huán)病毒屬中一個(gè)獨(dú)立基因型。通過(guò)對(duì)PCV4 Cap與Rep蛋白的氨基酸預(yù)測(cè)，顯示其與水貂圓環(huán)病毒的同源性最高，而與PCV1、PCV2、PCV3的氨基酸同源性低于50%[4]。PCV1的非致病性與PCV2的致病性已經(jīng)充分被證實(shí)，在有呼吸疾病和腹瀉豬中，PCV3檢出率和病毒滴度都較高，預(yù)示PCV3與這些臨床疾病的出現(xiàn)有一定的相關(guān)性，且PCV3能夠在健康的動(dòng)物中檢測(cè)出來(lái)[9]。PCV4既可以單獨(dú)檢測(cè)，也可以在同時(shí)感染了PRRSV或PCV2的豬體內(nèi)被檢測(cè)出來(lái)。大多數(shù)被檢測(cè)的豬都呈現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，包括呼吸系統(tǒng)疾病、腸炎和豬皮炎與腎病綜合征。但是，PCV4 DNA也已在健康豬中檢測(cè)出來(lái)[4]。在2019年中國(guó)學(xué)者通過(guò)感染性克隆，研究了PCV3的致病性，但至今為止也沒(méi)有可以在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定傳代的PCV3毒株被分離出來(lái)。

到目前為止，PCV4的存在時(shí)間、感染率、流行情況及致病性并不明確，而Cap蛋白作為PCV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的感染與復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用，所以對(duì)PCV4 Cap蛋白展開(kāi)研究，對(duì)接下來(lái)PCV2、PCV3與PCV4的Cap蛋白之間是否可以提供交叉保護(hù)，通過(guò)PCV4 Cap蛋白的表達(dá)，建立PCV4抗體水平的檢測(cè)方法，都具有重大意義。

原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)今研究較多的，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，而目前原核表達(dá)系統(tǒng)研究最為透徹，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是外源基因表達(dá)的首選，但是表達(dá)的外源目的蛋白大多為包涵體[10]。原核表達(dá)系統(tǒng)具有試驗(yàn)成本較低、周期短、轉(zhuǎn)化率高且能夠獲得大量目的蛋白的優(yōu)點(diǎn)[11]，所以本試驗(yàn)選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)pET28a-PCV4-Cap重組蛋白進(jìn)行表達(dá)，主要以包涵體的形式表達(dá)出約為27 kDa的重組蛋白，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，加入終濃度0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h為最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件，重組蛋白表達(dá)量最高。

本試驗(yàn)通過(guò)成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)pET28a-PCV4-Cap重組蛋白，為PCV4病毒Cap蛋白的深入研究與PCV4單克隆及多克隆抗體的制備及血清學(xué)特異性檢測(cè)方法的建立提供了依據(jù)。