李紅敏 方 容 鄒 琴

武漢市第四醫(yī)院消化內(nèi)科1(430030) 檢驗(yàn)科2

背景：胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，miR-21可調(diào)節(jié)磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。目的：探討miR-21靶向調(diào)控PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。方法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞分為miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)miR-21和PTEN mRNA和蛋白表達(dá)，螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系。將胃癌SGC-7901細(xì)胞分為空白對(duì)照組、NC組、miR-21組、PTEN組和miR-21+PTEN組，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Ki-67、PCNA、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PTEN、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)。建立裸鼠成瘤模型，檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-21對(duì)移植瘤體積和質(zhì)量的影響。結(jié)果：MiR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)。與NC組相比，miR-21組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移率升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)，Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，PTEN、cleaved caspase-3表達(dá)下降(P<0.05)；PTEN組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移率下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，PTEN和cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移率升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)，Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，PTEN、cleaved caspase-3表達(dá)下降(P<0.05)。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-21可增加裸鼠移植瘤的體積和質(zhì)量(P<0.05)。結(jié)論：MiR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡。

胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，早期主要表現(xiàn)為非特異性消化道癥狀，隨疾病發(fā)展表現(xiàn)為疼痛、體質(zhì)量減輕、貧血、惡病質(zhì)等，預(yù)后較差[1]。目前，胃癌的治療主要采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后化療的方式，但術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。微RNA-21(miR-21)是miRNA家族的成員，參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程，近年研究顯示，miR-21在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常高表達(dá)[3-4]。既往有研究[5]顯示，miR-21可靶向調(diào)控磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。PTEN是一種腫瘤抑制基因，在胃癌細(xì)胞中異常低表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。Pan等[7]的研究顯示，PTEN可抑制磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。但miR-21靶向PTEN調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)干擾miR-21，并分析miR-21靶向調(diào)控PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響，旨在探討miR-21靶向PTEN調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)制，從而為胃癌臨床治療和新靶向藥物的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只SPF級(jí)BALB/c裸鼠，雄性，鼠齡4～5周，體質(zhì)量(20±2) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于武漢市第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境室溫為22～25 ℃，模擬晝夜光照。所有操作均符合武漢市第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求，且本批次裸鼠腫瘤體積的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

2. 實(shí)驗(yàn)試劑：MiR-21 mimic(正義鏈：5’-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3’，反義鏈：5’-AAC AUC AGU CUG AUA AGC UAU U-3’)、miR-21 inhibitor(正義鏈：5’-UCA ACA UCA GUC UGA UAA GCU A-3’， 反義鏈：5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA GUA CAA-3’)、miRNA-NC(5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3’)、p-miR-Report質(zhì)粒、PRL-K載體、慢病毒過(guò)表達(dá)載體pLV-DNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640和胎牛血清購(gòu)自上海滬震生物科技有限公司；pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司；Transwell小室(包被Matrigel基底膜)購(gòu)自美國(guó)BD公司；Bcl-2、Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Bax、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；β-actin鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

3. 實(shí)驗(yàn)儀器：7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)；MF-ChemiBIS凝膠成像系統(tǒng)(DNR Bio-Imaging Systems)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人胃癌SGC-7901購(gòu)自美國(guó)典型物種保藏中心。將SGC-7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，應(yīng)用LipofectamineTM2000試劑分別轉(zhuǎn)染miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、無(wú)意義的mimic，空白對(duì)照組不做任何處理。

2. RT-PCR檢測(cè)miR-21和PTEN表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。MiR-21上游引物：5’-TGC GGT AGC TTA TCA GAC TGA TG-3’，下游：5’-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3’，以U6作為內(nèi)參，上游引物：5’-CCC GGA CAC GTG GGC TCC C-3’，下游：5’- CAC ATC CCT GGA CAC AGT CCT AG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。PTEN上游引物：5’-AGG GAG TCA CAA TTC CCA GTC-3’，下游：5’-AGG TTT CCT CTG GTC CTG GTA T-3’，以GAPDH為內(nèi)參，上游引物：5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’，下游：5’-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TGT C-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃變性10 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21和PTEN的相對(duì)表達(dá)水平。

3. 螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-21與PTEN的靶向關(guān)系：根據(jù)miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，miR-21可與PTEN mRNA的3’-UTR區(qū)420～437位點(diǎn)內(nèi)的部分堿基互補(bǔ)配對(duì)(圖1)，體外合成含該位點(diǎn)(PTEN 3’-UTR WT)及其位點(diǎn)突變體(PTEN 3’-UTR MUT)的pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒。將該質(zhì)粒、PRL-K載體混勻，與miR-21 mimic共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，mimic NC組轉(zhuǎn)染miR-NC，培養(yǎng)48 h后測(cè)定螢光素酶活性，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

圖1 MiR-21與PTEN mRNA的3’-UTR區(qū)堿基互補(bǔ)配對(duì)

4. 實(shí)驗(yàn)分組：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞分為空白對(duì)照組、NC組、miR-21組、PTEN組和miR-21+PTEN組。轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞，NC組轉(zhuǎn)染無(wú)意義mimic，miR-21組轉(zhuǎn)染miR-21 mimic，PTEN組轉(zhuǎn)染PTEN，miR-21+PTEN組轉(zhuǎn)染PTEN和miR-21 mimic。

5. CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種于96孔板；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm處各孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值)×100%。

6. TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于12孔板。培養(yǎng)48 h后，制作細(xì)胞涂片，進(jìn)行TUNEL染色，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

7. Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力：取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，取100 μL稀釋的細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/mL)加于Transwell上室(包被Matrigel基底膜)，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，進(jìn)行常規(guī)的固定、染色，觀察計(jì)數(shù)膜的下室面表面的細(xì)胞。

8. 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力：取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，接種于6孔板(1×105個(gè)/mL)。常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿孔底單層，采用無(wú)菌槍頭在皿底中間劃一直線，拍照，洗滌3次，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察培養(yǎng)前后劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞的遷移率。

9. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)：取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)PTEN(1∶1 000)、Ki-67(1∶500)、PCNA(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、cleaved caspase-3(1∶500)、Bax(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)蛋白表達(dá)，電化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)。

10. 裸鼠移植瘤模型建立和分組：20只SPF級(jí)裸鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和miR-21組，每組各10只。取NC組和miR-21組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，制成1×107個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，分別注射于對(duì)照組和miR-21組裸鼠右側(cè)腋下，建立裸鼠移植瘤模型，肉眼可見(jiàn)皮下成瘤，即為造模成功。每周測(cè)量一次小鼠腫瘤，計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積(cm3)=0.5×最小表徑2×最大表徑。5周末處死小鼠，切除腫瘤并稱重。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)移植瘤組織中PTEN蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、MiR-21抑制PTEN表達(dá)

空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組miR-21、PTEN mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)；與陰性對(duì)照組相比，miR-21 mimic組miR-21 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；miR-21 inhibitor組miR-21 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05；圖2)。由此可見(jiàn)，miR-21 mimic組和miR-21 inhibitor組轉(zhuǎn)染成功。

二、MiR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)

轉(zhuǎn)染PTEN 3’-UTR MUT質(zhì)粒后，miR-21 mimic組和mimic NC組PTEN螢光素酶活性無(wú)明顯差異；轉(zhuǎn)染PTEN 3’-UTR WT質(zhì)粒后，miR-21 mimic組PTEN螢光素酶活性顯著低于mimic NC組(P<0.05；圖3)。

三、MiR-21促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-21組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05)，PTEN組細(xì)胞增殖率顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05；圖4)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-21組細(xì)胞Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；PTEN組細(xì)胞Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細(xì)胞Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05；圖5)。

四、MiR-21抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡

TUNEL染色結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-21組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，PTEN組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05；圖6)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-21組細(xì)胞Bcl-2/Bax比例顯著升高(P<0.05)，cleaved caspase-3表達(dá)顯著下降(P<0.05)；PTEN組Bcl-2/Bax比例顯著下降(P<0.05)，cleaved caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組Bcl-2/Bax比例顯著升高(P<0.05)， cleaved caspase-3表達(dá)顯著下降(P<0.05；圖7)。

五、MiR-21促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲和遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-21組細(xì)胞侵襲率和遷移率顯著升高(P<0.05)，PTEN組細(xì)胞侵襲率和遷移率顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細(xì)胞侵襲率和遷移率顯著升高(P<0.05；圖8)。

六、MiR-21靶向PTEN促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901 PI3K/Akt的磷酸化

*與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

*與mimic NC組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-21組PTEN蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；PTEN組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組PTEN蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05；圖9)。

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

七、過(guò)表達(dá)miR-21促進(jìn)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)

裸鼠移植瘤結(jié)果顯示，造模5周末，miR-21組裸鼠移植瘤質(zhì)量顯著高于對(duì)照組[(3.67±0.82) g對(duì)(2.84±0.41) g，P<0.05]，PTEN蛋白表達(dá)明顯降低(0.27±0.06對(duì)0.56±0.10，P<0.05)。造模后第3、4、5周，miR-21組裸鼠移植瘤體積顯著大于對(duì)照組(P<0.05；圖10)。

討 論

MiRNA是一類(lèi)具有調(diào)控作用的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)靶mRNA降解或翻譯抑制，參與調(diào)控腫瘤的進(jìn)展。MiR-21參與調(diào)控多種腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為[8]。劉夢(mèng)涵等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)來(lái)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)白血病K562細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。但其在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。SGC-7901細(xì)胞是來(lái)源于胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的惡性程度較高的細(xì)胞，目前已被廣泛用于體外藥物藥效的研究，為臨床新藥開(kāi)發(fā)和研究提供支持[10]。本研究對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-21與PTEN之間的靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-21可在蛋白質(zhì)水平上負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，但對(duì)PTEN mRNA水平無(wú)明顯影響，提示miR-21可能通過(guò)抑制PTEN的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，靶向負(fù)調(diào)控PTEN。PTEN是一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[11]。多項(xiàng)研究顯示，PTEN可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體多條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[12-13]。本研究中，PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性，miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN蛋白表達(dá)，促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞中Ki-67和PCNA表達(dá)，miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN的抑制作用，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞Ki-67和PCNA表達(dá)。Ki-67和PCNA均為細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，其水平隨著細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程而變化，可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性[14]，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，調(diào)控增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與對(duì)照組比較，P<0.05

本研究中，PTEN過(guò)表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞Bcl-2/Bax比例，促進(jìn)cleaved caspase-3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax是一組調(diào)控線粒體膜通透性的蛋白，一旦細(xì)胞接收到外部信號(hào)刺激時(shí)，Bax會(huì)轉(zhuǎn)位至線粒體細(xì)胞膜，激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化的caspase-3可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[15-16]。陳華等[17]的研究顯示，PTEN可調(diào)控胃癌細(xì)胞的有絲分裂周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞凋亡。PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Wu等[18]的研究顯示，PTEN可調(diào)節(jié)下游Akt/mTOR表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

有研究表明PTEN可阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制多種腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[19]。PI3K/Akt信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等多種病理生理過(guò)程，是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路[20]。PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性可使質(zhì)膜的磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化，抑制PI3K的磷酸化，阻斷下游Akt的磷酸化，進(jìn)而阻斷下游激酶的活性[21]。本研究結(jié)果顯示，PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化，miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞PI3K和Akt磷酸化的抑制作用，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化。Wang等[22]的研究顯示，PTEN可抑制胃癌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化，參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡。但本研究?jī)H初步探討了miR-21靶向負(fù)調(diào)控PTEN對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響，后期將進(jìn)一步分析miR-21在其他胃癌細(xì)胞中的作用。