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        MiR-21靶向調(diào)控PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響*

        2021-08-10 01:56:02李紅敏
        胃腸病學(xué) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:胃癌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

        李紅敏 方 容 鄒 琴

        武漢市第四醫(yī)院消化內(nèi)科1(430030) 檢驗(yàn)科2

        背景:胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,miR-21可調(diào)節(jié)磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)蛋白表達(dá),誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。目的:探討miR-21靶向調(diào)控PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。方法:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞分為miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)miR-21和PTEN mRNA和蛋白表達(dá),螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系。將胃癌SGC-7901細(xì)胞分為空白對(duì)照組、NC組、miR-21組、PTEN組和miR-21+PTEN組,以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Ki-67、PCNA、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PTEN、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)。建立裸鼠成瘤模型,檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-21對(duì)移植瘤體積和質(zhì)量的影響。結(jié)果:MiR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)。與NC組相比,miR-21組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移率升高(P<0.05),細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05),Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05),PTEN、cleaved caspase-3表達(dá)下降(P<0.05);PTEN組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移率下降(P<0.05),細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)下降(P<0.05),PTEN和cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移率升高(P<0.05),細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05),Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05),PTEN、cleaved caspase-3表達(dá)下降(P<0.05)。與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)miR-21可增加裸鼠移植瘤的體積和質(zhì)量(P<0.05)。結(jié)論:MiR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),激活PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,并抑制細(xì)胞凋亡。

        胃癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,早期主要表現(xiàn)為非特異性消化道癥狀,隨疾病發(fā)展表現(xiàn)為疼痛、體質(zhì)量減輕、貧血、惡病質(zhì)等,預(yù)后較差[1]。目前,胃癌的治療主要采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后化療的方式,但術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。微RNA-21(miR-21)是miRNA家族的成員,參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程,近年研究顯示,miR-21在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常高表達(dá)[3-4]。既往有研究[5]顯示,miR-21可靶向調(diào)控磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)的表達(dá),誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。PTEN是一種腫瘤抑制基因,在胃癌細(xì)胞中異常低表達(dá),可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。Pan等[7]的研究顯示,PTEN可抑制磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路的表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。但miR-21靶向PTEN調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)干擾miR-21,并分析miR-21靶向調(diào)控PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響,旨在探討miR-21靶向PTEN調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)制,從而為胃癌臨床治療和新靶向藥物的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

        材料與方法

        一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

        1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:20只SPF級(jí)BALB/c裸鼠,雄性,鼠齡4~5周,體質(zhì)量(20±2) g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于武漢市第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水,飼喂普通維持飼料,由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境室溫為22~25 ℃,模擬晝夜光照。所有操作均符合武漢市第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求,且本批次裸鼠腫瘤體積的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

        2. 實(shí)驗(yàn)試劑:MiR-21 mimic(正義鏈:5’-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3’,反義鏈:5’-AAC AUC AGU CUG AUA AGC UAU U-3’)、miR-21 inhibitor(正義鏈:5’-UCA ACA UCA GUC UGA UAA GCU A-3’, 反義鏈:5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA GUA CAA-3’)、miRNA-NC(5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3’)、p-miR-Report質(zhì)粒、PRL-K載體、慢病毒過(guò)表達(dá)載體pLV-DNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640和胎牛血清購(gòu)自上海滬震生物科技有限公司;pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司;螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司;Transwell小室(包被Matrigel基底膜)購(gòu)自美國(guó)BD公司;Bcl-2、Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Bax、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;β-actin鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

        3. 實(shí)驗(yàn)儀器:7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific);MF-ChemiBIS凝膠成像系統(tǒng)(DNR Bio-Imaging Systems)。

        二、實(shí)驗(yàn)方法

        1. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:人胃癌SGC-7901購(gòu)自美國(guó)典型物種保藏中心。將SGC-7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),隔天換液。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,應(yīng)用LipofectamineTM2000試劑分別轉(zhuǎn)染miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、無(wú)意義的mimic,空白對(duì)照組不做任何處理。

        2. RT-PCR檢測(cè)miR-21和PTEN表達(dá):Trizol法提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。MiR-21上游引物:5’-TGC GGT AGC TTA TCA GAC TGA TG-3’,下游:5’-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3’,以U6作為內(nèi)參,上游引物:5’-CCC GGA CAC GTG GGC TCC C-3’,下游:5’- CAC ATC CCT GGA CAC AGT CCT AG-3’。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)熱5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 min,共30個(gè)循環(huán)。PTEN上游引物:5’-AGG GAG TCA CAA TTC CCA GTC-3’,下游:5’-AGG TTT CCT CTG GTC CTG GTA T-3’,以GAPDH為內(nèi)參,上游引物:5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’,下游:5’-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TGT C-3’。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)熱5 min;95 ℃變性10 s,52 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 min,30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21和PTEN的相對(duì)表達(dá)水平。

        3. 螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-21與PTEN的靶向關(guān)系:根據(jù)miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件,miR-21可與PTEN mRNA的3’-UTR區(qū)420~437位點(diǎn)內(nèi)的部分堿基互補(bǔ)配對(duì)(圖1),體外合成含該位點(diǎn)(PTEN 3’-UTR WT)及其位點(diǎn)突變體(PTEN 3’-UTR MUT)的pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒。將該質(zhì)粒、PRL-K載體混勻,與miR-21 mimic共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞,mimic NC組轉(zhuǎn)染miR-NC,培養(yǎng)48 h后測(cè)定螢光素酶活性,步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

        圖1 MiR-21與PTEN mRNA的3’-UTR區(qū)堿基互補(bǔ)配對(duì)

        4. 實(shí)驗(yàn)分組:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞分為空白對(duì)照組、NC組、miR-21組、PTEN組和miR-21+PTEN組。轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞,NC組轉(zhuǎn)染無(wú)意義mimic,miR-21組轉(zhuǎn)染miR-21 mimic,PTEN組轉(zhuǎn)染PTEN,miR-21+PTEN組轉(zhuǎn)染PTEN和miR-21 mimic。

        5. CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,以1×106個(gè)/孔接種于96孔板;置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm處各孔的吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值)×100%。

        6. TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,接種于12孔板。培養(yǎng)48 h后,制作細(xì)胞涂片,進(jìn)行TUNEL染色,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

        7. Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力:取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,取100 μL稀釋的細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/mL)加于Transwell上室(包被Matrigel基底膜),上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基,37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室,進(jìn)行常規(guī)的固定、染色,觀察計(jì)數(shù)膜的下室面表面的細(xì)胞。

        8. 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力:取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,接種于6孔板(1×105個(gè)/mL)。常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿孔底單層,采用無(wú)菌槍頭在皿底中間劃一直線,拍照,洗滌3次,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,顯微鏡下觀察培養(yǎng)前后劃痕寬度,計(jì)算細(xì)胞的遷移率。

        9. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá):取各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,提取各組細(xì)胞總蛋白,以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)PTEN(1∶1 000)、Ki-67(1∶500)、PCNA(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、cleaved caspase-3(1∶500)、Bax(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)蛋白表達(dá),電化學(xué)發(fā)光法顯影,凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)。

        10. 裸鼠移植瘤模型建立和分組:20只SPF級(jí)裸鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對(duì)照組和miR-21組,每組各10只。取NC組和miR-21組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,制成1×107個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,分別注射于對(duì)照組和miR-21組裸鼠右側(cè)腋下,建立裸鼠移植瘤模型,肉眼可見(jiàn)皮下成瘤,即為造模成功。每周測(cè)量一次小鼠腫瘤,計(jì)算腫瘤體積,腫瘤體積(cm3)=0.5×最小表徑2×最大表徑。5周末處死小鼠,切除腫瘤并稱重。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)移植瘤組織中PTEN蛋白表達(dá)。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        結(jié) 果

        一、MiR-21抑制PTEN表達(dá)

        空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組miR-21、PTEN mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05);與陰性對(duì)照組相比,miR-21 mimic組miR-21 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05),PTEN蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);miR-21 inhibitor組miR-21 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05),PTEN蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05;圖2)。由此可見(jiàn),miR-21 mimic組和miR-21 inhibitor組轉(zhuǎn)染成功。

        二、MiR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)

        轉(zhuǎn)染PTEN 3’-UTR MUT質(zhì)粒后,miR-21 mimic組和mimic NC組PTEN螢光素酶活性無(wú)明顯差異;轉(zhuǎn)染PTEN 3’-UTR WT質(zhì)粒后,miR-21 mimic組PTEN螢光素酶活性顯著低于mimic NC組(P<0.05;圖3)。

        三、MiR-21促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖

        CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-21組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05),PTEN組細(xì)胞增殖率顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05;圖4)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-21組細(xì)胞Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);PTEN組細(xì)胞Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組細(xì)胞Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05;圖5)。

        四、MiR-21抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡

        TUNEL染色結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-21組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05),PTEN組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05;圖6)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-21組細(xì)胞Bcl-2/Bax比例顯著升高(P<0.05),cleaved caspase-3表達(dá)顯著下降(P<0.05);PTEN組Bcl-2/Bax比例顯著下降(P<0.05),cleaved caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組Bcl-2/Bax比例顯著升高(P<0.05), cleaved caspase-3表達(dá)顯著下降(P<0.05;圖7)。

        五、MiR-21促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲和遷移

        Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-21組細(xì)胞侵襲率和遷移率顯著升高(P<0.05),PTEN組細(xì)胞侵襲率和遷移率顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組細(xì)胞侵襲率和遷移率顯著升高(P<0.05;圖8)。

        六、MiR-21靶向PTEN促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901 PI3K/Akt的磷酸化

        *與陰性對(duì)照組比較,P<0.05

        *與mimic NC組比較,P<0.05

        *與NC組比較,P<0.05;#與PTEN組比較,P<0.05

        蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,與NC組相比,miR-21組PTEN蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);PTEN組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比,miR-21+PTEN組PTEN蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05;圖9)。

        *與NC組比較,P<0.05;#與PTEN組比較,P<0.05

        *與NC組比較,P<0.05;#與PTEN組比較,P<0.05

        *與NC組比較,P<0.05;#與PTEN組比較,P<0.05

        七、過(guò)表達(dá)miR-21促進(jìn)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)

        裸鼠移植瘤結(jié)果顯示,造模5周末,miR-21組裸鼠移植瘤質(zhì)量顯著高于對(duì)照組[(3.67±0.82) g對(duì)(2.84±0.41) g,P<0.05],PTEN蛋白表達(dá)明顯降低(0.27±0.06對(duì)0.56±0.10,P<0.05)。造模后第3、4、5周,miR-21組裸鼠移植瘤體積顯著大于對(duì)照組(P<0.05;圖10)。

        討 論

        MiRNA是一類(lèi)具有調(diào)控作用的非編碼RNA,可調(diào)節(jié)靶mRNA降解或翻譯抑制,參與調(diào)控腫瘤的進(jìn)展。MiR-21參與調(diào)控多種腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為[8]。劉夢(mèng)涵等[9]的研究發(fā)現(xiàn),miR-21可能通過(guò)負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)來(lái)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,調(diào)節(jié)白血病K562細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。但其在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。SGC-7901細(xì)胞是來(lái)源于胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的惡性程度較高的細(xì)胞,目前已被廣泛用于體外藥物藥效的研究,為臨床新藥開(kāi)發(fā)和研究提供支持[10]。本研究對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-21與PTEN之間的靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),miR-21可在蛋白質(zhì)水平上負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),但對(duì)PTEN mRNA水平無(wú)明顯影響,提示miR-21可能通過(guò)抑制PTEN的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程,靶向負(fù)調(diào)控PTEN。PTEN是一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因,在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[11]。多項(xiàng)研究顯示,PTEN可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體多條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[12-13]。本研究中,PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性,miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN蛋白表達(dá),促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn),PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞中Ki-67和PCNA表達(dá),miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN的抑制作用,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞Ki-67和PCNA表達(dá)。Ki-67和PCNA均為細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白,其水平隨著細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程而變化,可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性[14],提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),調(diào)控增殖相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

        *與NC組比較,P<0.05;#與PTEN組比較,P<0.05

        *與NC組比較,P<0.05;#與PTEN組比較,P<0.05

        *與對(duì)照組比較,P<0.05

        本研究中,PTEN過(guò)表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞Bcl-2/Bax比例,促進(jìn)cleaved caspase-3表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡;miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用,抑制胃癌細(xì)胞凋亡,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax是一組調(diào)控線粒體膜通透性的蛋白,一旦細(xì)胞接收到外部信號(hào)刺激時(shí),Bax會(huì)轉(zhuǎn)位至線粒體細(xì)胞膜,激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),活化的caspase-3可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[15-16]。陳華等[17]的研究顯示,PTEN可調(diào)控胃癌細(xì)胞的有絲分裂周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞凋亡。PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移,miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Wu等[18]的研究顯示,PTEN可調(diào)節(jié)下游Akt/mTOR表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

        有研究表明PTEN可阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路,抑制多種腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[19]。PI3K/Akt信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等多種病理生理過(guò)程,是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路[20]。PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性可使質(zhì)膜的磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化,抑制PI3K的磷酸化,阻斷下游Akt的磷酸化,進(jìn)而阻斷下游激酶的活性[21]。本研究結(jié)果顯示,PTEN過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化,miR-21和PTEN共同過(guò)表達(dá)可抵消PTEN對(duì)胃癌細(xì)胞PI3K和Akt磷酸化的抑制作用,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化。Wang等[22]的研究顯示,PTEN可抑制胃癌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化,參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡,提示miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),激活PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá),激活PI3K/Akt信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,抑制細(xì)胞凋亡。但本研究?jī)H初步探討了miR-21靶向負(fù)調(diào)控PTEN對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響,后期將進(jìn)一步分析miR-21在其他胃癌細(xì)胞中的作用。

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