張婷婷，王 蘋，張建偉

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

近年來，隨著對乳腺腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，通過RNA干擾在乳腺腫瘤治療中的應(yīng)用有了很大的進(jìn)步。研究發(fā)現(xiàn)，一些微小的干擾RNA對腫瘤細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、分化等過程有顯著的抑制作用［1］。而Let-7a就是一種微小RNA，能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子在RNA轉(zhuǎn)錄后起到調(diào)節(jié)作用，在許多腫瘤細(xì)胞的生長及分化中發(fā)揮重要作用。本文選擇乳腺增生模型大鼠為研究對象，以當(dāng)歸芍藥散加味方為治療組，通過實時定量PCR法檢測模型大鼠乳腺上皮細(xì)胞Let-7a基因的表達(dá)，以探討當(dāng)歸芍藥散加味方治療乳腺增生病可能的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物40只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，10周齡，體質(zhì)量（193.78±5.78）g，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，合格證號：2015000545959。

1.2 實驗藥物 當(dāng)歸芍藥散加味方方藥組成：當(dāng)歸15 g，芍藥15 g，川芎8 g，茯苓10 g，白術(shù)15 g，澤瀉10 g，浙貝母12 g，柴胡8 g，香附12 g，丹參15 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院中藥房提供。常規(guī)煎煮后減壓濃縮至所需濃度（含生藥1 g／mL），放置于冰箱儲存?zhèn)溆?。乳消Ⅲ膠囊由福建省第二人民醫(yī)院制劑科提供（院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號：閩藥制字Z05104028）。

1.3 實驗試劑 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份公司）；10%水合氯醛溶液、RNAiso plus［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］；焦碳酸二乙脂（DEPC）水（中國索萊寶科技有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］；Fast SYBR Green Master Mix（2×）（美國ABI公司）。

1.4 實驗儀器 生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；低速離心機(jī)［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）；7500 Real time-PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 將40只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組8只和實驗組32只。實驗組采用乳腺增生病動物模型經(jīng)典造模法，即雌、孕激素聯(lián)合序貫給藥法，首先在大鼠后外肢外側(cè)肌注苯甲酸雌二醇，劑量標(biāo)準(zhǔn)按體質(zhì)量0.5 mg／（kg·d），每日1次，左右交替進(jìn)行，連續(xù)肌注25 d；然后改用黃體酮繼續(xù)肌肉注射，劑量標(biāo)準(zhǔn)按體質(zhì)量5 mg／（kd·d），每日1次，連續(xù)5 d?？瞻捉M則用生理鹽水按照0.1 mL／只肌肉注射，每日1次，連續(xù)30 d。造模結(jié)束后，將實驗組隨機(jī)分為模型1組、模型2組、當(dāng)歸芍藥散加味方組、乳消Ⅲ膠囊組，每組各8只。隨后即刻處死模型1組，先用肉眼觀察乳腺組織的外表形態(tài)，然后用游標(biāo)卡尺檢測第二對乳房乳頭的高度、直徑，接著將第2對乳房完好剝離，用10%福爾馬林液固定，待實驗結(jié)束后做病理觀察、RT-qPCR及免疫組化檢測。

2.2 干預(yù) 雌、孕激素聯(lián)合給藥造模完成后，當(dāng)歸芍藥散加味方組按含生藥量1 g／（kg·d）予當(dāng)歸芍藥散加味方藥液灌胃；乳消Ⅲ膠囊組按0.7g／（kg·d）予乳消Ⅲ膠囊藥液灌胃；模型2組與空白組予等體積生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃30 d。實驗結(jié)束后以上32只大鼠無死亡、均存活。

2.3 取材 大鼠灌胃30 d后，禁食24 h。運用腹腔注射麻醉藥的方法，根據(jù)每公斤體質(zhì)量注射1 mL的10%水合氯醛后，處死大鼠，游標(biāo)卡尺測第2對乳頭高度和直徑，然后剝離大鼠第2對乳房，用肉眼觀察大鼠乳腺組織的外表、稱重；最后用10%福爾馬林溶液固定，待做病理學(xué)觀察、RT-qPCR檢測及免疫組化的檢測。

2.4 病理學(xué)觀察 常規(guī)取材乳腺組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋切片及HE染色之后，用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠乳腺組織切片的組織學(xué)變化。

2.5 RT-qPCR檢測乳腺組織Let-7a mRNA表達(dá)

提取乳腺組織的總RNA并進(jìn)行質(zhì)檢，按說明書要求進(jìn)行RT反應(yīng)：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，混勻后按37℃60 min，85℃5 s在PCR儀上進(jìn) 行反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，PCR引物F 0.8 μL，通用引物R 0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，RT溶液2 μL，RNase Free dH2O 6 μL，混勻后按95℃預(yù)變性30 s，95℃變性3 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)40次并建立溶解曲線。擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)在每次循環(huán)延伸處收集熒光信號，分析整理數(shù)據(jù)。

2.6 免疫組化法檢測p-ERK蛋白表達(dá) 采用免疫組化法S-P法檢測乳腺上皮組織p-ERK蛋白的表達(dá)。先切取部分大鼠乳腺組織進(jìn)行脫蠟水化，再加入20 g／mL的蛋白酶K消化20 min，接著用3%H2O2進(jìn)行阻斷，最后倒入p-ERK一抗過夜處理，按試劑盒步驟操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，干燥封片。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 5組大鼠乳頭直徑、高度比較 見表1。

表1 5組大鼠乳頭直徑、高度比較（±s）mm

表1 5組大鼠乳頭直徑、高度比較（±s）mm

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型2組比較，2）P＜0.01。

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3.2 5組大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)變化 空白組大鼠乳房未見到明顯的乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張，腺小葉和腺泡結(jié)構(gòu)均正常。模型1組和模型2組小葉、腺泡、導(dǎo)管的數(shù)量明顯增多，腺泡之間排列緊密甚至部分出現(xiàn)相互融合，腺泡腔增大，導(dǎo)管管腔擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞分泌物，導(dǎo)管上皮增生，間質(zhì)充血，水腫，小葉間及導(dǎo)管周圍纖維結(jié)締組織增生。乳消Ⅲ膠囊組少量的乳腺導(dǎo)管上皮增生但無明顯乳頭形成，腺泡上皮輕度增生但未充滿囊腔，未見囊泡。當(dāng)歸芍藥散加味方組接近空白組。見圖1。

圖1 5組大鼠乳腺組織HE染色圖（×100）

3.3 5組大鼠乳腺組織Let-7a mRNA表達(dá)比較見表2。

表2 5組大鼠乳腺組織Let-7a mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 5組大鼠乳腺組織Let-7a mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白照組比較，1）P＜0.05；與模型2組比較，2）P＜0.05；與乳消Ⅲ膠囊組比較，3）P＜0.05。

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3.4 5組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達(dá)比較 見表3、圖2。

圖2 5組大鼠乳腺組織免疫組化染色圖（×100）

表3 5組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 5組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白照組比較，1）P＜0.01；與模型2組比較，2）P＜0.01；與乳消Ⅲ膠囊組比較，3）P＜0.01。

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4 討 論

乳腺增生病是一種對激素依賴性很大的疾病，其中雌、孕激素的比例失衡是引發(fā)本病發(fā)生的關(guān)鍵。運用雌孕激素聯(lián)合造模的方法，因其重復(fù)性良好，穩(wěn)定可靠，又操作便捷，是目前動物實驗研究中最常用的造模方法［2］。本實驗即采用雌、孕激素聯(lián)合造模方法，同時也考慮大鼠乳腺組織在停止造模后是否存在自愈傾向，為此本研究設(shè)計了模型1組和模型2組，模型1組在停止造模后隨即處死，取下乳腺組織，與實驗結(jié)束后模型2組比較是否存在自愈傾向。本實驗結(jié)果顯示，各實驗組大鼠與空白組比較，大鼠乳頭直徑和乳頭高度均明顯增大（P＜0.01），光鏡下觀察各實驗組大鼠乳腺組織，均發(fā)生顯著的增生性改變。且模型1組和模型2組在乳頭直徑、乳頭高度及乳腺組織形態(tài)學(xué)方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明本實驗造模成功，且停止雌孕激素造模后，大鼠乳腺增生無自愈傾向。

Let-7a最早由JOHNSON等發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中出現(xiàn)了表達(dá)，他們通過實驗證實，Let-7a具有抑制肺癌腫瘤細(xì)胞生長的作用［3］。隨后AKAO等［4］在大腸癌實驗中也發(fā)現(xiàn)Let-7a的表達(dá)，并有抑制腸癌細(xì)胞 生 長 的 作 用，SAMPSON等［5］在 對 伯 基 特 淋 巴 瘤的實驗研究中也發(fā)現(xiàn)Let-7a具有抑制伯基特淋巴瘤生長的作用。同樣在乳腺癌的研究中，學(xué)者們運用miRNA芯片技術(shù)也證實Let-7a亦存在異常表達(dá)。另外，相關(guān)研究也表明Let-7家族類miRNAs都可能具有腫瘤抑制作用，是一種潛在的抑制癌基因家族，其中Let-7a／b／c這三個基因表達(dá)與乳腺癌預(yù)后 關(guān) 系 密 切［6］。張 碩 等［7］也 發(fā) 現(xiàn)，Let-7家 族 成 員Let-7c-5p能夠抑制乳腺癌中長鏈非編碼RNA（lncRNA）漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1），通過提高Let-7c-5p的表達(dá)會抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明Let-7c-5p的表達(dá)量具有抑癌作用。但目前相關(guān)研究中關(guān)于Let-7a對乳腺增生病的影響研究相對較少。本實驗結(jié)果顯示，各實驗組大鼠乳腺組織Let-7a基因表達(dá)量均較空白組明顯降低（P＜0.05），說明乳腺增生病發(fā)生與Let-7a基因表達(dá)下降有關(guān)；在治療組中，當(dāng)歸芍藥散加味方組和乳消Ⅲ膠囊組大鼠乳腺組織Let-7a基因表達(dá)量均較模型2組升高（P＜0.05），當(dāng)歸芍藥散加味方組大鼠Let-7a基因表達(dá)量較乳消Ⅲ膠囊組提高（P＜0.05），提示通過中藥可提高大鼠乳腺組織Let-7a基因的表達(dá)，降低乳腺上皮細(xì)胞增殖活躍性，改善大鼠乳腺組織的增生狀態(tài)，同時當(dāng)歸芍藥散加味方療效優(yōu)于乳消Ⅲ膠囊組。

ERK信號通路是目前已知與細(xì)胞生長、分化、增殖密切相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而p-ERK蛋白是ERK信號通路上的重要蛋白，其是ERK磷酸化后存在的活性表現(xiàn)形式。p-ERK蛋白可以干擾ERK信號通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期變化，進(jìn)一步影響細(xì)胞的正常增殖、分化及凋亡的過程。正常細(xì)胞的癌變過程與p-ERK蛋白干擾ERK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程出現(xiàn)異常有著因果聯(lián)系。當(dāng)p-ERK蛋白進(jìn)入到細(xì)胞核中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)時，激發(fā)癌細(xì)胞的活性，從而使得正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性［8］，當(dāng)p-ERK蛋白出現(xiàn)表達(dá)過度或者異常的時候，可加快細(xì)胞的增殖和分化。因此通過干預(yù)p-ERK蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，可以影響ERK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)一步對細(xì)胞周期起到調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，阻斷乳腺增生的發(fā)展及癌變的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，實驗組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達(dá)量均高于空白組，這表明當(dāng)p-ERK蛋白表達(dá)增強(qiáng)時可引發(fā)乳腺增生病的發(fā)生；模型2組的大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達(dá)量高于乳消Ⅲ膠囊組和當(dāng)歸芍藥散加味方組，當(dāng)歸芍藥散加味方組大鼠p-ERK蛋白表達(dá)量低于乳消Ⅲ膠囊組。提示通過中藥干預(yù)影響p-ERK蛋白激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，改善乳腺組織增生狀態(tài)，這對于防止乳腺增生的發(fā)展及癌前病變具有重要意義，且當(dāng)歸芍藥散加味方組療效優(yōu)于乳消Ⅲ膠囊組。

綜上，乳腺增生模型大鼠乳腺組織中出現(xiàn)Let-7a基因與p-ERK蛋白的異常表達(dá)，當(dāng)Let-7a基因出現(xiàn)低表達(dá)時，p-ERK蛋白則表現(xiàn)出高表達(dá)，說明乳腺增生病的發(fā)生與Let-7a和p-ERK的異常表達(dá)相關(guān)。當(dāng)歸芍藥散加味方可以減輕乳腺增生模型大鼠乳腺組織增生程度，其作用機(jī)理可能與促進(jìn)Let-7a基因表達(dá)、降低p-ERK表達(dá)，抑制乳腺組織細(xì)胞增殖的活性從而達(dá)到改善乳腺組織增生的狀態(tài)，實現(xiàn)治療乳腺增生病的目的。本次研究通過探討當(dāng)歸芍藥散加味方治療乳腺增生病可能的作用機(jī)理，為研發(fā)中藥制劑治療乳腺增生病提供一定的現(xiàn)實意義。