劉純，周星宇，楊世榕，李仲偉，賈瑩

貴州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，貴州 貴陽 550004

氟是自然界廣泛分布的元素之一，適宜量的氟對人體具有益處，它參與人體骨骼和牙齒的生長，但當人體氟含量超出正常值，則會造成氟蓄積甚至氟中毒。全球25 個國家，超過2 億人有氟中毒風險。氟中毒可對牙齒、骨骼、軟組織以及神經(jīng)系統(tǒng)等造成損害，影響人體美觀、生理功能甚至喪失正常生活能力［1-3］。氟對骨的生成與吸收具有雙向性特征：既可以加強成骨活動，造成骨硬化，又可促進骨吸收，導致骨質(zhì)疏松；但總體而言，主導作用是促進成骨活動增強［4］。氟暴露后，機體內(nèi)各類因子發(fā)揮作用，相應的信號通路發(fā)生改變，引起成骨細胞和破骨細胞增殖分化、活性和功能的改變，從而表現(xiàn)出不同的骨相損害。這一疾病表現(xiàn)受多條信號通路的多維調(diào)控，因此對氟中毒信號調(diào)控機制開展研究，對明確相關疾病的發(fā)病機制、制定相應防治措施至關重要。本文將對近年氟化物對骨組織在不同信號通路的影響及信號間串擾形成的網(wǎng)絡交互調(diào)控作用進行闡述。

1 氟對骨組織信號通路的影響

1.1 刺猬（hedgehog，Hh）信號通路

Hh 信號首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)。高等脊椎動物體內(nèi)編碼Hh 蛋白的基因有三種，分別是音速刺猬因子（sonic hedgehog，SHh）、沙漠刺猬因子（desert hedgehog，DHh）、印度刺猬因子（Indian hedgehog，IHh）。Hh 信號通路既參與軟骨祖細胞的定型、增殖與分化的調(diào)控，也參與成骨細胞分化，影響正常骨組織的形成［5］。Hh 信號通路的核心組成部分包括分泌型糖蛋白配體Hh、兩種主要的膜蛋白受體—即跨膜蛋白受體（patched，Ptch）和跨膜蛋白（smoothened，Smo）、鋅指轉錄因子（gliomaassociated oncogene homolog，Gli）及下游目的基因。當Ptch 與SHh 配體結合后，它對Smo 的抑制作用被解除。當Hh 缺乏［6］，Hh 配體不與其受體Ptch 結合時，Ptch 對Smo 起抑制作用。這時，Smo 下游全長的Gli 轉錄激活子受多種激酶作用而發(fā)生磷酸化，以羧基端被截短形式進入細胞核內(nèi)，被蛋白酶體剪切成截短的轉錄抑制子形式，抑制SHh靶基因轉錄。當Hh存在時［7］，Hh 與Ptch 相結合，Ptch 對Smo 抑制作用則解除。全長Gli 蛋白進入核內(nèi)，激活下游轉錄基因，促使軟骨細胞、成骨細胞增殖分化。由此可見，整個信號通路中，Hh 配體及Smo 所起到的是正調(diào)節(jié)作用，而Ptch 則發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，轉錄因子Gli 能夠反映Hh 信號通路活化的程度［8］。此外，近年發(fā)現(xiàn)，Hh還存在非經(jīng)典通路，包括：（1）由Ptch 啟動但不依賴Smo 蛋白信號通路，通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白（cell cycle protein，Cyclin）在細胞內(nèi)的定位發(fā)揮對細胞周期的調(diào)控作用；（2）依賴Smo 蛋白直接激活信號通路，可通過激活ras 同源家族成員A（ras homolog family member A，RhoA）調(diào)節(jié)多種細胞的肌動蛋白細胞骨架，進而調(diào)節(jié)細胞的運動和遷移；（3）不依賴Hh 配體、Ptch 以及Smo，由Gli 蛋白直接激活信號通路三種模式［9］。

研究表明，氟中毒大鼠模型多器官氟損傷的發(fā)生與Hh 信號通路表達改變相關。在氟中毒大鼠肝臟組織中，可以檢測到SHh和Gli1基因的mRNA 表達高于對照組，并且在大量肝臟實驗中均可發(fā)現(xiàn)以上相關蛋白的表達［10］。不僅肝臟，在軟骨組織中也有同樣表達，且隨染氟濃度改變而變化。鄧超男等［11］對大鼠進行染氟處理，同時加以腹腔注射Hh 信號通路特異性阻斷劑環(huán)巴胺，發(fā)現(xiàn)隨染氟濃度增加，大鼠軟骨組織中SHh、Smo、Gli1 表達逐漸增強，而注射阻斷劑的大鼠骨組織Gli1 表達則較單純?nèi)痉笫竺黠@降低，大鼠出現(xiàn)不同程度的軟骨骨化及細胞凋亡等關節(jié)軟骨損傷，其機制可能與Hh 信號通路蛋白表達改變及軟骨細胞凋亡有關。同樣的結果在成骨細胞培養(yǎng)過程中以氟化物和環(huán)巴胺進行干預的實驗中得以驗證［12］。以上實驗提示Hh信號通路可調(diào)控軟骨的增殖、分化，干預軟骨和骨的形成，而氟離子可通過調(diào)節(jié)SHh 和Gli等因子異常表達來調(diào)控Hh 信號通路，導致氟中毒的發(fā)生。

Rho激酶（rho-associated coiled-coil-forming kinases，ROCK）是小G 蛋白Rho 相關激酶，被認為是Rho/ROCK信號通路的最核心成員，使用氟化鈉能夠顯著增強大鼠股骨中ROCK-1 的基因和蛋白表達，表明Rho/ROCK參與了氟化鈉誘導的骨細胞凋亡［13］。在氟暴露的人群中，隨著氟含量的增加，Cyclin D1 的mRNA 轉錄和蛋白表達逐漸增加。經(jīng)氟化鈉處理的人成骨細胞中，Cyclin D1 的表達同樣增加，促進了氟誘導的成骨細胞活化［14］。因此，有理由推測，氟同樣可以通過Hh非經(jīng)典信號通路調(diào)控成骨細胞活化及凋亡，促進氟骨癥的發(fā)生。

1.2 Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）

Wnt 信號通路是一條保守信號傳導通路，由經(jīng)典及非經(jīng)典兩類通路組成，有19 個成員已被確認。經(jīng)典Wnt 信號通路為Wnt/β-catenin 途徑，調(diào)控干細胞的多能分化、器官的發(fā)育和再生，對胚胎骨骼的發(fā)育及出生后骨的生長具有至關重要的作用［15］。Wnt 是該信號通路的關鍵啟動因子，核心因子β-catenin 主要位于細胞膜，而在胞漿中游離量較少。缺乏Wnt 時，β-catenin 在支架蛋白、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）等形成的復合體的作用下被磷酸化，最后被泛素化降解。當Wnt 存在時，低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）、Wnt 和膜受體卷曲蛋白形成的復合體將GSK 從磷酸化β-catenin 轉移至LRP5/6，使得β-catenin 聚集，從而胞漿內(nèi)得以穩(wěn)定存在，然后進入胞核后，與T 細胞因子/淋巴增強因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）相互作用促進靶基因表達［16-17］。但在該通路的初始階段，分泌性糖蛋白1（dickkopf-related protein 1，Dkk1）能夠在細胞外就與Wnt蛋白輔助受體LRP5/6結合，從源頭上阻斷Wnt/β-catenin 通路。

有研究表明長時間暴露于高氟環(huán)境可導致Wnt通路的細胞外拮抗劑Dkk1 降低，Wnt/β-catenin 信號被激活，GSK-3β 活性降低，β-catenin 的表達增多，加速了骨基質(zhì)分泌成骨細胞的進程，證明了Wnt/β-catenin 信號可能調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和成熟［18-19］。Zeng 等［20］對196 名高氟地區(qū)暴露者進行采樣分析，發(fā)現(xiàn)隨著氟暴露量的增加，Wnt 信號抑制劑Dkk1 的含量逐漸降低，而GSK-3β、β-catenin 的濃度和成骨分化的重要生化指標Ⅰ型膠原A1 與骨堿性磷酸酶的濃度卻增加，同樣表明氟可以通過減少Wnt 信號抑制因子Dkk1 的表達來激活Wnt 信號，從而促進骨形成；但GSK-3β 在以上兩次實驗中出現(xiàn)截然相反的結果，猜測可能是信號通路中、下游的因子存在負反饋調(diào)節(jié)而導致的。Chu 等［21］、Zhan 等［22］的研究提供了體內(nèi)和體外證據(jù)，證明氟化物可誘導Wnt/β-catenin信號的異常激活，促進β-catenin 在細胞核內(nèi)的聚集，積累的β-catenin 進入細胞核并與LEF1 形成復合物，從而激活一系列靶基因的轉錄，增加小鼠松質(zhì)骨形成和Wnt3a、GSK-3β 和Runt 相關轉錄因子2（runtrelated transcription factor 2，Runx2）蛋白表達；當抑制β-catenin 時，氟誘導成骨同樣表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象，揭示了氟誘導成骨細胞異常激活的潛在機制，驗證了β-catenin 是介導成骨細胞活力和分化的中樞分子，其在細胞質(zhì)中的積累和核定位對Wnt/β-catenin 信號通路的激活至關重要。

1.3 Notch

Notch 通路是一條進化高度保守的信號通路，一種在間充質(zhì)/成骨細胞譜系中調(diào)節(jié)自我更新和分化的細胞間通信通路。哺乳動物中有4個同源受體和5個同源配體，其中同源受體是Notch1～4，都是Ⅰ型跨膜蛋白，均由胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD）、跨膜區(qū)和胞外區(qū)（Notch extracellular domain，NECD）組成。Notch同源配體（Delta/Serrate/LAG-2，DSL）都是Ⅰ型跨膜蛋白，分為Delta like與Jagged-1/2。Jagged-1是一種有效的骨誘導蛋白，可積極調(diào)節(jié)動物創(chuàng)傷后骨愈合。Notch 信號轉導無須第二信使和蛋白激酶的參與，可直接接收鄰近細胞的信號并傳到細胞核，激活相關轉錄因子的表達。當NICD 未釋放時，核結合蛋白（CBF1 suppressor of hairless-lag1，CSL）是一個轉錄抑制因子；當Notch 受體接收到相鄰細胞膜上的DSL 信號后，Notch 受到兩種連續(xù)的蛋白裂解影響，去整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）或腫瘤壞死因子-α轉換酶（TNF-α converting enzyme，TACE）釋放出NECD，然后γ 分泌酶釋放出NICD，NICD 進入胞核與CSL 蛋白形成復合物，將原來的“協(xié)同抑制復合物”轉換為“協(xié)同活化復合物”，形成活化復合物并驅(qū)動下游靶的轉錄［23］。

Notch 受體是細胞命運和功能的決定因素，調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞分化，并在骨骼發(fā)育和骨骼重塑中起著核心作用［24-25］。陳修文等［26］在大鼠飼氟6 個月后，取骨進行檢測，發(fā)現(xiàn)高氟組大鼠的Notch、Jagged-1 蛋白水平表達明顯呈下降表現(xiàn)，而且與染氟劑量呈相關性，推測過量氟會通過抑制Notch、Jagged-1 來增加成骨細胞的分化，從而表現(xiàn)出骨質(zhì)硬化。氟與Notch 通路關系的研究還處于空白區(qū)域較多的階段，有待學者進一步深入了解其在基因和蛋白質(zhì)水平的作用。

1.4 核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受體激活子（receptor activator of the nuclear factor-κB，RANK）/ NF-κB受體活化因子配體（NF-κB receptor activator ligand，RANKL）/骨保護素（osteoprotegerin recombinant protein，OPG）

RANK 是RANKL 的唯一受體，是腫瘤壞死因子受體家族中的成員，是一種I 型跨膜蛋白，RANK 通過與RANKL 結合發(fā)揮調(diào)節(jié)骨吸收的關鍵作用。OPG 作為一種分泌型糖蛋白，由成骨細胞分化，能夠以二聚體的形式競爭性結合RANKL，使RANKL 喪失與RANK 結合的功能性，抑制破骨細胞分化成熟，使骨代謝向著骨硬化方向發(fā)展，RANKL/OPG 濃度的比值調(diào)節(jié)破骨細胞的形成［27-28］。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和RANKL 對于啟動破骨細胞分化必不可少，在M-CSF 的介導下，RANKL結合在破骨細胞前體的受體RANK，從而啟動細胞內(nèi)的信號轉導，促進破骨細胞成熟與分化［29］。

RANK/RANKL/OPG 骨轉換軸被認為是骨改建過程中調(diào)解骨吸收的“終極通路”。孫秀娟等［30］建立大鼠氟中毒模型組中，M-CSF 明顯高于其他組，證明氟化物能夠促進骨吸收，但具體的機制沒有進行說明。也有學者研究報道，用環(huán)肽F可以干擾M-CSF和RANKL信號的共同影響因子原癌基因c-Fos，M-CSF誘導分化階段難以分化破骨細胞，但RANKL相較而言誘導較易［31］。將RANKL 的誘餌受體OPG基因敲除，小鼠的顳骨切片在光鏡下觀察，出現(xiàn)了局灶性高細胞區(qū)域，顯示出骨吸收和沉積，并且含有多核破骨細胞［32］。從分子層面來看，建立骨細胞-破骨細胞共同培養(yǎng)模型后，發(fā)現(xiàn)隨著氟濃度的增加，轉化生長因子β1 表達升高，OPG 競爭性抑制得到加強，從而抑制破骨細胞分化和成熟，骨吸收被減弱，導致氟骨癥的發(fā)生［33］。由此可見RANKL 才是誘導破骨細胞分化，促進骨吸收的關鍵因子，M-CSF 只是起階段性介導作用。在氟干預下M-CSF、RANKL對骨吸收的調(diào)控得到增強，而隨著氟濃度的增加，OPG的競爭性抑制逐步表現(xiàn)出優(yōu)勢。

1.5 甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）

PTH 是甲狀旁腺分泌的維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的激素，其分泌主要受血漿Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。PTH 主要與PTH受體（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）結合而發(fā)揮其生物功能，PTH I 型受體是II 型G 蛋白偶聯(lián)受體，在骨組織中，能夠表達PTH I型受體的細胞主要為成骨細胞系［34］。多項研究以證實，氟化物增加骨對PTH 作用的抵抗力，PTH 及其PTH I 型受體在氟骨癥中具有重要影響，成骨細胞和成骨細胞前體表面有PTH I 型受體，因此PTH 可以直接作用；而破骨細胞表面沒有相應受體，只能夠通過成骨細胞和骨細胞來進行間接作用［35］。氟中毒常繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進，當機體缺鈣時，PTH 分泌增多，氟化物增加骨骼對PTH 作用的抵抗力，可能降低降鈣素分泌，從而引發(fā)代償性PTH 活性［36-37］。PTH 的效應取決于細胞暴露在PTH 的周期性和劑量大?。洪g歇性低劑量給予PTH，可以促進成骨細胞分化和礦化，骨量得以增加；持續(xù)暴露于高劑量PTH 時，骨骼產(chǎn)生分解，骨吸收占主導［38］。PTH 對骨影響的作用機制已經(jīng)在臨床上得到應用，在骨質(zhì)疏松的治療中取得良好療效。

2 交互調(diào)控

信號的激活或抑制不是僅在其本身信號通路內(nèi)的分子中以線性方式完成的，而是多條信號通路成員或分子相串擾，形成龐大而復雜的效應網(wǎng)絡，以協(xié)調(diào)或拮抗的方式控制細胞內(nèi)的各種生物過程，交互調(diào)控（cross-talking），共同完成細胞生理功能［39］。

Hh 信號主要在軟骨膜和關節(jié)軟骨中表達，由于Wnt 信號也在軟骨成骨中具有重要意義，為了驗證兩者關系，研究人員檢測雙基因突變小鼠的Gli1等靶基因，證明了Hh 信號在Wnt/β-catenin 信號上游，并且經(jīng)過成骨細胞相關基因表達的檢測，證明了Wnt 在Hh 下游［5，40］。猜測可能是由于Hh 通路中Wnt 抑制因子-1（Wnt inhibitory factor 1，Wif-1）的出現(xiàn)，抑制了Wnt/β-catenin 通路，使β-catenin 降解無法聚集，靶基因無法完成轉錄［41］。從骨形成角度來看，膜內(nèi)骨化過程，Hh 信號作用并不明顯；軟骨內(nèi)骨化過程則Hh 信號水平較高，可控制軟骨細胞肥大和成骨細胞分化，當Hh 和Wnt/β-catenin 維持在一定水平，骨可以正常形成［42］。這也能夠體現(xiàn)出兩條信號通路存在串擾，但骨形成涉及的通路甚是復雜，此次實驗的結果究竟是以何種形式所造成，并無具體結果加以說明。實驗數(shù)據(jù)表明Wnt 家族成員Wnt 能夠通過促進OPG 的產(chǎn)生來抑制破骨細胞的生成，而Wnt 信號抑制因子Dkk 的過表達降低了Wnt、β-catenin 蛋白的水平，從而促進了RANKL/OPG 值和成骨細胞的凋亡；Dkk 通過影響成骨細胞增殖，成骨細胞前分化為成熟成骨細胞和新的骨基質(zhì)形成來調(diào)節(jié)骨形成過程［43-44］。

Sun 等［45］建立了PTH基因敲除小鼠和野生型小鼠股骨骨折模型，利用實時聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)免疫印跡等技術檢測內(nèi)源性PTH 的功能和機制，發(fā)現(xiàn)PTH 敲除組的RANKLmRNA 表達均低于野生組，說明其對破骨細胞的影響是間接產(chǎn)生的，PTH 是通過磷脂酰肌醇3 激酶/活化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B/轉錄活化子（phosphoinositide-3-kinase/serine-threonine proteinkinase B/signal transducer and activator of transcription 5，PI3K/AKT/STAT5）信號通路來促進成骨細胞分泌RANKL，從而影響破骨細胞的數(shù)量和功能，這一系列試驗共同說明PTH 是促進骨吸收的。Yu 等［46］的研究支持這一結論。PTH 被證明是硬骨素（sclerosteosis，SOST）的抑制劑，在經(jīng)典Wnt 通路的上游，SOST 可以搶占LRP5/6 復合體的結合位點，直接阻斷這一通路［47］。由此可說明Wnt 經(jīng)典通路在PTH和Hh 信號通路中都在下游起作用［48］。將氟和PTH 作為共同處理因素，與單獨氟處理相比，PTH 和氟共同處理的分組SOST 和Dkk1 得到了反向增加表達，同時在這項研究中，RANKL 蛋白的表達水平上調(diào)，降低了OPG 表達，這導致RANKL/OPG 值顯著增加［26，49］。染氟之后，PTH 相關蛋白等相關分子的表達顯著增加，PTHrP 對IHh表達的抑制作用增強，從而使IHh表達下降，抑制了IHh/PTHrP反饋環(huán)，抑制了軟骨內(nèi)骨化［50］。

有研究顯示，RANKL在破骨細胞分化過程中誘導了Jagged-1和Notch2表達。而Notch2 NICD的異位表達促使活化T-細胞核因子1活性增強，OPG/RANKL比例降低，誘導的破骨細胞生成。這些結果表明Notch 信號在OPG/RANKL 的下游，活化T 細胞核因子是RANKL刺激Notch2-NF-κB 復合體的直接作用靶點，Notch 通過逐級信號協(xié)調(diào)NF-κB 間接激活破骨細胞［51］。但是該實驗中有許多矛盾之處，需要進一步的研究來確定Notch 信號傳導的分子機制在破骨細胞分化中的作用。Notch 抑制Wnt 活性，即使β-catenin 水平的正?；膊蛔阋酝耆孓D此作用，這是因為Notch 胞內(nèi)域NICD 誘導了多毛/增強子-1（hairy/enhancer of split-1，HES-1）的表達增強。而HES-1 RNA 干擾實驗表明，HES-1 在NICD 對Wnt/β-catenin 信號傳導的抑制作用中起著核心作用，HES-1 的參與抑制了Wnt/β-catenin 信號傳導和成骨細胞生成［52］。在Rallis 等［53］的研究中，觀察到Jagged-1 表達和Gli1 表達之間具有統(tǒng)計學意義的相關性，由于Gli1 是Hh 通路激活的主要效應分子，這種關聯(lián)可能表明兩條通路之間可能存在串話，這一概念需要進一步研究。Notch 信號可能在上游功能控制Hh 反應，在斑馬魚脊髓模式形成過程的實驗中，抑制Hh 信號不影響Notch 通路活性，但Notch 信號的激活導致Hh 通路活性增強；對Notch 信號的抑制消除了脊髓中Hh 依賴和Hh 獨立的Gli1 表達，Notch信號允許神經(jīng)祖細胞通過Gli轉錄調(diào)控和Gli蛋白維持對Hh 信號做出反應［54］。但這一表現(xiàn)主要存在于脊髓模式，在成骨細胞中是否也是同樣機制還未可知。圖1為氟對Hh、Wnt/β-catenin、Notch、RANKL/OPG和PTH 通路的影響及通路之間交互調(diào)控網(wǎng)絡的示意圖。

圖1 氟對Hh、Wnt/β-catenin、Notch、RANKL/OPG和PTH通路的影響及通路之間交互調(diào)控網(wǎng)絡的示意圖Figure 1 A schematic picture of the effects of fluoride on Hh,Wnt/β-catenin,Notch,RANKL/OPG,and PTH signaling pathways and the cross-talks among the pathways

3 展望

Hh、Wnt/β-catenin、Notch、RANKL/OPG 以及PTH代表著調(diào)節(jié)生長發(fā)育的基本途徑。迄今為止，對于這些信號通路在慢性氟中毒誘導骨轉換的分子機制主要都集中在信號通路的線性研究上。然而，許多研究表明，各信號通路的發(fā)生并非孤立的開展，而是相互串擾，交互調(diào)控。骨的形成或吸收，依靠信號通路間的協(xié)同效應、競爭性抑制或者反饋調(diào)節(jié)，通過專注氟骨損害相關信號通路網(wǎng)絡連接點的分子，深入剖析它們之間的聯(lián)系，了解氟中毒的發(fā)病機制，有可能開發(fā)出更高效更具有特異性的靶向治療策略。