徐映如，張慧敏，朱圓圓

1.上海市虹口區(qū)疾病預(yù)防控制中心理化科，上海 200082

2.上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所，上海 200336

砷污染往往是空氣、水和食物系統(tǒng)的多重污染，吸入式暴露是砷暴露的主要途徑之一［1-3］，但國內(nèi)外對空氣砷的研究較少，監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)模糊，無明確的經(jīng)呼吸道砷暴露參考濃度［3-4］?？諝馍榇蟛糠指患谛×筋w粒物PM2.5中［5］，可在大氣中長時間停留，且無法被呼吸器官屏障阻礙，容易進(jìn)入肺部通過肺泡吸收，從某種角度來看，與水和食物相比，空氣中的砷可能更具危害性。據(jù)臨床報告，吸入式砷暴露可導(dǎo)致多種呼吸道疾病及皮疹、神經(jīng)炎、肝炎和心肌炎等多方面損害［6-8］。國內(nèi)外不少地區(qū)已在檢測中發(fā)現(xiàn)空氣中砷濃度超標(biāo)［9-10］，以上海為例，2016—2017年空氣總砷暴露量（6.92×10-7mg·kg-1·d-1）在全國各大城市中是明顯偏高的［11］；2017—2018年空氣PM10中總砷質(zhì)量濃度（簡稱濃度）達(dá)67.09 ng·m-3，為GB 3095—2012《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》限值（6 ng·m-3）的10倍有余［12］。

除濃度外，砷的毒性及生物可及性主要與其形態(tài)有關(guān)［13-14］。環(huán)境砷主要有無機(jī)形態(tài)的亞砷酸鹽［As（Ⅲ）］和砷酸鹽［As(Ⅴ)］，及有機(jī)形態(tài)的一甲基胂酸（monomethylarsonate，MMA）、二甲基胂酸（dimethylarsinate，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）和砷膽堿（arsenocholine，AsC）等。一般認(rèn)為毒性順序依次為As（Ⅲ）＞As(Ⅴ)＞MMA＞DMA＞AsC＞AsB，無機(jī)砷毒性遠(yuǎn)大于有機(jī)砷，AsB和AsC對人體無毒［10］。但一些有機(jī)砷的遺傳毒性遠(yuǎn)強(qiáng)于無機(jī)砷［15］。從癥狀來看，As（Ⅲ）的慢性吸入可能損害細(xì)胞免疫并損害多器官［16］，As(Ⅴ)可能影響胚胎發(fā)生和胎兒發(fā)育［17］，MMA 則可能引起高血壓［18］。因此，要準(zhǔn)確反映空氣砷暴露的遠(yuǎn)期健康效應(yīng)，有必要建立不同形態(tài)砷含量的檢測方法。

現(xiàn)有的空氣形態(tài)砷檢測方法，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）與氫化物原子熒光光譜聯(lián)用［19-21］、反相色譜柱與電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）聯(lián)用［22］，存在靈敏度不高、分離度不佳、難以檢出有機(jī)砷、三價形態(tài)砷易被氧化、檢測結(jié)果不準(zhǔn)確且操作復(fù)雜的問題。本研究通過超聲提取法，采用HPLC-ICP-MS 聯(lián)用［23-24］，并選用離子色譜柱，建立PM2.5中As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA 和AsB 5種形態(tài)砷濃度的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

8900 電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀、1200 高效液相色譜儀（美國Agilent），Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore），SK2210LHC 超聲波清洗器（中國上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），MS200多管渦旋混勻儀（中國杭州瑞誠儀器有限公司），TH-1000CⅡ大流量采樣器（中國武漢天虹），石英濾膜（20.3 cm×25.4 cm，美國PALL），S400pH計、XS204電子天平（瑞士Mettler Toledo）。

碳酸銨（色譜純，美國Sigma），硝酸（HPLC級，美國Fisher），氨水（優(yōu)級純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），亞砷酸鹽溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［（1.011±0.016）μmol·g-1］、砷酸鹽溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［（0.233±0.005）μmol·g-1］、一甲基胂酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［（0.335±0.011）μmol·g-1］、二甲基胂酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［（0.706±0.024）μmol·g-1］和砷甜菜堿溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［（0.518±0.015）μmol·g-1］均購自中國計量科學(xué)研究院。砷標(biāo)準(zhǔn)使用溶液用超純水逐級稀釋配制成1.00 mg·L-1工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 采樣區(qū)域和樣品采集

1.2.1 采樣點采樣點位于上海市虹口區(qū)北外灘社區(qū)一建筑物三樓屋頂（121.517236°E，31.261601°N），采樣儀器距地面高度約為11 m。附近包括一條主干道（東面約400 m）、住宅區(qū)（南面和北面）、辦公樓（西面）。

1.2.2 樣品采集采樣時間從2019年1月持續(xù)到2019年12月，覆蓋全年四季。樣品共84 份，包括春（3—5月）、夏（6—8月）、秋（9—11月）、冬季（1—2月和12月）各21份。每個月10—16日進(jìn)行連續(xù)24 h的PM2.5采樣，采用大流量采樣器，采樣流量為800 L·min-1。采樣前將石英濾膜在600℃下烘烤4 h 以消除有機(jī)物干擾，并在干燥器中平衡24 h。采樣后將濾膜置于溫度（25±1）℃、相對濕度（50±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h 后稱重，-18℃環(huán)境下儲存，30 d內(nèi)完成檢測［25-26］。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ） 1.00 mg·L-1工作溶液，用0.15 mol·L-1硝酸逐級稀釋，配制成濃度分別為0.0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、100.0 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.2 樣品前處理（1）總砷測定前處理。按重量稱取1/8樣品濾膜，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL的0.15 mol·L-1硝酸，70℃水浴超聲浸提3 h 后，取出放至室溫，充分振蕩后，將離心管置于低速離心機(jī)上4 500 r·min-1，離心半徑10 cm，離心5 min，并用0.45 μm濾頭過濾。準(zhǔn)確移取2 mL 濾液，超純水定容至5 mL 待測。同時做空白對照實驗。

（2）5 種形態(tài)砷測定的前處理。按重量稱取1/8 樣品濾膜，置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL 提取液，1 500 r·min-1（渦旋半徑4 mm）渦旋1 min，使提取液與濾膜充分混合，室溫超聲水浴后取出。分別比較3 種提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）和4 種超聲時間（15、30、60、120 min）對不同形態(tài)砷提取效率的影響，對比添加50 mg抗壞血酸對As（Ⅲ）穩(wěn)定性的影響，優(yōu)化提取條件。充分振蕩后，將提取液過0.22 μm水相濾膜，濾液置于2 mL進(jìn)樣瓶中測定。同時做空白對照實驗。

1.3.3 儀器條件HPLC工作參數(shù)：（1）考察2種色譜柱［Agilent Zorbax SB-Aq 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）配合Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18 4-Pack 預(yù)柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm），Dionex IonPac AS19陰離子交換柱（4 mm×250 mm，5 μm）配合Dionex IonPac AG19預(yù)柱（4 mm×50 mm，5 μm）］的分離度和靈敏度。（2）基于碳酸銨體系進(jìn)行流動相優(yōu)化［27］，配置4種濃度（20、30、40、50 mmol·L-1碳酸銨，pH=9.7）、4種pH值（pH=9.3、9.5、9.7、9.9）的碳酸銨水溶液（30 mmol·L-1）對流動相進(jìn)行考察。等度洗脫，流動相流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積10 μL。

ICP-MS 工作參數(shù)：分析模式為全定量分析，射頻功率1 550 W，載氣為高純氬氣，等離子體氣體流速15.00 L·min-1，輔助氣體流速1.00 L·min-1，載氣流速、補(bǔ)償氣體流速1.00 L·min-1，霧化室溫度2℃。采集模式，采集時間10.5 min，積分時間單位為s，掃描類型為單桿/串接，采用ICP-MS中的He模式測定。

1.3.4 檢出限和定量限以標(biāo)準(zhǔn)狀況下采樣體積為1 056 m3，定容體積為20 mL，信噪比為3 時對應(yīng)的濃度作為方法檢出限，以信噪比為10 對應(yīng)的濃度為方法定量限。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度以加標(biāo)回收率來考察準(zhǔn)確度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）來表示精密度。一張濾膜按重量等分成8 份，其中6 份進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，剩余2 份作為空白對照。PM2.5中總砷濃度的范圍為0.400～8.311 ng·m-3，因此在砷形態(tài)分析實驗中分別添加低、中、高三種不同濃度水平（0.38、1.52、7.58 ng·m-3）的AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行前處理，測定樣品加標(biāo)前后5種形態(tài)砷的濃度，計算加標(biāo)回收率（n=6）。

1.4 質(zhì)量控制

采樣器每次使用前要進(jìn)行流量校準(zhǔn)。每批樣品采樣，應(yīng)設(shè)空白對照。測定PM2.5中不同形態(tài)砷時，同時進(jìn)行空白和空白濾膜加標(biāo)的測定。每批樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r＞0.999 0。

2 結(jié)果

2.1 提取條件的確定

應(yīng)用不同提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）配制5 種形態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)溶液，隨著超聲時間的變長（15、30、60、120 min），除了As（Ⅲ）濃度有明顯變化，其他4 種形態(tài)砷［AsB、DMA、MMA、As（Ⅴ）］濃度基本在（10.00±0.20）μg·L-1之間。純水中As（Ⅲ）氧化率最高、提取效率最低，10 μg·L-1As（Ⅲ）經(jīng)超聲120 min后，大約35% As（Ⅲ）被氧化成As（Ⅴ）。

采用純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.15 mol·L-1硝酸+50 mg抗壞血酸作為提取液分別超聲30 min，As（Ⅲ）氧化比例分別為7.6%、2.4%、0.3%，可見酸性環(huán)境更有利于提取穩(wěn)定。在3 種提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）的As（Ⅲ）標(biāo)準(zhǔn)溶液中各加入50 mg抗壞血酸，經(jīng)過超聲15、30、60、120 min 后，As（Ⅲ）濃度幾乎沒有變化，且改善了As（Ⅴ）的峰形，提高了檢測的靈敏度。在空白濾膜上加標(biāo)，As（Ⅲ）同樣沒有出現(xiàn)氧化現(xiàn)象，且提取液為0.15 mol·L-1硝酸的回收率最高（96.6%～101.3%），表明添加抗壞血酸能有效抑制As（Ⅲ）氧化成As（Ⅴ）。選用0.15 mol·L-1硝酸，超聲提取30 min 時，提取效率最高，對比結(jié)果見圖1。

圖 1 不同提取液濃度和時間條件下的提取效率Figure 1 Extraction efficiency under different extract concentration and time conditions

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 色譜柱選擇對比發(fā)現(xiàn)Agilent Zorbax SB-Aq體系分離速度快，但分離度和峰形不佳；Dionex IonPac AS19體系優(yōu)化后可實現(xiàn)5種形態(tài)砷的有效分離，見圖2。

圖2 兩種色譜柱對5種形態(tài)砷的分離效果Figure 2 Separation effects of two chromatographic columns on five arsenic species

2.2.2 流動相濃度和pH 選擇4 種不同濃度流動相（20、30、40、50 mmol·L-1碳酸銨水溶液，pH=9.7）色譜圖如圖3所示，隨著流動相碳酸銨的濃度增加，5種形態(tài)砷中MMA和As（Ⅴ）的保留時間縮短，而AsB、DMA和As（Ⅲ）的保留時間基本不變。當(dāng)流動相為20 mmol·L-1碳酸銨時，分析時間過長且峰形不佳；當(dāng)流動相濃度超過30 mmol·L-1碳酸銨時，AsB、DMA、As（Ⅲ）無法實現(xiàn)基線分離。故選擇30 mmol·L-1碳酸銨為最佳濃度。

圖3 不同濃度碳酸銨分離5種形態(tài)砷的HPLC-ICP-MS色譜圖Figure 3 Separation effects of different concentrations of ammonium carbonate on five arsenic species by HPLC-ICP-MS

4種不同pH條件下（pH=9.3、9.5、9.7、9.9）碳酸銨色譜圖如圖4所示?？梢姡S著流動相pH增加，MMA和As（Ⅴ） 保留時間縮短，而AsB、DMA、As（Ⅲ）的保留時間基本不變。當(dāng)pH值為9.3時，DMA和As（Ⅲ）無法實現(xiàn)基線分離，且出峰時間比較長。選取pH=9.5 為最優(yōu)條件（圖4），出峰時間為10 min，分離效果和峰形最好。

圖4 不同pH碳酸銨分離5種形態(tài)砷的HPLC-ICP-MS色譜圖Figure 4 Separation effects of different pH values of ammonium carbonate on five arsenic species by HPLC-ICP-MS

2.3 方法線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限和定量限

在0.50～100 μg·L-1的線性范圍內(nèi)，所得回歸方程均呈較好的線性關(guān)系，r＞0.999。5種形態(tài)砷的方法檢出限為0.008～0.017 ng·m-3，定量限為0.027～0.058 ng·m-3，結(jié)果見表1。

表1 五種形態(tài)砷的方法線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Linear ranges,limits of detection,and limits of quantitation for five arsenic species

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的結(jié)果見表2。五種形態(tài)砷的加標(biāo)回收率在91.4%～107.9%之間，RSD 在1.68%～6.28%之間，說明該方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足分析測試的要求。

表2 方法的準(zhǔn)確度和精密度Table 2 Accuracy and precision of the method

2.5 實際空氣PM2.5樣品測定

測定84 份PM2.5樣品中總砷和各形態(tài)砷的含量，其中某實際樣品的檢測結(jié)果如圖5。提取率（不同形態(tài)砷含量/總砷含量）范圍81.8%～112.8%，各形態(tài)砷濃度及總砷濃度按季節(jié)分別統(tǒng)計結(jié)果如表3所示，測定PM2.5樣品中，5 種形態(tài)砷按含量從高到低，依次為As（Ⅴ）、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA，以As（Ⅴ）無機(jī)砷為主，約占總砷的81.1%～95.7%之間。As（Ⅴ）濃度秋、冬季略高，春、夏季相近；As（Ⅲ）濃度冬季略高，夏季明顯低于其他季節(jié)，可能是夏季高溫導(dǎo)致大氣中As（Ⅲ）的氧化比較完全；AsB則呈現(xiàn)不同規(guī)律，夏季最高，秋季次之，春、冬較低；DMA 夏、秋高于春、冬；MMA全年都很低。此外，總砷年中位數(shù)（1.790 ng·m-3）未超標(biāo)（6 ng·m-3），但秋、冬季個別月份有超標(biāo)（10月份最大值為8.331 ng·m-3）。

圖5 某份PM2.5樣品砷含量色譜圖Figure 5 Chromatogram of arsenic concentration of a PM2.5 sample

表3 PM2.5樣品中5種形態(tài)砷濃度及總砷濃度分別檢測結(jié)果Table 3 Concentrations of five arsenic species and total arsenic in PM2.5 samples 單位（Unit）：ng·m-3

3 討論

本研究采用HPLC-ICP-MS 方法，通過對提取液、超聲時間、色譜柱和流動相條件的優(yōu)化，建立新的同時測定空氣PM2.5中AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）5種形態(tài)砷含量的檢測分析方法。5種形態(tài)砷的方法檢出限為0.008～0.017 ng·m-3，定量限為0.027～0.058 ng·m-3，實際樣品加標(biāo)回收率為91.4%～107.9%，RSD 為1.68%～6.28%。與現(xiàn)有方法相比，本方法大大降低檢出限，靈敏度高、形態(tài)穩(wěn)定、耗樣量少，且前處理簡單、分析速度快、重復(fù)性好，兼具適用性與實用性，可為后續(xù)開展空氣砷暴露的遠(yuǎn)期健康效應(yīng)評估提供技術(shù)支持。

不同形態(tài)砷超聲提取液主要有硝酸、純水、甲醇-水等［28-29］，環(huán)境空氣中重金屬提取劑通常為硝酸。但硝酸有一定氧化性，部分形態(tài)砷穩(wěn)定性較差，如As（Ⅲ）容易被氧化為As（Ⅴ），為保證提取前后砷形態(tài)不發(fā)生變化，本研究調(diào)節(jié)硝酸濃度并對比3 種提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）的提取效率。此外還需采取一些措施來進(jìn)一步減緩提取過程中As（Ⅲ）的氧化速度，如溶液除氧、低溫提取、添加抗氧化劑、溶液充氮保護(hù)等，最終采取操作比較便捷的添加抗氧化劑（抗壞血酸）方法，并基于土壤、底泥的水樣中使用的方法［30］進(jìn)行優(yōu)化，減少抗氧化劑用量至50 mg。

本研究考察了純水和酸性提取液的提取效果。純水提取時As（Ⅲ）很大一部分轉(zhuǎn)化為As（Ⅴ），而硝酸+抗壞血酸提取時砷形態(tài)穩(wěn)定，As（Ⅲ）幾乎無轉(zhuǎn)化。純水中As（Ⅲ）的氧化原因不明確，可能是提取液中的氧化性物質(zhì)，如Fe（Ⅲ）或溶解氧［30-31］，在超聲環(huán)境下強(qiáng)化了氧化性；硝酸提取液中As（Ⅲ）氧化程度低于純水提取液，可能與As 的溶解性及離子形態(tài)有關(guān)，在pH=5～7 時，一方面As 溶解性對pH 相對敏感并隨pH升高呈現(xiàn)先降后升的特性，另一方面H3AsO3更多轉(zhuǎn)化為H2A-與HA2-離子形式，由于懸浮物帶負(fù)電荷，對陰離子排斥，且在一定的有機(jī)質(zhì)濃度下和酸性條件時金屬陽離子橋絡(luò)合機(jī)制更易發(fā)生［32］，因此酸性條件下As（Ⅲ）更易被懸浮物質(zhì)吸附從而阻礙氧化［33-34］。最終選用0.15 mol·L-1硝酸加50 mg 抗壞血酸作為提取液，達(dá)到了理想的提取效率和穩(wěn)定性。

色譜柱和流動相的選擇是分離多種目標(biāo)物的關(guān)鍵，反相色譜柱受填充材料限制，在選定pH 條件下（pH=4.3）As（Ⅲ）以H3AsO3形式存在，不與離子對試劑發(fā)生相互作用，色譜柱上不保留；而選用陰離子交換柱（樹脂毛細(xì)管柱）堿性洗脫，各形態(tài)砷均呈現(xiàn)離子形態(tài)，可與離子基團(tuán)交換保留。考慮各形態(tài)砷的解離常數(shù)［As（Ⅲ）（9.22），As（Ⅴ）（2.3、6.8、11.6），MMA（2.6、8.2），DMA（6.2），AsB（2.2）］，酸性條件下As（Ⅲ）無法電離，堿性條件下As（Ⅲ）以H2A-形式、As（Ⅴ）以HA2-或A3-形式、MMA 以HA-或A2-形式、DMA 以A-形式存在，兩性離子AsB 以陰離子形式存在，各形態(tài)可完全電離；隨pH 升高，更強(qiáng)的洗脫強(qiáng)度有利于縮短保留時間，但pH ≥10 的堿性條件不利于DMA 和As（Ⅲ）形態(tài)的分離。因此選擇在pH=9.3～9.7 區(qū)間進(jìn)行酸堿度微調(diào)，最終選用pH=9.5的碳酸銨水溶液（30 mmol·L-1）為流動相。

上海市虹口區(qū)空氣PM2.5中砷元素檢測分析結(jié)果表明，PM2.5中總砷濃度為0.400～8.331 ng·m-3（見表3）；PM2.5中砷主要以As（Ⅴ）無機(jī)砷形式存在，約占總砷的81.1%～95.7%，含有少量的AsB、As（Ⅲ）、DMA和MMA，5種形態(tài)砷的總和占總砷含量的81.8%～112.8%。檢測中首次發(fā)現(xiàn)了AsB是上海市空氣PM2.5中砷的次要形態(tài)，濃度高于As（Ⅲ）并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過MMA和DMA，該結(jié)果推翻了目前的普遍認(rèn)知，即砷在陸地環(huán)境（包括淡水和空氣）中主要以As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、MMA和DMA形態(tài)存在，AsB 形態(tài)含量極低［29］。國內(nèi)外尚無空氣顆粒物中AsB的相關(guān)發(fā)現(xiàn)或研究，它是其他形態(tài)的砷在空氣中轉(zhuǎn)化合成的，還是從外源遷移而來的，目前未知。AsB濃度有季節(jié)性變化，夏季最高，春、冬較低，主導(dǎo)原因不明確。根據(jù)虹口區(qū)采樣點的地理位置，大氣顆粒物中AsB可能部分來源于沿海海水飛沫或新型排放途徑，如城市垃圾焚燒后擴(kuò)散到大氣中的飛塵。AsB形態(tài)是砷的地球生物化學(xué)循環(huán)以及砷的自然解毒過程中的重要環(huán)節(jié)，因此建議相關(guān)部門對其進(jìn)行源解析。

毒性最強(qiáng)的As（Ⅲ）在冬、秋、春季的濃度高于夏季，可能是氣溫更低導(dǎo)致氧化不完全；毒性次之的As（Ⅴ）在秋、冬季偏高?？偵榈哪曛形粩?shù)（1.790 ng·m-3）未超標(biāo)，但秋、冬季個別月份總砷仍有超標(biāo)。秋、冬季是呼吸道疾病的好發(fā)季節(jié)，為減輕呼吸道患病風(fēng)險，以及避免慢性吸入性砷暴露的遠(yuǎn)期健康風(fēng)險，建議相關(guān)部門保持對環(huán)境空氣的監(jiān)控治理。