黃婷婷 賈巧飛 金衛(wèi)斌 陶磊

喉鱗癌病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為與吸煙、飲酒、職業(yè)因素及病毒感染等有關(guān)[1]。因此，加強(qiáng)喉鱗癌患者早期診斷、治療對(duì)改善患者預(yù)后具有重要的意義。內(nèi)皮抑素（Endostatin）是在實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-2）均為促進(jìn)血管形成重要因子，能刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌集中蛋白酶與蛋白酶活化因子，促進(jìn)新生血管形成[3,4]。目前臨床上Endostatin、VEGF 及FGF-2 在喉鱗癌患者中的表達(dá)及與喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究較少。因此，本次研究采用隨機(jī)對(duì)照研究探討Endostatin、VEGF 及FGF-2 在喉鱗癌患者中的表達(dá)及與疾病發(fā)生的相關(guān)性及臨床價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年5 月至2020 年5 月在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科治療的喉鱗癌患者59 例設(shè)為觀察組，其中男性33 例、女性26 例；年齡36～85 歲，平均（52.49±7.93）歲；腫瘤直徑1～7 cm，平均（4.12±0.57）cm。分化類型：高分化21 例、中分化26 例、低分化12 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：是34 例、否25 例；TNM 分期：Ⅰ期21 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期9 例、Ⅳ期14 例；腫瘤部位：聲門上型14 例、聲門型31 例、聲門下型4 例。選擇同期非喉部腫瘤手術(shù)治療患者56 例設(shè)為對(duì)照組，其中男性31 例、女性25 例；年齡35～86 歲，平均（53.11±7.95）歲。兩組臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)為：①觀察組患者均符合喉鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，均經(jīng)手術(shù)病理確診；②觀察組與對(duì)照組患者均擬行手術(shù)治療，術(shù)中均取病灶組織；③能在醫(yī)生指導(dǎo)下完成有關(guān)檢查、診斷、治療。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①合并其他喉部疾病或其他部位惡性腫瘤或病歷資料不全者；②近3 個(gè)月使用放化療或?qū)Ρ狙芯拷Y(jié)果產(chǎn)生影響者；③合并凝血功能異常、精神異?；虬橛凶陨砻庖呦到y(tǒng)疾病者。

1.3 方法 取觀察組病灶組織與癌旁組織及對(duì)照組病灶組織，加入蒸餾水與濃度為30.0%H2O2，常溫下加入內(nèi)源性酶并進(jìn)行10 min 滅火，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）連續(xù)進(jìn)行3 次洗滌。將最終獲得的切片放置在0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液中，加入0.9%氯化鈉注射液控制溶液pH 值最終為6。電爐加熱直到煮沸，5 min 間隔后再次煮沸，常溫下冷卻。采用PBS 2 次洗滌，每次5 min，最后加入5%BSA封閉液并加入兔抗人Endostatin、VEGF及FGF-2 蛋白抗體（1：100），兔抗人Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白一抗，各一滴。滴加完畢后進(jìn)行3 次PBS 洗滌；在1 ml 底物中加入兔抗人Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白二抗一滴，混合后常溫下顯色，蘇木精復(fù)染后封片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，每份標(biāo)本測(cè)定三次，取平均值[6]。

1.4 陽(yáng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參考奧爾雷德評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別從細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)量（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25.0%0 分，26%～50.0%1 分，51%～75%2 分，＞75%3 分）、染色強(qiáng)度（不著色0 分，黃色1 分，棕黃色2 分，黃褐色3 分）對(duì)染色效果進(jìn)行評(píng)分，總分16 分，評(píng)分越高陽(yáng)性率越高[7，8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性分析Endostatin、VEGF 及FGF-2 與喉鱗癌發(fā)生的相關(guān)性。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率比較見表1

表1 兩組Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白陽(yáng)性率比較/例（%）

由表1可見，觀察組癌旁組織與對(duì)照組Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別=1.79、2.08、1.43，P均＞0.05）；觀察組病灶組織中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率均高于癌旁組織和對(duì)照組（χ2分別=10.39、12.14、7.94、6.97、10.85、9.24，P均＜0.05）。

2.2 兩組Endostatin、VEGF 及FGF-2 免疫組化結(jié)果見圖2

圖2 兩組Endostatin、VEGF及FGF-2免疫組化染色圖（×200倍）

由圖2可見，觀察組病灶組織中Endostatin、VEGF 及FGF-2 呈高表達(dá)，喉細(xì)胞出現(xiàn)不同程度壞死，纖維增生更加明顯；而對(duì)照組組織中表達(dá)水平較低。

2.3 觀察組不同臨床特征中Endostatin、VEGF 及FGF-2蛋白陽(yáng)性率見表2

表2 觀察組不同病理組織中Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白陽(yáng)性率比較/例

由表2 可見，觀察組喉鱗癌組織中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率與性別、年齡、腫瘤部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=1.29、0.64、1.29，P均＞0.05）；喉鱗癌組織中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及分化程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=6.75、5.09、4.55、7.89，P均＜0.05）。

2.4 Endostatin、VEGF 及FGF-2 陽(yáng)性表達(dá)與喉鱗癌發(fā)生相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，喉鱗癌發(fā)生與Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)性（rs分別=0.59、0.56、0.62，P均＜0.05）。

3 討論

喉癌是臨床上常見的惡性腫瘤，多數(shù)患者以原發(fā)性喉鱗癌為主，且隨著人們生活方式的改變，導(dǎo)致喉鱗癌發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，影響患者健康、生活。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明[9]：血管生成與腫瘤生物學(xué)存在緊密的聯(lián)系，且經(jīng)實(shí)體瘤證實(shí)其生長(zhǎng)、增殖與血管的生成存在緊密的聯(lián)系。臨床研究表明腫瘤微血管密度與腫瘤的表型、生物學(xué)行為有關(guān)，新生血管不僅能為腫瘤提供所需的營(yíng)養(yǎng)成分，并運(yùn)送代謝廢物，并以旁分泌形式刺激腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)中，加速腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[10]。

目前，臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有抑制腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤血管生成的活性物質(zhì)。Endostatin是最為理想的促進(jìn)因子，屬于是一種蛋白質(zhì)，且經(jīng)氨基酸序列顯示該物質(zhì)為膠原XVIIIC 末端非膠原區(qū)的氨基酸片段。臨床研究表明Endostatin 在生物學(xué)活性上能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，且常伴有誘導(dǎo)凋亡作用，而對(duì)非內(nèi)皮細(xì)胞無增殖、抑制作用。Endostatin 能抑制多種抑制腫瘤的生長(zhǎng)，能誘發(fā)原發(fā)腫瘤消退或進(jìn)入休眠期，不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生影響[11]。VEGF 及FGF-2 是促進(jìn)血管形成的重要因子，能刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌，導(dǎo)致血管基底膜降解，能加速腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖，從而形成新的、含有空腔的血管[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明：VEGF 及FGF-2 表達(dá)水平與血管的形成有關(guān)，能加速腫瘤的轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)[13]。本次研究結(jié)果顯示，觀察組癌旁組織與對(duì)照組Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）；觀察組病灶組織中Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性率均高于癌旁組織與對(duì)照組（P均＜0.05）；免疫組化結(jié)果表明：觀察組病灶組織中Endostatin、VEGF 及FGF-2蛋白呈高表達(dá)，喉細(xì)胞出現(xiàn)不同程度壞死，纖維增生更加明顯；而對(duì)照組組織中表達(dá)水平較低，說明Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白在喉鱗癌患者中呈高表達(dá)，能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。這與胡盤林等[14]、Xu等[7]研究一致。

目前，臨床上對(duì)于抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤血管生成物質(zhì)相對(duì)較多，但是Endostatin、VEGF及FGF-2 蛋白在喉鱗癌中表達(dá)及與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響研究較少[8]。本次研究發(fā)現(xiàn)喉鱗癌組織中Endostatin、VEGF及FGF-2蛋白陽(yáng)性率與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及分化程度明顯相關(guān)（P均＜0.05），表明Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白在喉鱗癌患者中表達(dá)受到的影響因素較多，其表達(dá)水平能反映患者的腫瘤分期、腫瘤大小、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，能幫助患者早期確診，為臨床診療提供依據(jù)和參考。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明：通過抑制腫瘤血管生成能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，且當(dāng)腫瘤直徑低于1～2 mm 時(shí)，腫瘤細(xì)胞則可以通過彌散方法完成營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，該時(shí)間段無血管的形成，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。但是，隨著腫瘤的不斷發(fā)展，且能分泌調(diào)節(jié)因子時(shí)，則可以生產(chǎn)血管，加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。為了進(jìn)一步分析喉鱗癌組織中End?ostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白與疾病發(fā)生的關(guān)系，研究中對(duì)兩者進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明：喉鱗癌發(fā)生與Endostatin、VEGF 及FGF-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（P均＜0.05），表明Endostatin、VEGF及FGF-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平與喉鱗癌的發(fā)生有關(guān)，加強(qiáng)其水平測(cè)定能實(shí)現(xiàn)患者早期診療。

綜上所述，Endostatin、VEGF及FGF-2在喉鱗癌患者中呈高表達(dá)，能反映患者疾病嚴(yán)重程度，且與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性，能為臨床診療提供依據(jù)和參考。但目前仍需更多臨床數(shù)據(jù)確定Endostatin、VEGF 及FGF-2 在喉鱗癌患者中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。