謝珍 莫翠菊 彭契六* 張磊 謝乃亮

（廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科1，廣西 南寧，530201）

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2，廣西 南寧，530021）

肝癌是我國(guó)第四位常見(jiàn)惡性腫瘤及第三位腫瘤相關(guān)致死性病因，嚴(yán)重威脅人民的生命健康[1]。慢性HBV 感染是導(dǎo)致肝癌的最常見(jiàn)原因，但其具體致病機(jī)制尚未明確。新近研究顯示，肝癌的發(fā)生具有遺傳易感性[2-4]，而細(xì)胞凋亡異常與HBV 感染相關(guān)的慢性肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。DR4 是體內(nèi)重要的促細(xì)胞凋亡因子，是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的功能性受體，通過(guò)與TRAIL 結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)并將凋亡信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，選擇性誘導(dǎo)已突變的靶細(xì)胞凋亡，對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響[7-8]。既往研究報(bào)道，DR4 基因多態(tài)性與前列腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸部腫瘤等多種癌癥具有相關(guān)性[9-12]，其中報(bào)道較多的包括rs20575、rs20576 等功能性單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。并且，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DR4rs20575 和rs20576 基因多態(tài)性與丙型肝炎病毒（HCV）感染相關(guān)HCC 的遺傳易感性相關(guān)[13-14]。然而，目前DR4 基因多態(tài)性對(duì)HBV 相關(guān)HCC 的潛在影響尚未明確。因此，本研究將探討DR4rs20575 和rs20576 兩個(gè)SNP 位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV 相關(guān)HCC 易感性之間的關(guān)系，為臨床對(duì)肝癌的早期診斷和防治提供分子生物學(xué)的理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)收錄2017 年07 月至2018 年06 月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的HBV 相關(guān)HCC 的患者為肝癌組，健康體檢者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有肝癌患者均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017 年版）》[1]對(duì)肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且有明確的慢性HBV感染證據(jù)，即HBsAg 陽(yáng)性半年以上和（或）HBV DNA>1 x 103 IU/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他部位惡性腫瘤的患者；（2）合并甲型肝炎、丙型肝炎等其他肝炎病毒感染的患者；（3）合并酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、代謝性肝病及華支睪吸蟲(chóng)感染等肝臟疾病的患者；（4）合并其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病的患者。對(duì)照組為來(lái)自體檢中心的健康體檢志愿者，HBsAg 陰性，無(wú)心、肺、腦、肝、腎及代謝性疾病等病史。本研究中所有納入對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并且獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集及全基因組DNA 的提取

抽取研究對(duì)象空腹靜脈血2ml 置于EDTA-K2 抗凝管中，使用康寧生物科學(xué)（吳江）有限公司的AxyPrep 血基因組DNA 試劑盒提取基因組DNA，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)器濃度和純度，稀釋至50ng/ul 后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DR4 兩個(gè)位點(diǎn)基因型檢測(cè)

采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism,PCR-RELP）技術(shù)檢測(cè)DR4 基因rs20575 和rs20576 的多態(tài)性。引物由廣州擎科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成并純化，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

使用25ul PCR 反應(yīng)體系，12.5ul Premix TaqTM（寶生物工程有限公司），上、下游引物各1ul，DNA 模板10ul，滅菌去離子水0.5ul。94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)34 次，隨后72℃延伸10min。

1.5 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

制備2%瓊脂糖凝膠，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于5×TBE 電泳緩沖液中，在120V 穩(wěn)定電壓下電泳35min，在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果并保存圖像。

1.6 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳

使用30ul 限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)體系，滅菌去離子水17ul，10×FastDigest 2ul，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10ul，限制性?xún)?nèi)切酶1ul，rs20575 和rs20576 位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶分別為AdeI 和TaqI，分別置于37℃和65℃中孵育30min。將制備好的凝膠放入電泳槽中，加入0.5×TBE 緩沖液，依次將DNA Marker、酶切產(chǎn)物、陰性對(duì)照（未加酶）加入凝膠孔中。在120V 穩(wěn)定電壓下電泳35min，在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果并保存圖像。隨機(jī)抽取每個(gè)位點(diǎn)10%的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證限制性?xún)?nèi)切酶切基因分型結(jié)果的可靠性，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Chromas 軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2 檢驗(yàn)分析各組中的基因頻率分布是否符合哈- 溫平衡(Hardy-weinberg equilibrium，HWE)定律。計(jì)量資料用±S表示，計(jì)數(shù)資料用χ2 檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，比值比（Odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（Confidence Intervals，CI）表示各基因型與HCC 易感性的相關(guān)性。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象臨床資料比較

在2017 年7 月至2018 年6 月間，符合入選標(biāo)準(zhǔn)的肝癌組患者147 例，其中男110 例（84.62 %，女37 例（15.38 %），平均年齡（46.87±10.61）歲；對(duì)照組患者147 例，其中男110例（77.94%），女37 例（22.06%），平均年齡（45.91±11.08）歲，兩組患者的性別比例和平均年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。

2.2 DR4 兩個(gè)SNP 位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV 相關(guān)HCC 的關(guān)系

經(jīng)檢驗(yàn)，兩組受試者DR4 基因rs20575、rs20576 兩個(gè)位點(diǎn)的基因頻率均符合哈溫遺傳平衡規(guī)律，具有群體代表性。肝癌組rs20575 位點(diǎn)含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）的攜帶頻率明顯高于對(duì)照組（ 31.97% vs 12.24%,OR =3.37,95%CI:1.84-6.16, P = 0.00），而rs20576 位點(diǎn)含突變等位基因C 的基因型（AC+CC）的攜帶頻率在兩組中的分布均無(wú)明顯差異(P >0.05)。可以認(rèn)為，與基因型CC 相比，含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）的患者罹患HBV 相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)增高3.37 倍，而DR4rs20576 位點(diǎn)多態(tài)性與HBV 相關(guān)HCC 的患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。詳見(jiàn)表2。

表2 DR4 兩個(gè)位點(diǎn)的基因型分布頻率及其與HBV 相關(guān)HCC 的關(guān)系

2.3 DR4 基因兩個(gè)SNP 位點(diǎn)的單倍體分析

通過(guò)SHEsis 軟件對(duì)rs20575 和rs20576 兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行單倍體構(gòu)建，共構(gòu)建出CA、CC、GA、GC 四種單倍型。其中CA 和GA 單倍型在兩組中的分布頻率具有顯著差異(OR =0.41,P = 0.00;OR = 3.08,P = 0.00)，可以認(rèn)為，CA 單倍型患HBV 相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低至0.41，而GA 單倍型患HBV相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高3.08 倍。CC 和GC 單倍型與HBV 相關(guān)HCC 患病風(fēng)險(xiǎn)均無(wú)關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 DR4 兩個(gè)SNP 的單倍體構(gòu)型在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的頻率比較

3.討論

人類(lèi)TRAIL 基因是腫瘤壞死因子超家族成員之一，定位于3 號(hào)染色體長(zhǎng)臂2 區(qū)6 帶，是人體重要的免疫效應(yīng)分子和促細(xì)胞凋亡因子，其通過(guò)與TRAIL 相關(guān)受體結(jié)合而選擇性誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及其他突變細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到免疫監(jiān)視功能，但不能誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡[15-16]。DR4 是TRAIL 受體家族成員之一，定位于染色體8p21 上，該位點(diǎn)具有多個(gè)SNP，rs20575和rs20576 是亞洲人群DR4 常見(jiàn)的功能位點(diǎn)。如rs20575 的等位基因C 突變?yōu)镚，其編碼的蘇氨酸將變?yōu)榫彼?，rs20576 的等位基因A 突變?yōu)镃，其編碼的谷氨酸將變?yōu)楸彼?，這兩個(gè)位點(diǎn)中任一位點(diǎn)的基因突變都可能導(dǎo)致TRAIL 與DR4 復(fù)合物形成區(qū)域內(nèi)的空間構(gòu)象發(fā)生變化，使TRAIL 介導(dǎo)的凋亡通路障礙，突變細(xì)胞不能被及時(shí)清除，從而誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[17-18]。

既往研究報(bào)道，DR4 rs20575 和rs20576 兩個(gè)SNP 位點(diǎn)多態(tài)性與多種腫瘤及自身免疫性疾病相關(guān)[9-12,19-20]。Teng 等[21]對(duì)高加索人群的研究顯示，DR4 rs20575 基因多態(tài)性增加頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)。K?rner 等[13]對(duì)德國(guó)人群開(kāi)展的研究顯示，DR4 rs20575 和rs20576 多態(tài)性增加HCV 相關(guān)肝癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)。另一項(xiàng)針對(duì)埃及人群的研究則發(fā)現(xiàn)[14]，DR4rs20575 位點(diǎn)多態(tài)性與HCV 相關(guān)肝癌相關(guān)，而rs20576 位點(diǎn)多態(tài)性與HCV 相關(guān)HCC的遺傳易感性無(wú)明顯相關(guān)。本研究中，rs20575 位點(diǎn)中含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）在肝癌組中的頻率明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），與CC 基因型相比，（CG+GG）基因型患HBV相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)升高3.37 倍，而DR4rs20576 位點(diǎn)含突變等位基因C 的基因型（AC+CC）的攜帶頻率在肝癌組與對(duì)照組中的分布無(wú)明顯差異(P >0.05)。研究結(jié)果與既往結(jié)果相似，提示rs20575 位點(diǎn)多態(tài)性增加了HBV 相關(guān)肝癌的遺傳易感性，（CG+GG）基因型是HBV 相關(guān)肝癌的危險(xiǎn)因素。既往研究報(bào)道[21-22]，死亡受體4(rs 20575)基因多態(tài)性存在明顯的種族差異，歐美高加索人群中該位點(diǎn)的突變率較高，而亞洲人群中則普遍較低，本研究中兩個(gè)SNP 位點(diǎn)中純突變基因型的出現(xiàn)頻率均偏低，因此有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

目前普遍認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展常是由多個(gè)遺傳變異SNP位點(diǎn)多態(tài)性共同作用的結(jié)果。單倍型是指一個(gè)染色單體中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性的一類(lèi)SNPs，由于一個(gè)基因上存在數(shù)個(gè)SNP 位點(diǎn)，因此聯(lián)合分析同一基因的多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性能獲得更全面的遺傳信息，從而更有利于發(fā)現(xiàn)基因與疾病的相關(guān)性[23]。本研究將DR4 rs20575 和rs20576 兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行單倍體構(gòu)建，結(jié)果顯示，CA 單倍型患HBV 相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低至0.41，而GA 單倍型患HBV 相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高3.08 倍。進(jìn)一步支持rs20575 位點(diǎn)基因突變與HBV 相關(guān)HCC 的遺傳易感性相關(guān)。

綜上所述，DR4 rs20575 位點(diǎn)基因多態(tài)性增加HBV 相關(guān)肝癌的遺傳易感性，含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）是罹患HBV 相關(guān)HCC 的危險(xiǎn)因素，但由于HBV 相關(guān)肝癌的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，該基因位點(diǎn)的具體致病機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。