習(xí)艷霞 王慧春 劉慧文

北京市海淀區(qū)婦幼保健院(100088)

不孕癥影響10%的育齡夫婦[1]。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)已成為治療不孕癥最有效的方法，但總體妊娠率仍只有30%～40%[2]。一些不孕患者甚至出現(xiàn)反復(fù)種植失敗(RIF)，是IVF治療中的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題[3]。RIF的發(fā)生受多種因素影響，其中子宮內(nèi)膜容受性是胚胎種植成功的先決條件[4]。微小RNA(miRNA)在各種細(xì)胞生理病理過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。miR-155被編碼在B細(xì)胞整合簇中，在抗原刺激機(jī)體時(shí)，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)會(huì)誘導(dǎo)其高水平表達(dá)[5]。一項(xiàng)回顧性分析RIF患者子宮內(nèi)膜樣本中miRNA差異表達(dá)的miRNA圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p與RIF有關(guān)[6]。miR-21是轉(zhuǎn)錄后水平上基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，在包括子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的幾乎所有實(shí)體瘤中均有高表達(dá)，因此被認(rèn)為是一種致癌的miRNA轉(zhuǎn)錄的重要驅(qū)動(dòng)子，在腫瘤和心血管疾病中表達(dá)上調(diào)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p功能喪失小家鼠植入小鼠的胚胎數(shù)量減少，可能與miR-21-5p功能喪失有關(guān)[8]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)IVF-ET發(fā)生RIF的患者子宮內(nèi)膜組織中的miR-155、miR-21水平，分析二者與RIF的關(guān)系，為臨床降低RIF的發(fā)生提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2019年9月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心行優(yōu)質(zhì)胚胎移植失敗≥3次(包括新鮮周期及解凍周期)患者40例(RIF組)，同期行IVF-ET成功妊娠患者40例為對(duì)照組。胚胎移植后30 d行B超檢測(cè)到妊娠囊及原始心管搏動(dòng)確定臨床妊娠[9]。收集兩組年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓、孕次、產(chǎn)次、人工流產(chǎn)史、自然流產(chǎn)史、RIF次數(shù)、不孕年限、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等一般資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①婚后正常同居>1年，未采取避孕措施，男方精液正常，女方因輸卵管梗阻行IVF-ET助孕；②月經(jīng)規(guī)律，基礎(chǔ)性腺激素正常水平；③既往無(wú)卵巢手術(shù)史，3個(gè)月內(nèi)無(wú)激素治療及宮腔操作史，無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥病史；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在生殖器畸形、子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉或多囊卵巢綜合征；②垂體或甲狀腺功能異常，影響性激素水平；③存在嚴(yán)重的心肺腎等器官的功能障礙；④合并免疫缺陷病、急慢性肝炎、惡性腫瘤。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要試劑與儀器

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP、600bp DNA ladder購(gòu)自賽默飛世爾生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(杭州博日)；-80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 研究方法

1.3.1子宮內(nèi)膜組織樣本的采集與保存患者均在IVF-ET前1月經(jīng)周期排卵后1周即黃體中期采用一次性宮腔組織吸引管采集子宮內(nèi)膜組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2子宮內(nèi)膜組織中miR-155、miR-21檢測(cè)按照Trizol法提取受試者子宮內(nèi)膜組織中總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度及濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)反應(yīng)，U6基因作為內(nèi)參，miR-155、miR-21、U6引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：95℃，10 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，15 s)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算子宮內(nèi)膜組織中miR-155、miR-21相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3血清TNF-α、IL-6、IL-1β檢測(cè)從-80℃冰箱中取出凍存血清樣本解凍，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，操作均嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4子宮內(nèi)膜容受性檢測(cè)于胚胎移植日采用陰道B超檢測(cè)受試者子宮內(nèi)膜容受性，觀察子宮內(nèi)膜螺旋動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(PI)、阻力指數(shù)(RI)及子宮內(nèi)膜厚度(Em)指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、孕次、產(chǎn)次、人工流產(chǎn)史、自然流產(chǎn)史、不孕年限等均無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2子宮內(nèi)膜miR-155、miR-21水平比較

RIF組子宮內(nèi)膜miR-155(3.18±1.15)、miR-21(2.51±0.82)水平高于對(duì)照組(1.02±0.18、1.06±0.16)(t=11.736、10.977，均P=0.000)。

2.3 血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

RIF組血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

2.4 子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)比較

與對(duì)照組相比，RIF組子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)PI、RI升高，Em降低(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)比較

2.5RIF組子宮內(nèi)膜miR-155、miR-21水平與炎癥因子及子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)相關(guān)性

Pearson法分析顯示，RIF組患者子宮內(nèi)膜miR-155、miR-21水平與血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及PI、RI均呈正相關(guān)，與Em呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 RIF組患者子宮內(nèi)膜miR水平與炎癥因子及子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)相關(guān)性

2.6 二元logistic回歸分析RIF的影響因素

以患者是否發(fā)生RIF為因變量，以RIF患者子宮內(nèi)膜組織中miR-155、miR-21水平、血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β水平及子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)PI、RI及Em為自變量，進(jìn)行二元logistic回歸分析。結(jié)果顯示，TNF-α、IL-6、IL-1β、PI、RI及Em既不是危險(xiǎn)因素也不是保護(hù)因素(P>0.05)；miR-155、miR-21是影響IVF-ET婦女發(fā)生RIF的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 二元logistic回歸分析RIF的影響因素

3 討論

RIF是影響IVF-ET妊娠結(jié)局的重要因素之一，近年來(lái)受到越來(lái)越多關(guān)注，但目前RIF定義尚不統(tǒng)一，國(guó)內(nèi)外比較公認(rèn)的RIF定義是指經(jīng)歷3次及以上移植周期，且累積移植至少4枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎而未獲得臨床妊娠[3]。在IVF-ET過(guò)程中胚胎移植次數(shù)、所移植胚胎數(shù)量及質(zhì)量、孕婦年齡等都與RIF有關(guān)。多種因素可能會(huì)導(dǎo)致RIF，包括雙親染色體異常、胚胎的遺傳或代謝異常、子宮容受性差以及著床部位的免疫紊亂。一些婦科疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、輸卵管積水和子宮內(nèi)膜息肉，也會(huì)對(duì)著床率產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，吸煙、飲酒和肥胖，也可能會(huì)降低胚胎種植成功的可能性[10]。RIF的發(fā)生既可能由單個(gè)因素導(dǎo)致，也可能是多種因素綜合影響所致，但迄今為止，RIF發(fā)生的相關(guān)機(jī)制尚不明確，因此探究RIF發(fā)生的相關(guān)影響因素十分重要。

miRNA通過(guò)靶向信使RNA(mRNA)調(diào)控基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，這些小的非編碼RNA可通過(guò)與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合來(lái)降解、破壞或抑制mRNA的翻譯[11]。miR-155最初被鑒定為B細(xì)胞整合簇基因[5]。由于miR-155具有免疫調(diào)節(jié)功能，而子宮內(nèi)膜容受性和胎盤(pán)著床均需要免疫反應(yīng)的特異性適應(yīng)，一項(xiàng)針對(duì)孕周環(huán)境中miRNAs水平的研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過(guò)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平等免疫細(xì)胞水平，進(jìn)而賦予胚胎適應(yīng)性免疫耐受[12]。miR-21在17q23.2中起癌基因的作用[13]。有研究顯示，敲除miR-21-5p后的母豬影響程序性細(xì)胞死亡因子4/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1途徑并破壞子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致豬胚胎移植失敗[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155、miR-21均參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，可促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[14]。

金志春等[15]發(fā)現(xiàn)，血清中炎癥水平過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致IVF-ET種植失敗，通過(guò)針刺抑制IVF-ET患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，有助于提高IVF-ET妊娠成功率。根據(jù)上述研究推測(cè)，miR-155、miR-21與子宮內(nèi)膜容受性及炎癥水平的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本研究檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中相關(guān)指標(biāo)，與對(duì)照組相比，RIF組子宮內(nèi)膜組織中miR-155、miR-21、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高。提示miR-155、miR-21、TNF-α、IL-6、IL-1β水平可能與RIF有關(guān)，推測(cè)可能是miR-155、miR-21水平升高，上調(diào)了TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平，進(jìn)而導(dǎo)致RIF。

子宮內(nèi)膜容受性是IVF-ET成功的重要條件，有研究發(fā)現(xiàn)[16]在IVF-ET周期中，子宮內(nèi)膜厚度與妊娠丟失及活產(chǎn)率密切相關(guān)。子宮螺旋動(dòng)脈阻力升高及血流速度減慢可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜血流灌注量減少，子宮內(nèi)膜容受性下降，不利于孕卵著床[17]。本研究進(jìn)一步分析子宮內(nèi)膜容受性發(fā)現(xiàn)，RIF組較對(duì)照組子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)PI、RI升高，Em降低。提示RIF患者存在子宮內(nèi)膜容受性變化，可能與RIF的發(fā)生有關(guān)。賈啟明等[18]發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-21水平與TNF-α、IL-2、C反應(yīng)蛋白等炎癥因子呈正相關(guān)，miR-155、miR-21及炎癥因子的增加可能是影響膿毒癥合并心功能障礙患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。本研究經(jīng)Pearson法分析顯示，RIF患者子宮內(nèi)膜miR-155、miR-21水平與TNF-α、IL-6、IL-1β、PI、RI呈正相關(guān)，與Em呈負(fù)相關(guān)。提示RIF患者子宮內(nèi)膜miR-155、miR-21水平與炎癥反應(yīng)和子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)，可能存在協(xié)同作用進(jìn)而影響RIF的發(fā)生。本研究經(jīng)logistic回歸分析，TNF-α、IL-6、IL-1β、PI、RI及Em既不是發(fā)生RIF的危險(xiǎn)因素也不是保護(hù)因素，而miR-155、miR-21是影響IVF-ET婦女發(fā)生RIF的危險(xiǎn)因素，提示miR-155、miR-21與RIF的發(fā)生密切相關(guān)，可能作為潛在的預(yù)測(cè)RIF的標(biāo)志物。

綜上所述，RIF患者子宮內(nèi)膜組織中miR-155、miR-21、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)PI、RI升高、Em降低，miR-155、miR-21與子宮內(nèi)膜炎癥水平及子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)，可作為診斷RIF的指標(biāo)。本研究也存在樣本量小、未檢測(cè)血清中miR-155、miR-21水平等不足，因此miR-155、miR-21與RIF的關(guān)系還有待深入探究。