黃瀟航，彭佳佳，李詩(shī)藝，賀金峪，王詩(shī)晨，黃志堅(jiān)，黃 瑜，殷光文

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013）

七彩山雞（Phasianus colchicus）是我國(guó)飼養(yǎng)規(guī)模較大的特種經(jīng)濟(jì)禽類，具有體型大、生長(zhǎng)快、產(chǎn)蛋多、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。半舍飼養(yǎng)是七彩山雞較為常見(jiàn)的養(yǎng)殖模式，能夠?yàn)樯诫u提供充足的活動(dòng)空間，更好地模擬野外環(huán)境，但也容易造成食源性寄生蟲(chóng)感染的問(wèn)題。

異刺線蟲(chóng)是雞及常見(jiàn)人工繁育雉科鳥(niǎo)禽常見(jiàn)的消化道寄生蟲(chóng)。國(guó)內(nèi)已經(jīng)報(bào)道了包括白冠長(zhǎng)尾雉[2]、孔雀[3]等多種圈養(yǎng)雉科鳥(niǎo)類異刺線蟲(chóng)病的臨床案例。張敏等[4]在對(duì)紅腹角雉異刺線蟲(chóng)病臨床病理研究中發(fā)現(xiàn)，病禽盲腸病理表現(xiàn)為出血嚴(yán)重，固有層大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，形成慢性彌漫性盲腸炎等病變，在臨床上具有較大的生產(chǎn)危害。在臨床診斷上，可通過(guò)活體蟲(chóng)卵形態(tài)學(xué)鑒定，但檢測(cè)結(jié)果容易與雞蛔蟲(chóng)卵混淆，因此需要對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

本研究就一例家養(yǎng)七彩山雞疑似感染寄生蟲(chóng)病例進(jìn)行病因判定，通過(guò)臨床癥狀觀察和病理剖檢，運(yùn)用光學(xué)顯微鏡對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期為該類寄生蟲(chóng)病的臨床鑒別與診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例介紹

福建省某居民庭院飼養(yǎng)的七彩山雞出現(xiàn)精神不振、慢性消瘦、采食量下降、腹瀉等癥狀，起初懷疑為球蟲(chóng)感染，使用三字球蟲(chóng)粉治療但效果不佳，隨后發(fā)生死亡，后推斷可能為消化道蠕蟲(chóng)病。

1.2 臨床診斷

對(duì)死禽進(jìn)行剖檢，檢查呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位，觀察肝、心等部位是否存在明顯的病理形態(tài)學(xué)變化，檢查食道、胃、腸等消化器官內(nèi)是否有寄生蟲(chóng)。刮取出現(xiàn)明顯病變部位的腸道內(nèi)容物做生理鹽水涂片，觀察是否存在寄生蟲(chóng)感染。采集患病山雞病理組織樣品，使用5%的甲醛溶液浸泡固定后，送往福州都拜特生物科技公司進(jìn)行蘇木精-伊紅染色切片（HE）的制備與觀察。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

使用DNA FAST KIT 試劑盒（美國(guó)MP Biomedicals 生物公司生產(chǎn)）提取目的蟲(chóng)體基因組，參照文獻(xiàn)[5] 報(bào)道的線蟲(chóng)通用引物（NEMF1：5'-CGCAAATTACCCACTCTC-3'；S3：5'-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3'）擴(kuò)增分離株18S rRNA。聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)體系為25.0 μL：ddH2O 8.5 μL，TaqMix 酶 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL；反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。通過(guò)電泳篩選陽(yáng)性條帶后進(jìn)行切膠回收測(cè)序，與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的生物信息進(jìn)行比較。擴(kuò)增條帶使用膠回收試劑盒回收純化后，送往福州鉑尚生物公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖檢

臨床病理剖檢發(fā)現(xiàn)，除腸道出現(xiàn)較為明顯肉眼眼觀病變外，肝、心等未見(jiàn)明顯病變；對(duì)肺、肝、腸等臟器進(jìn)行涂片觀察，未觀察到原蟲(chóng)；對(duì)腸道進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)直腸充血腫大（圖1-A），盲腸分叉部位出現(xiàn)黑腫，腸壁上可觀察到有蟲(chóng)體蠕動(dòng)，盲腸內(nèi)容物中有大量白小短棒狀線蟲(chóng)（圖1-B），腸內(nèi)壁有線蟲(chóng)穿孔寄生（圖1-C）。以上說(shuō)明消化道線蟲(chóng)的寄生感染對(duì)病禽消化道造成了較為嚴(yán)重的損害，從而導(dǎo)致病禽消化系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題。

圖1 臨床病理剖檢圖

2.2 蟲(chóng)體外觀

蟲(chóng)體外觀為白色短線狀蟲(chóng)體，長(zhǎng)度為0.85～1.36 cm。部分蟲(chóng)體在盲腸內(nèi)形成盤(pán)曲狀（圖2-A）；在盲腸部分內(nèi)容物中可觀察到大量蟲(chóng)體，在生理鹽水中活動(dòng)性較強(qiáng)（圖2-B）。光鏡下可觀察到蟲(chóng)體頭端略向一側(cè)彎曲（圖2-C），頭部及吻部形態(tài)粗大，食道較粗（圖2-D）。雄蟲(chóng)尾刺細(xì)長(zhǎng)，末梢尖銳，后有膨大部位（圖2-E）；雌蟲(chóng)體內(nèi)可觀察到大量蟲(chóng)卵，外觀為橢圓形，內(nèi)部含有分化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖2-F）。結(jié)合病變部位和寄生蟲(chóng)形態(tài)學(xué)初步判斷，病禽感染的消化道線蟲(chóng)為異刺線蟲(chóng)。

圖2 蟲(chóng)體的形態(tài)特征

2.3 病理組織學(xué)觀察

盲腸內(nèi)可以觀察到大量的嗜酸性粒細(xì)胞（黃色箭頭），黏膜層可見(jiàn)多處上皮細(xì)胞壞死脫落，核碎裂（圖3-A）；小腸病理組織切片中，固有層多見(jiàn)腸腺間距增寬（綠色箭頭），局部可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3-B）。綜上，病理切片結(jié)果表明線蟲(chóng)寄生對(duì)七彩山雞消化道造成了較為嚴(yán)重的機(jī)械損傷，并伴有炎性反應(yīng)。

圖3 腸道病理組織切片觀察結(jié)果

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 18S rRNA 擴(kuò)增條帶為750～1 000 bp，陽(yáng)性條帶明顯。陰性對(duì)照使用高壓過(guò)的蒸餾水（ddH2O）添加引物體系加樣，未出現(xiàn)條帶擴(kuò)增（圖4）。綜上，成功擴(kuò)增獲得七彩山雞異刺線蟲(chóng)（ZZ 株）目的片段。

圖4 凝膠電泳成像圖

2.4.2 序列分析與比較 ZZ 株18S rRNA 序列分析顯示，長(zhǎng)度大小為760 bp，擴(kuò)增獲得的18S rRNA 堿基中A、T、C、G 含量依次為26%、28%、27%、19%。通過(guò)DNAstar 7.0 分析軟件與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中異刺線蟲(chóng)等蟲(chóng)種的18S rRNA 序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ZZ 株同源性與雞異刺線蟲(chóng)（Heterakis gallinarum）DQ503462.1 蟲(chóng)株最為接近，除了存在5 個(gè)位點(diǎn)的堿基缺失外，其余堿基排序一致，提示18S rRNA 在異刺線蟲(chóng)種群遺傳上的保守性。通 過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ZZ 株的18S rRNA 序列同源性也最接近于雞異刺線蟲(chóng)DQ503462.1 蟲(chóng)株，其次是雞異刺線蟲(chóng)MK844591.1蟲(chóng)株、蛔蟲(chóng)（Ascaridia nymphii）LC057210.1 蟲(chóng)株，同源性依次為99.61%、99.47%、99.08%，同時(shí)也與其他蟲(chóng)種具有較高的基因相似性。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建與分析結(jié)果（圖5）顯示，分離獲得的ZZ 株18S rRNA 同源性與雞蛔蟲(chóng)（EF180058.1）、鴿蛔蟲(chóng)（LC057210.1）等盡管存在超過(guò)90%的相似性，但在進(jìn)化樹(shù)分支構(gòu)建上卻與它們形成了明顯的群落間分支。ZZ 株的18S rRNA 與國(guó)內(nèi)報(bào)道的雞異刺線蟲(chóng)DQ503462.1、MK844591.1 蟲(chóng)株聚于一支。

圖5 禽異刺線蟲(chóng)18S rRNA 進(jìn)化樹(shù)

3 討論

異刺線蟲(chóng)會(huì)造成禽類盲腸部腫大、壞死等癥狀，嚴(yán)重寄生時(shí)蟲(chóng)體產(chǎn)生的毒素等也會(huì)導(dǎo)致宿主中毒，同時(shí)存在誘發(fā)組織滴蟲(chóng)病的可能[6]。此外，異刺線蟲(chóng)多量寄生造成的腸道機(jī)械性損傷還可繼發(fā)細(xì)菌感染，嚴(yán)重危害禽類的生產(chǎn)性能，甚至群體健康。本次剖檢發(fā)現(xiàn)，線蟲(chóng)蟲(chóng)體鉆入寄生部位引起腸道出血等癥狀，臨床病變提示腸炎。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，七彩山雞異刺線蟲(chóng)寄生感染導(dǎo)致其腸道出現(xiàn)大量的炎性灶浸潤(rùn)、嗜酸性粒細(xì)胞增殖，在盲腸切片中可以觀察到蟲(chóng)體，但在心、肝、脾、肺等部位的病理變化并不顯著。這提示七彩山雞異刺線蟲(chóng)感染的危害主要體現(xiàn)在對(duì)消化系統(tǒng)的損傷，這也是導(dǎo)致七彩山雞死亡的主要原因。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，異刺線蟲(chóng)卵與蛔蟲(chóng)卵存在較高的相似度，在寄生蟲(chóng)知識(shí)儲(chǔ)備不足的情況下容易發(fā)生混淆。分子生物診斷技術(shù)近年來(lái)受到動(dòng)物分類學(xué)界廣泛關(guān)注，其中18S、12S 等遺傳區(qū)間因其序列特點(diǎn)而被應(yīng)用于蠕蟲(chóng)等病原生物的種群遺傳演化上。本研究在傳統(tǒng)臨床診斷基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)分離獲得的七彩山雞消化道內(nèi)線蟲(chóng)18S rRNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)其與雞源異刺線蟲(chóng)DQ503462.1、MK844591.1 蟲(chóng)株同源性較高，與雞蛔蟲(chóng)等其他禽類線蟲(chóng)分屬于不同的進(jìn)化樹(shù)分支。國(guó)內(nèi)對(duì)禽異刺線蟲(chóng)的診斷案例以形態(tài)學(xué)鑒定為主，而分子鑒定和病理學(xué)研究較少。本研究在傳統(tǒng)診斷基礎(chǔ)上，從病理組織學(xué)、分子生物學(xué)方面綜合鑒定確診了七彩山雞的異刺線蟲(chóng)感染，為該地特種禽殖提供了寶貴的異刺線蟲(chóng)病診斷資料。

異刺線蟲(chóng)感染對(duì)七彩山雞具有較大的危害，在日常的飼養(yǎng)管理過(guò)程中，尤其是具有戶外散養(yǎng)經(jīng)歷的種群個(gè)體，應(yīng)該給予適當(dāng)?shù)尿?qū)蟲(chóng)預(yù)防。在國(guó)內(nèi)禽類異刺線蟲(chóng)病臨床防治上，左旋咪唑等傳統(tǒng)驅(qū)蟲(chóng)藥等對(duì)異刺線蟲(chóng)具有較好的驅(qū)殺效果[7]。在臨床治療中，除了應(yīng)該考慮線蟲(chóng)本身造成的宿主損傷外，還應(yīng)考慮對(duì)可能發(fā)生的細(xì)菌繼發(fā)性感染、組織滴蟲(chóng)病進(jìn)行同步防治。在養(yǎng)殖管理方面，應(yīng)該形成良好的驅(qū)蟲(chóng)防疫觀念，根據(jù)各個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)地的實(shí)際情況定期驅(qū)蟲(chóng)，加強(qiáng)禽舍衛(wèi)生管理，減少放養(yǎng)、混養(yǎng)等。這些措施對(duì)防控該病能夠起到一定的積極作用。