崔基賢，南文龍，高 原，蘭德松，于本良，顧貴波

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧沈陽 110164；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心農(nóng)村能源環(huán)保事業(yè)部，遼寧沈陽 110034）

自2018 年8 月以來，非洲豬瘟（African swine fever，ASF）對(duì)我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大沖擊，嚴(yán)重影響了生豬產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，并進(jìn)一步威脅到我國動(dòng)物源性蛋白的穩(wěn)定供給。目前，對(duì)ASF 防控尚無可用的有效商品化疫苗和防治藥物[1]，因而非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的早期發(fā)現(xiàn)成為防控ASF 的重要手段之一。ASFV 的早期發(fā)現(xiàn)離不開實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的支撐。熒光PCR 方法是當(dāng)前主流的ASF 檢測(cè)方法。2019 年6月，中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心公布了可允許使用的28 個(gè)廠家生產(chǎn)的ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑名單，但目前尚未見相關(guān)檢測(cè)試劑敏感性、特異性、一致性、最低檢測(cè)限等評(píng)價(jià)指標(biāo)的數(shù)據(jù)報(bào)道。本研究以ASFV 陽性核酸標(biāo)準(zhǔn)品和已滅活的田間樣品為檢測(cè)對(duì)象，以世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的引物探針為金標(biāo)準(zhǔn)，初步評(píng)價(jià)了其中17 個(gè)廠家生產(chǎn)的ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑的敏感性和特異性，獲得了相關(guān)診斷試驗(yàn)特性方面的數(shù)據(jù)，以期為ASFV熒光PCR 檢測(cè)試劑選用和ASF 防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

OIE 推薦的ASFV 熒光PCR 引物探針，由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；17 種商品化ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒，分別來自17 個(gè)生產(chǎn)廠家（16 個(gè)國產(chǎn)、1 個(gè)進(jìn)口，依次標(biāo)注為A—Q）；陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ASFVP72基因核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（質(zhì)粒濃度5.9×103拷貝/μL），由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供；已滅活處理的62 份ASFV 陽性田間樣品，來自中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室；32 份陰性田間樣品，為本實(shí)驗(yàn)室保存的日常監(jiān)測(cè)樣品。熒光PCR 儀，ABI 7500 fast；96 通道核酸提取儀，Thermo scientific KINGFISHER FLEX；96 孔核酸提取試劑盒，購自長(zhǎng)春志昂生物科技有限公司。

1.2 敏感性和特異性評(píng)價(jià)

以中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供的OIE 推薦ASFV 熒光PCR 引物探針檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，以94 份已滅活田間樣品為檢測(cè)對(duì)象，分別評(píng)價(jià)17 種商品化試劑的敏感性（sensitivity，Se）和特異性（specificity，Sp），將檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)為四格表（2×2）形式，分別計(jì)算17 種商品化試劑盒的Se 和Sp（表1）。計(jì)算公式[2]如下：

表1 診斷資料2×2 四格表

1.3 一致性評(píng)價(jià)

以Kappa 統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)各商品化試劑盒與中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供的熒光PCR 試劑的一致性，分別計(jì)算Kappa 值及其95%CI[2]。0.4 ≥Kappa 值＞0，說明一致性不好；Kappa 值≥0.75，說明一致性較好；0.4 ＜Kappa值＜0.75，說明一致性一般[2]。

1.4 最低檢測(cè)限

將ASFV 陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行倍比稀釋，濃度依次為5.9×103×20～5.9×103×2-7拷貝/μL，共8個(gè)倍比稀釋度。分別采用17 個(gè)生產(chǎn)廠家的ASFV熒光PCR 商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，獲得每種試劑盒的最低檢測(cè)限。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將檢測(cè)結(jié)果等數(shù)據(jù)錄入Microsoft Office 2010 Excel 軟件進(jìn)行整理、保存和分析，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Kappa 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 敏感性和特異性評(píng)價(jià)

以O(shè)IE 推薦引物探針為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果（表2）顯示：17 個(gè)廠家試劑盒的敏感性、特異性均未達(dá)到100%。敏感性最低為77.4%，95%CI=67.0%～87.8%（廠家F），最高為96.8%，95%CI=92.4%～100%（廠家C 和P）；特異性最低為87.5%，95%CI=76.0%～99.0%（廠家A、B、G、P），最高為96.9%，95% CI=90.9%～100%（廠家F和M）。

表2 17 個(gè)廠家ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒敏感性和特異性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 一致性評(píng)價(jià)

17 個(gè)廠家的試劑盒與OIE 推薦引物探針檢測(cè)結(jié)果的一致性指標(biāo)見表2。有12 個(gè)廠家的試劑盒與OIE 推薦引物探針檢測(cè)結(jié)果一致性較好（Kappa值≥0.75），5 個(gè)廠家的試劑盒與OIE 推薦引物探針檢測(cè)結(jié)果一致性一般（0.4 ＜Kappa 值＜0.75）。

2.3 最低檢測(cè)限

OIE 推薦的引物探針和17 個(gè)商品化試劑盒的最低檢測(cè)限結(jié)果（CT 值）統(tǒng)計(jì)見表3。17 個(gè)廠家的商品化試劑盒均可檢測(cè)到最低稀釋度為5.9×103×2-3拷貝/μL，但不同廠家試劑盒的最低檢測(cè)限有所差別，5 個(gè)試劑盒可檢測(cè)到的最低稀釋度為5.9×103×2-3拷貝/μL，2 個(gè)試劑盒為5.9×103×2-4拷貝/μL，6 個(gè)試劑盒為5.9×103×2-5拷貝/μL，3 個(gè)試劑盒為5.9×103×2-6拷貝/μL，1 個(gè)試劑盒至少為5.9×103×2-7，且大部分國產(chǎn)試劑盒最低檢測(cè)限均低于進(jìn)口試劑盒。

表3 不同廠家試劑盒檢測(cè)陽性核酸標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限

3 討論

ASFV 自2018 年在我國首次被發(fā)現(xiàn)以來，短時(shí)間內(nèi)即傳播到國內(nèi)大部分地區(qū)，對(duì)我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了沉重打擊，產(chǎn)生了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)影響。由于尚無有效的商品化疫苗可用，當(dāng)前ASF 防控主要依賴嚴(yán)格的生物安全措施和早期發(fā)現(xiàn)后的精準(zhǔn)、快速清除，而實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是ASF 早期快速發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵措施之一。當(dāng)前基于核酸水平的檢測(cè)技術(shù)是 ASFV 病原檢測(cè)的主要手段，尤其是熒光PCR方法，在我國被廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR 方法自動(dòng)化程度高且不易污染樣本和環(huán)境，而商品化試劑盒將熒光定量PCR 所需的試劑整合在一起，操作更加簡(jiǎn)便，是ASFV 檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室比對(duì)的指定方法[3]。

2019 年6 月以來，中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心共公布了可允許使用的28 個(gè)廠家生產(chǎn)的ASFV熒光PCR 檢測(cè)試劑名單，為ASF 防控實(shí)踐提供了較為可靠的技術(shù)支持。周志剛等[4]采用4 種商品化ASFV 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒，以ASFV 陽性對(duì)照為樣品進(jìn)行試驗(yàn)，研究了S 形曲線輪廓的一致性、曲線美觀度、相對(duì)熒光強(qiáng)度和所需反應(yīng)時(shí)間等數(shù)據(jù)；王晶等[5]同時(shí)選用《非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》（SNT 1559—2010）中的普通PCR 方法、熒光定量 PCR 方法以及商品化試劑盒，對(duì)5 份驗(yàn)證樣品開展ASFV 核酸檢測(cè)和結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3 種檢測(cè)方法結(jié)果一致，樣品檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致。上述研究確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有檢測(cè)方法能夠滿足ASFV核酸日常檢測(cè)需求。但目前尚未見對(duì)ASFV 商品化熒光PCR 試劑盒敏感性、特異性等診斷特性方面的數(shù)據(jù)報(bào)道。

敏感性和特異性是診斷試驗(yàn)準(zhǔn)確性方面的兩個(gè)基本特性，是診斷試驗(yàn)研究評(píng)價(jià)中頗為穩(wěn)定的指標(biāo)[5]。診斷試驗(yàn)的敏感性越高，代表患病動(dòng)物被正確檢測(cè)為陽性結(jié)果的概率越高，假陰性結(jié)果比例越少；診斷試驗(yàn)的特異性越高，代表未患病動(dòng)物被正確檢測(cè)為陰性結(jié)果的概率越高，假陽性結(jié)果比例越少。評(píng)估ASFV 商品化試劑盒的敏感性和特異性，對(duì)于指導(dǎo)ASF 防控實(shí)踐具有重大意義。采用敏感性和特異性較高的試劑盒，可減少假陰性和假陽性結(jié)果的比例，提高疫病早期發(fā)現(xiàn)的概率并減少依據(jù)假陽性結(jié)果處理造成的損失。本研究以O(shè)IE 推薦的熒光PCR 引物探針為金標(biāo)準(zhǔn)，初步評(píng)價(jià)了17 個(gè)廠家生產(chǎn)的商品化ASFV 熒光PCR 試劑盒的敏感性和特異性。本研究結(jié)果顯示，17 個(gè)廠家商品化試劑盒的敏感性最低為77.4%，最高為96.8%，特異性最低為87.5%，最高為96.8%，均未到100%，且有一定差別。研究結(jié)果提示，在生產(chǎn)實(shí)踐中采用熒光PCR 方法檢測(cè)ASFV 時(shí)，一次檢測(cè)的陽性和陰性結(jié)果均需謹(jǐn)慎評(píng)價(jià)，最終確診需結(jié)合臨床和流行病學(xué)指標(biāo)，必要時(shí)可采取平行試驗(yàn)策略提高敏感性，或采取垂直試驗(yàn)策略提高特異性。

Kappa 一致性檢驗(yàn)方法由Cohen 在1960 年首先提出，旨在評(píng)估不同方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，近年來在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、流行病學(xué)及臨床資料可靠性考察等方面應(yīng)用較為廣泛[6-8]，但在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中應(yīng)用極少[9]。劉華等[10-11]應(yīng)用Kappa 檢驗(yàn)法比較了豬瘟IHA 和ELISA 抗體檢測(cè)方法結(jié)果的一致性，以及兩種豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性。但關(guān)于ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性尚未見研究數(shù)據(jù)報(bào)道。依據(jù)Kappa值無法判定哪個(gè)試劑盒或方法較好，但Kappa 值越大，表明兩種結(jié)果一致程度越高[6]。本研究分別計(jì)算了17 個(gè)廠家的商品化試劑盒與OIE 推薦引物探針的Kappa 值，發(fā)現(xiàn)12 個(gè)廠家的試劑盒與OIE推薦引物探針檢測(cè)結(jié)果一致性較好，5 個(gè)廠家的試劑盒與其一致性一般，這為今后獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及試劑盒比對(duì)篩選提供了數(shù)據(jù)參考。

最低檢測(cè)限研究結(jié)果表明，各廠家的試劑盒能夠檢測(cè)到的核酸最低濃度有所差別，且大部分國產(chǎn)試劑盒能夠檢測(cè)到的最低核酸濃度比進(jìn)口試劑盒還低，提示國產(chǎn)試劑盒完全可以勝任ASFV 的診斷和早期發(fā)現(xiàn)。

本研究局限性在于樣本含量相對(duì)較小，得到的敏感性、特異性95%CI 范圍較大，評(píng)價(jià)的精確性還有待進(jìn)一步提高。在今后的研究中，如經(jīng)費(fèi)充足，可提高樣本含量，以便得到更為精確的敏感性和特異性等試驗(yàn)特性方面的數(shù)據(jù)。