宋曉明，李佃場，林佳旭，宋 杰，王 森，張洪亮，秦曉冰，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心，山東青島 266109；2.乳山市行政審批服務(wù)局，山東乳山 264500 3.即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東青島 266200）

副豬嗜血桿菌病，又稱格拉塞爾氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的，以豬的多發(fā)性漿膜炎、纖維素性胸膜炎、腦膜炎、腹膜炎、心包炎和關(guān)節(jié)炎等多器官病變?yōu)樘卣鞯募毦詡魅静1-2]。該病在各年齡段豬群中均有發(fā)生，斷奶和保育仔豬比較易感，5～8 周齡仔豬發(fā)病率為10%～15%，發(fā)病嚴(yán)重的養(yǎng)殖場死亡率達50%以上。該病呈世界性分布，危害范圍較廣。目前豬群病原復(fù)雜多變，病毒與細菌多病原混合感染情況嚴(yán)重，HPS 作為一種主要的繼發(fā)病原，給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失[3-5]。

根據(jù)瓊脂擴散（kieletein-rapp-gabriedson，KRG）血清分型方法，HPS 可分為15 種血清型[6-7]。不同地區(qū)流行的HPS 血清型不同，菌株間毒力差異較大。在我國，主要流行血清4 型、5 型、12 型和13 型菌株。因血清4 型、5 型在我國流行分布范圍最廣，毒力較強，因此多被選作HPS 感染模型最適菌株[8-11]。從現(xiàn)有研究進展來看，該菌致病機理較為復(fù)雜，因此建立一種成本低且穩(wěn)定可靠的感染動物模型對于HPS 研究至關(guān)重要。

本試驗對HPS 血清4 型、5 型的6 種菌株進行昆明系（KM）小鼠致病性分析，選取最適菌株最適劑量對小鼠進行腹腔注射，將死亡小鼠的臨床癥狀、病理變化與HPS 豬體試驗進行對比，然后進行細菌分離鑒定、PCR 鑒定，建立KM 小鼠感染模型。

1 材料與方法

1.1 菌株

從山東、河北、福建、廣東、江西5 省分離到的6 株HPS，編號分別為SD-05、ZC-7、ND-21、BD-1、HB-08、PZ-26。經(jīng)KRG 血清型鑒定，SD-05、ZC-7 和ND-21 分離菌株為血清4 型，BD-1、HB-08、PZ-26 分離菌株為血清5 型。上述菌株均由本實驗室鑒定、保管和備用。

1.2 試驗動物

體質(zhì)量16～20 g 的KM 雌性清潔級小鼠400 只，購自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社。經(jīng)檢測確認，KM 小鼠HPS 抗體均呈陰性。

1.3 材料與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），購自英國OXOID 公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購自Sigma 公司；新生牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；DL 1 000 DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.4 HPS 對KM 小鼠毒力測定

1.4.1 血清4 型、5 型分離株復(fù)蘇培養(yǎng) 將HPS血清4 型（SD-05、ZC-7、ND-21）、5 型（BD-1、HB-08、PZ-26）分離株分別在添加有0.005% NAD和5%新生牛血清的TSA 固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，連續(xù)傳至第3 代；無菌條件下挑取單菌落至5 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)10～12 h，作為種子液；將種子液按照2%接種量接種至100 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 擴大培養(yǎng)10～12 h；應(yīng)用平板菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù)，再將菌液稀釋成5 個梯度劑量，對KM 小鼠進行毒力測定。

1.4.2 血清4 型、5 型分離株毒力測定 對于每種分離株，選取60 只KM 小鼠開展試驗。將小鼠隨機分為6 組，每組10 只。前5 組為試驗組，每種分離株以不同劑量對小鼠腹腔注射，0.2 mL/只；第6組為對照組，腹腔注射同等劑量PBS，觀察60 h。記錄小鼠死亡數(shù)，根據(jù)毒力測定結(jié)果分別選取血清4 型、5 型毒力較強菌株用于KM 小鼠攻毒試驗。

1.5 KM 小鼠攻毒試驗

1.5.1 血清4 型菌株 選取20 只KM 小鼠開展試驗，將小鼠隨機平均分為2 組（試驗A 組、對照A 組）。以最適劑量對試驗A 組小鼠腹腔注射1.4.2 中選出的HPS 血清4 型菌株，0.2 mL/只，對照A 組腹腔注射同等劑量PBS。

1.5.2 血清5 型菌株 選取20 只KM 小鼠開展試驗，將小鼠隨機平均分為2 組（試驗B 組、對照B 組）。以最適劑量對試驗B 組小鼠腹腔注射1.4.2 中選出的HPS 血清5 型菌株，0.2 mL/只，對照B 組腹腔注射同等劑量PBS。

1.6 病理變化

觀察記錄感染后小鼠的臨床變化，當(dāng)試驗組小鼠死亡后，進行病理剖檢，觀察主要器官病理變化情況。

1.7 細菌學(xué)鑒定

無菌條件下采集死亡小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、心血、腹腔積液、胸腔積液等組織病料，接種于添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSA、TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取疑似單菌落，進一步純化培養(yǎng)。

1.8 PCR 鑒定

根據(jù)GenBank 中HPS 16s rRNA 基因序列（登錄號：M75065）設(shè)計引物（上游引物：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游引物：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3'）。預(yù)計擴增目的片段大小為822 bp，引物送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。采用25.0 μL PCR 反應(yīng)體系（表1）。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，循環(huán)30 次；終延伸72 ℃ 10 min。根據(jù)文獻[12]方法對分離菌株進行PCR 鑒定。

表1 PCR 反應(yīng)體系 單位：μL

2 結(jié)果

2.1 不同分離菌株對KM 小鼠毒力測定

2.1.1 血清4 型分離菌株毒力測定 從表2～4 可以看出，盡管3 個菌株均為血清4 型，但使用不同菌株注射小鼠后，小鼠死亡情況不同。當(dāng)腹腔注射劑量達到（1.1～1.3）×1010CFU 時，SD-05 株可使小鼠在48 h 內(nèi)全部死亡，ZC-7 株可使80%小鼠死亡，而ND-21 株毒力最弱，只能使60%小鼠死亡。因此推測血清4 型SD-05 株毒力較強。

表2 血清4 型分離菌株SD-05 對KM 小鼠毒力測定結(jié)果

表3 血清4 型分離菌株ZC-7 對KM 小鼠毒力測定結(jié)果

表4 血清4 型分離菌株ND-21 對KM 小鼠毒力測定結(jié)果

2.1.2 血清5 型分離菌株毒力測定 從表5～7 可以看出，盡管3 個菌株均為血清5 型，但使用不同菌株注射小鼠后，小鼠死亡情況不同。當(dāng)腹腔注射劑量達到（1.1～1.2）×1010CFU 時，HB-08 株可使小鼠在48 h 內(nèi)全部死亡，PZ-26 株可使80%小鼠死亡，而BD-1 株只能使50%小鼠死亡。因此推測血清5 型HB-08 株毒力較強。

表5 血清5 型分離菌株BD-1 對KM 小鼠毒力測定結(jié)果

表6 血清5 型分離菌株HB-08 對KM 小鼠毒力測定結(jié)果

表7 血清5 型分離菌株P(guān)Z-26 對KM 小鼠毒力測定結(jié)果

2.2 攻毒后臨床表現(xiàn)

為保證建立的小鼠感染模型中同時有發(fā)病病例和死亡病例，分別使用1.2×109CFU 劑量的血清4 型SD-05 株、1.175×109CFU 劑量的血清5型HB-08 株對小鼠開展攻毒試驗。3 h 后，試驗A、B 兩組小鼠開始出現(xiàn)顫抖、呼吸急促、精神不振、萎靡厭食、擁擠扎堆、背毛凌亂站立等臨床癥狀；24 h 后小鼠開始死亡，持續(xù)至攻毒60 h 后不再出現(xiàn)新增死亡小鼠。對照A、B 組小鼠均表現(xiàn)正常。

2.3 剖檢變化

試驗A、B 組小鼠死亡后的剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠心臟、肺臟出血，脾臟出血、腫大，肝臟有出血點、腫大，胸腔積液，腸道腫大、透明（圖1）。

圖1 HPS 攻毒60 h 后小鼠剖檢變化

2.4 PCR 鑒定

經(jīng)PCR 擴增，成功鑒定到長度約822 bp 的HPS 目的條帶（圖2），與預(yù)期片段大小一致。

圖2 死亡小鼠組織樣品PCR 鑒定結(jié)果

3 分析與討論

HPS 常發(fā)生于飼養(yǎng)環(huán)境差的小型養(yǎng)豬場，給養(yǎng)殖戶造成了巨大經(jīng)濟損失。國內(nèi)外學(xué)者對HPS致病性、毒力和免疫原性的研究從未停止。豬是研究HPS 最好的試驗動物模型，但普通豬常存在母源抗體影響。為避免這種情況，研究人員采用SPF 豬、初乳缺乏豬[13]、剖腹產(chǎn)初乳缺乏豬[14]、普通斷奶仔豬等作為HPS 感染試驗動物，成功復(fù)制了典型HPS 病例。SPF 豬等雖然可以作為理想的HPS 動物模型，但存在試驗條件要求較高、成本高等問題，導(dǎo)致其在實際研究應(yīng)用中存在局限性。當(dāng)HPS 致病性研究需要大量試驗動物時，尋求豬的替代感染動物顯得尤為重要，如小鼠和豚鼠等。

本試驗以HPS 血清4 型（SD-05、ZC-7、ND-21）、5 型（BD-1、HB-08、PZ-26）分離株為研究對象，對KM 小鼠進行毒力測定。結(jié)果顯示：6種分離株均對小鼠有一定致病性，但不同血清型菌株以及相同血清型不同菌株，對KM 小鼠毒力及致病性也不同。其中，血清4 型SD-05 株和血清5型HB-08 株毒力較強，小鼠發(fā)病及死亡率較高，具有更強的致病性。

綜合毒力測定結(jié)果，選擇毒力和致病性較強、遺傳特性穩(wěn)定的血清4 型分離菌株SD-05 和血清5型分離菌株HB-08 作為建立HPS 血清4 型、5 型KM 小鼠感染模型的感染菌種。KM 小鼠攻毒試驗中，采用SD-05株和HB-08株對小鼠進行腹腔接種，對死亡小鼠的臨床癥狀表現(xiàn)、剖檢變化及細菌分離鑒定結(jié)果進行分析總結(jié)。攻毒后小鼠出現(xiàn)顫抖、呼吸急促、精神萎靡、厭食消瘦、擁擠扎堆、背毛凌亂等情況，與豬格拉塞爾氏病具有相似臨床癥狀；剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟出血及炎性變化、胸腔積液、心臟病變且伴有血凝塊、胸腔輕微黏連、肝臟腫大等情況，與豬格拉塞爾氏病具有相似病理變化；通過細菌分離培養(yǎng)，在小鼠組織器官中分離得到HPS 菌株。研究表明，HPS 對KM 小鼠具有致病性，4 型、5型菌株不僅能夠引起小鼠發(fā)病死亡，且毒力較強。綜上，本試驗初步建立了血清4 型、5 型副豬嗜血桿菌的小鼠感染模型，可用于研究HPS 毒力和免疫原性相關(guān)因子，為HPS研究發(fā)展奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。