戈勝?gòu)?qiáng)，韓乃君，呂 艷，任煒杰，張瀟月，王勤玉，南文龍，吳曉東，王志亮

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271001）

在面對(duì)大范圍傳播的烈性傳染病時(shí)，疫苗免疫接種是最有效的防控手段之一。但大規(guī)模疫苗（特別是弱毒活疫苗）接種又會(huì)帶來一些負(fù)面擔(dān)憂，如疫苗毒重組導(dǎo)致毒力返強(qiáng)，免疫壓力導(dǎo)致流行株變異等。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）自1921 年公開報(bào)道以來，至今仍未有商品化疫苗用于其防控。一直以來，對(duì)于ASF 疫苗使用的爭(zhēng)議從未間斷，對(duì)其疫苗研發(fā)評(píng)估/臨床應(yīng)用尤其謹(jǐn)慎。20 世紀(jì)60 年代，面對(duì)ASF 傳入后的快速蔓延，西班牙和葡萄牙曾經(jīng)進(jìn)行過弱毒疫苗田間試驗(yàn)，但最終以失敗告終，這也是大家對(duì)ASF 疫苗抱有“負(fù)面期望”的原因之一。為科學(xué)分析ASF 疫苗的臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，筆者搜集整理了20 世紀(jì)60 年代的關(guān)鍵文獻(xiàn)（以葡萄牙發(fā)表的法語文獻(xiàn)為主），對(duì)該時(shí)期葡萄牙的“免疫失敗事件”進(jìn)行詳細(xì)闡述，以期科學(xué)看待ASF 疫苗的使用經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，為未來ASF 疫苗研制提供參考。

1 疫苗田間試驗(yàn)背景

1957 年4 月，ASF 首次從非洲大陸傳出，經(jīng)安哥拉國(guó)際航班攜帶的未熟化的帶毒豬肉餐廚垃圾傳入葡萄牙里斯本（首發(fā)疫情養(yǎng)殖場(chǎng)靠近機(jī)場(chǎng)）。隨后，葡萄牙共8 個(gè)省份471 個(gè)地點(diǎn)暴發(fā)ASF 疫情，損失16 989 頭豬（其中6 352 頭發(fā)病死亡，其余被撲殺銷毀）[1-2]。因采取了快速有效的撲滅措施，如感染畜群的早期發(fā)現(xiàn)、隔離、限制移動(dòng)、撲殺等，葡萄牙第一波疫情于1958 年6 月19 日被全部消滅[3]。1960 年4 月18 日，葡萄牙再次發(fā)現(xiàn)ASF 疫情。首發(fā)病例發(fā)生在第一波疫情曾經(jīng)出現(xiàn)的里斯本地區(qū)，發(fā)病原因可能是家豬誤食了未合規(guī)處理的病豬豬肉制品（有專家認(rèn)為這次疫情的病原并非來源于境外，但無法確定病毒在這段時(shí)間內(nèi)是如何隱藏的，比較明確的是發(fā)病豬群的食物中包含地溝油和餐館垃圾[2]）。但經(jīng)部分序列比對(duì)分析認(rèn)為L(zhǎng)isbon60毒株（1960 年傳入）和Lisbon57 毒株（1957 年傳入）可能為不同來源毒株，兩個(gè)毒株之間存在一定的抗原差異，如Lisbon57 毒株屬于血清1 群，而Lisbon60 毒株屬于血清4 群[4]。雖然葡萄牙立刻采取了嚴(yán)格的控制措施，對(duì)該農(nóng)場(chǎng)的所有動(dòng)物（發(fā)病和健康）都進(jìn)行了撲殺和銷毀，但可能由于被污染的肉類在首發(fā)病例被發(fā)現(xiàn)前就已進(jìn)入了流通環(huán)節(jié)，導(dǎo)致ASF 還是傳播到了同一地區(qū)的其他農(nóng)場(chǎng)。截至1960 年12 月，葡萄牙共16 個(gè)省份187 個(gè)地點(diǎn)暴發(fā)ASF 疫情，損失14 629 頭豬（725 頭病死、13 904 頭被撲殺，表1）。同年，ASF 經(jīng)邊境傳入西班牙（首次疫情發(fā)生在靠近葡萄牙邊境地區(qū)）[5]。

表1 1960 年葡萄牙ASF 疫情發(fā)病情況

葡萄牙此輪ASF疫情從1960年開始持續(xù)發(fā)展，1962 年4 月開始快速蔓延，多地出現(xiàn)持續(xù)傳播，疫情進(jìn)一步惡化。因擔(dān)心疫情失控及對(duì)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)產(chǎn)生影響，1962 年5 月葡萄牙啟動(dòng)ASF 疫苗田間試驗(yàn)[6]。

2 弱毒疫苗株背景

20 世紀(jì)60 年代葡萄牙使用的疫苗株為細(xì)胞傳代致弱株。因年代久遠(yuǎn)，現(xiàn)有資料已無法準(zhǔn)確找到該疫苗株詳細(xì)信息。目前普遍認(rèn)為，該疫苗株為葡萄牙1960 年分離的里斯本60 毒株（Lisbon 60）或1961 年分離的1455 株（Portuguese isolate 1455）[6]在骨髓細(xì)胞連續(xù)傳代所得。Lisbon60 致弱株接種豬后會(huì)使其出現(xiàn)體溫反應(yīng)，但用接種豬抗凝血再次接種試驗(yàn)豬后，被接種豬無體溫升高和臨床反應(yīng)，且能在第71 天時(shí)抵御口腔強(qiáng)毒感染[7]。另有試驗(yàn)[8]證實(shí)，該致弱株以每頭105TCID50/mL 劑量接種22頭豬后，所有接種豬均健康存活，但在第117 天攻毒后，大部分豬只（17/18）出現(xiàn)體溫反應(yīng)且4 頭死亡。

1455株在骨髓細(xì)胞連續(xù)傳代后毒力逐漸下降。40 代和60 代毒可導(dǎo)致接種豬群非特異性運(yùn)動(dòng)障礙和典型的ASF 癥狀，而60 代毒引起的臨床癥狀明顯減輕，70 代毒已幾乎無法引起運(yùn)動(dòng)障礙并能抵御強(qiáng)毒株攻擊。為找到最佳傳代代次，對(duì)該致弱株的第77 代至第84 代進(jìn)行了大量評(píng)估（最終在第80 代通過評(píng)價(jià)），試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量超過400 頭，每月至少對(duì)3 頭動(dòng)物進(jìn)行一次攻毒評(píng)價(jià)。試驗(yàn)的10個(gè)月內(nèi)，在3～12 月齡的動(dòng)物中均未觀察到明顯的臨床反應(yīng)，沒有死亡發(fā)生。疫苗接種后，有研究[6]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中有不良反應(yīng)的個(gè)體僅占很小的比例，主要是短暫的體溫升高和輕微的運(yùn)動(dòng)障礙，而且更容易在體重較重的動(dòng)物身上觀察到，當(dāng)然有時(shí)也有一些個(gè)體表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的體溫升高。同時(shí)，在疫苗接種動(dòng)物和同群動(dòng)物中沒有看到明顯的臨床癥狀，免疫接種動(dòng)物在免疫后第14 天便可以檢測(cè)到抗體產(chǎn)生[3]。

3 疫苗使用經(jīng)過和后果

20 世紀(jì)60 年代初的實(shí)驗(yàn)室研究證明，葡萄牙1455 株的細(xì)胞傳代致弱株安全可靠[6]，但在臨床應(yīng)用時(shí)卻沒有復(fù)制出實(shí)驗(yàn)室結(jié)果。葡萄牙自1962年5 月18 日開始疫苗田間試驗(yàn)，至6 月15 日，共對(duì)約40 000 頭動(dòng)物進(jìn)行了第一次田間接種試驗(yàn)。在疫苗接種地區(qū)，ASF 疫情先呈現(xiàn)下降趨勢(shì)但又急劇反彈，這促使葡萄牙進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模，至7 月份時(shí)試驗(yàn)數(shù)量達(dá)到頂峰。伴隨著ASF 疫情加劇，截止到1962 年12 月底，葡萄牙南部地區(qū)共有超過55 萬頭豬接種了弱毒疫苗（表2）。

表2 1962 年葡萄牙ASF 疫苗接種情況 單位：頭

疫苗接種后的幾個(gè)月，葡萄牙感染區(qū)域擴(kuò)大了3～6 倍，免疫動(dòng)物死亡率達(dá)到10%～50%，且病癥出現(xiàn)時(shí)間大幅延后[9-10]。經(jīng)初步統(tǒng)計(jì)，在55 萬多頭接種疫苗的豬群中，有3.4%出現(xiàn)了ASF 發(fā)病（包括接種后3 周內(nèi)發(fā)病的豬），另有7%出現(xiàn)了可能與疫苗接種有關(guān)的疾病，如仔豬呼吸系統(tǒng)疾病、肌肉骨骼疾病、流產(chǎn)、死產(chǎn)或仔豬早期死亡以及泌乳期的泌乳障礙等。這些發(fā)病豬發(fā)展到晚期時(shí)還會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥，如肺炎、皮膚壞死、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥或妊娠期疾病、動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩、食物加工（消化）指數(shù)下降和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。在這些晚期并發(fā)癥中，肺部疾病是最嚴(yán)重的，在伊比利亞型幼年病例和某些地區(qū)的病例中，還出現(xiàn)較嚴(yán)重的皮膚壞死。所有這些疫苗接種后的并發(fā)癥在伊比利亞種的豬中出現(xiàn)更為嚴(yán)重和頻繁，但在純種和雜交豬中出現(xiàn)頻率較低（杜洛克-澤西品種除外，該品種對(duì)ASF 疫苗高度敏感）。

因免疫接種數(shù)量眾多（55 萬多頭），難以詳細(xì)記錄接種豬反應(yīng)，葡萄牙對(duì)貝雅（de Beja）地區(qū)接種的1 247 個(gè)畜群（共計(jì)128 684 頭）進(jìn)行了較詳細(xì)記錄，總結(jié)如下[6]。

3.1 接種后ASF 發(fā)生情況

因疫苗接種時(shí)正處于ASF 流行期，故理論上認(rèn)為，疫苗接種后3 周內(nèi)發(fā)病的應(yīng)屬于潛伏期感染豬，不應(yīng)作為疫苗評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)（因?qū)嶒?yàn)室數(shù)據(jù)顯示疫苗接種不發(fā)?。Ｊ聦?shí)也發(fā)現(xiàn)，在1 247 個(gè)接種疫苗的畜群中，共有55 個(gè)畜群出現(xiàn)了ASF，其中43個(gè)畜群在疫苗接種21 d 內(nèi)發(fā)病，12 個(gè)畜群在疫苗接種21 d 后發(fā)?。? 個(gè)畜群來自最近暴發(fā)過ASF的農(nóng)場(chǎng)，另外4 個(gè)畜群感染原因可能是與受感染豬群同圈飼養(yǎng)，表3）。由此推斷，接種疫苗21 d 后，ASF 的群體發(fā)病率為0.96%（12/1 247），個(gè)體發(fā)病率為1.05%（1 356/128 684）。

表3 疫苗接種后ASF 發(fā)病畜群數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2 仔豬及育肥豬接種后并發(fā)癥情況

在接種疫苗1 個(gè)月后，對(duì)各月齡的接種豬進(jìn)行觀察。在觀察的69 658 頭動(dòng)物中，大約有12.1%（8 441/69 658）出現(xiàn)了呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、肌肉骨骼和皮膚問題，7%～17%的接種豬因上述問題死亡（未斷奶仔豬、3～6 月齡、6～12 月齡、12月齡以上豬死亡率分別為16.9%，10.8%，9.3%，7.0%），見表4。

表4 疫苗接種后仔豬及育肥豬并發(fā)癥發(fā)病情況

3.3 母豬接種后并發(fā)癥情況

試驗(yàn)記錄表明某些畜群接種后出現(xiàn)流產(chǎn)情況非常頻繁，而未接種畜群則很少出現(xiàn)。流產(chǎn)在妊娠期間的不同時(shí)間均可發(fā)生，可發(fā)生在早期、中期或晚期。這可能取決于給懷孕母豬注射疫苗的時(shí)間，以及疫苗本身和農(nóng)場(chǎng)所固有的條件。在某些情況下，接種疫苗后可能出現(xiàn)死胎或早產(chǎn)仔豬畸形，然而這些情況隨下一次妊娠而消失。母畜不孕癥也有發(fā)生，特別是在接種疫苗后不久就交配的情況下，但這一情況也隨下一次交配妊娠而消失。由于以上不確定原因，葡萄牙禁止對(duì)所有母豬接種ASF 疫苗。

3.4 并發(fā)癥實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)情況

因疫苗接種后比較容易觀察到的并發(fā)癥是皮膚問題或肺部損傷，故研究者對(duì)這兩種樣本進(jìn)行了病毒檢測(cè)，結(jié)果未從皮膚樣本中分離到ASF 病毒（ASFV）。更多情況下皮膚壞死由膿桿菌引起（膿桿菌在葡萄牙廣泛分布），有時(shí)也會(huì)從皮膚樣本中分離到其他細(xì)菌，如化膿性桿菌、化膿性鏈球菌等。但從肺部病變分離出ASFV 的頻率相對(duì)較高（強(qiáng)毒為主），分離株接種健康易感豬后有可能誘發(fā)ASF 發(fā)生，說明感染的ASF 具有傳染性和致病力。同時(shí)，肺部病料中也能分離到多種細(xì)菌，如多殺性巴氏桿菌、化膿性鏈球菌、葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌）、綠膿桿菌、支氣管敗血性博德桿菌、大腸桿菌和變形桿菌等。

3.5 屠宰場(chǎng)調(diào)查情況

為更深入地分析疫苗接種情況，葡萄牙研究團(tuán)隊(duì)對(duì)1963 年1—3 月免疫接種豬（11 467 頭）和未免疫接種豬（1 078 頭）屠宰后的肺部情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗接種豬中有2 513 頭出現(xiàn)了肺部病變（占21.92%），未疫苗接種豬中有52 頭出現(xiàn)肺部病變（占4.82%）。對(duì)接種過疫苗的伊比利亞型純種（9 384頭）及雜交豬種（1 794頭）進(jìn)行更細(xì)致的比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交豬種與伊比利亞品種豬相比，前葉肺炎的發(fā)病率高，而其他類型肺炎的發(fā)病率低，且不同類型肺炎在兩組動(dòng)物中的差異較大（表5）。

表5 接種疫苗后伊比利亞型純種及雜交豬肺部炎癥發(fā)生比例 %

3.6 二免接種情況

疫苗首次接種7 個(gè)月后部分豬群又出現(xiàn)了ASF 病例。同時(shí)，為評(píng)估疫苗二次接種對(duì)無明顯臨床癥狀豬的影響，葡萄牙對(duì)1962 年6—9 月和1963 年1—3 月期間接種的豬群（73 個(gè)）進(jìn)行了二次疫苗接種。結(jié)果顯示：首次接種無臨床癥狀的19 個(gè)畜群（1 210 頭）重新接種疫苗后，16 個(gè)畜群（1 151 頭）沒有出現(xiàn)并發(fā)癥，1 個(gè)畜群（20 頭）出現(xiàn)ASF，2 個(gè)畜群（6 頭和33 頭）出現(xiàn)死亡病例。首次接種有嚴(yán)重肺炎并發(fā)癥的54 個(gè)畜群重新接種疫苗后，結(jié)果9 個(gè)畜群出現(xiàn)ASF，6 個(gè)畜群出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病，剩余的39 個(gè)畜群（3 611 頭）中3 417 頭豬恢復(fù)健康，但部分豬在1963 年4 月后又出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥。

4 弱毒疫苗使用結(jié)果評(píng)判

葡萄牙20 世紀(jì)60 年代研制的弱毒疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，證實(shí)接種健康、無寄生蟲感染并且營(yíng)養(yǎng)良好的豬只是安全的，即它不會(huì)在接種過該疫苗的豬只或與其接觸過的豬只中引起ASF。而且據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用該疫苗后的最終損失不超過15%。考慮到疫苗接種時(shí)葡萄牙部分地區(qū)豬群健康狀況較差以及該病快速蔓延的惡性進(jìn)程，這一死亡率似乎并不高。但因種種原因，葡萄牙不得不終止ASF 疫苗的大范圍使用。其原因歸根結(jié)底仍是該疫苗臨床使用時(shí)不確定性因素較多，特別是因?yàn)槠咸蜒酪呙缃臃N是在ASF 疫情大流行中進(jìn)行的，接種疫苗的動(dòng)物被飼養(yǎng)在受污染的環(huán)境中，以至于（實(shí)際）感染病毒的劑量可能超過了“疫苗中和病毒”的能力，這直接導(dǎo)致了部分接種豬在疫苗接種后立刻出現(xiàn)呼吸道癥狀，且死亡時(shí)呈現(xiàn)的肺部病變與現(xiàn)場(chǎng)觀察的情況相似。此外，受葡萄牙養(yǎng)殖環(huán)境及豬群健康影響，接種豬可能在6 個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間后開始出現(xiàn)嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥，導(dǎo)致免疫失敗。這些現(xiàn)象與同時(shí)期實(shí)驗(yàn)室攻毒結(jié)果相似[11]，后者證實(shí)接種ASF 弱毒疫苗后，即使沒有強(qiáng)毒株感染，大多數(shù)免疫動(dòng)物仍會(huì)發(fā)生慢性感染且最終死亡率達(dá)到10%～50%。很多病毒攜帶豬雖能長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持健康狀態(tài)，但大多數(shù)最終發(fā)展為慢性肺炎或急性發(fā)病死亡。最終的死亡率可能與弱毒株的殘存毒力、試驗(yàn)動(dòng)物的種屬差異和接種動(dòng)物的生存壓力等密切相關(guān)[12]。

葡萄牙弱毒疫苗毒株擴(kuò)散演化常與伊比利亞半島20 世紀(jì)60—90 年代的ASF 流行相關(guān)聯(lián)，如1968 年分離的自然弱毒株NH/P68 毒株（又稱NHV）經(jīng)推測(cè)可能是葡萄牙疫苗毒演變而來的[13]。此外，同時(shí)期伊比利亞半島可能存在兩個(gè)強(qiáng)毒株流行（Lisbon57 和Lisbon60），這可能也是部分免疫失敗的原因?？偠灾?，葡萄牙弱毒疫苗使用后的并發(fā)癥問題超過了實(shí)驗(yàn)預(yù)期及應(yīng)急準(zhǔn)備，再加上疫苗的超前應(yīng)用可能使得該事件的發(fā)展更加嚴(yán)重，這導(dǎo)致葡萄牙弱毒疫苗的田間大范圍應(yīng)用事件成為“錯(cuò)誤的毒株在錯(cuò)誤的地區(qū)”應(yīng)用失敗的典型案例[3]。

致謝：

葡萄牙里斯本大學(xué)的Carlos Martins 研究員為本文提供了相關(guān)材料。