張彥軍 郭鐵峰△ 杜凱然 劉曉雪 羅林釗 李佳明

腰椎間盤退變性疾病是指由腰椎間盤退變引起的以腰腿疼痛、麻木及無力為主的臨床癥候群[1]。隨著遺傳學及分子生物學研究的進展，已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并提取與腰椎退行性病變相關的特異性基因。目前研究證實主要有COL11A1、COL11A2、COL9A2、HOXB4、BMPRⅡ、Collagen等基因與退行性腰椎管狹窄癥有相關性[2-3]。本院通過大量的臨床觀察研究，發(fā)現(xiàn)腰椎管狹窄癥患者中醫(yī)證型多集中在肝腎虧虛型，故推測肝腎虧虛型腰椎管狹窄與基因多態(tài)性存在一定的關聯(lián)，從而利用中藥調(diào)控其基因，獲得基因的治療靶點，提高中醫(yī)藥治療相關疾病的臨床療效。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

應用臨床流行病學調(diào)查法，隨機抽取甘肅省中醫(yī)院脊柱骨二科2016年6月至2018年6月門診和住院治療的退行性腰椎管狹窄癥患者80例為病例組，以來自甘肅省中醫(yī)院脊柱骨二科門診的80例非腰椎退行性疾患患者為對照組，與病例組匹配。對照組在年齡、性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、勞動強度與病例組相匹配。所有患者影像學資料完整。

1.2 診斷標準

腰椎管狹窄癥診斷標準如下：

1)慢性腰痛史，部分病人有外傷史。

2)多發(fā)生于60歲以上的體力勞動者。

3)長期反復的腰腿痛和間歇性跛行，腰痛在前屈時減輕，在后伸時加重，腿痛多為雙側(cè)，可交替出現(xiàn)，站立和行走時出現(xiàn)腰腿痛或麻木無力，疼痛和跛行逐漸加重，體息后好轉(zhuǎn)。嚴重者可引起尿頻或排尿困難[4]。

4)下肢肌萎縮，腱反射減弱，腰過伸試驗陽性，直腿抬高試驗陽性。

5)腰部 X 線、CT、MRI 檢查見脊柱生理弧度改變，椎間隙變窄，椎體后緣骨質(zhì)增生，后縱韌帶鈣化，小關節(jié)肥大或密度增高，椎弓根肥大、內(nèi)聚，假性椎體滑移。

1.3 中醫(yī)證候判定標準

依據(jù)《中醫(yī)診斷學》制定“COL11A1基因多態(tài)性與退行性腰椎管狹窄癥的多態(tài)性研究”調(diào)查表，中醫(yī)證型包括風寒痹阻型、肝腎虧虛型、氣虛血瘀型[5]。

1.4 納入標準

1)與上述診斷標準相符；

2)年齡在40～70歲之間；

3)患者知情同意，自愿參加本次調(diào)查。

1.5 排除標準

1)不符合上述診斷標準者；

2)合并冠心病、糖尿病、高血壓病等重大內(nèi)科疾病，或患有嚴重的造血系統(tǒng)疾病、精神病等患者；

3)腰椎有結(jié)核、腫瘤、骨折、脫位、嚴重骨質(zhì)疏松、感染、畸形等。

1.6 病例收集

對于調(diào)查者進行為期1周的相關標準培訓，所有納入及排除人群均由培訓人員進行統(tǒng)一的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。在此基礎上，囑患者空腹10 h后，抽取外周血2 mL作為檢測樣本，然后注入含肝素抗凝劑的真空管中混勻，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.7 實驗材料

參考 NCBI等人類基因組SNP庫，用Primer Premier 5.0軟件設計9個基因的11個多態(tài)性SNP位點的PCR引物序列。檢測指標包括COL11A1、HBOX4基因的2個位點，即rs14637185和rs520540位點，引物由甘肅生物制劑公司合成[6]。

1.8 試驗方法

1.8.1DNA的提取 抽取外周靜脈血抗凝離心后，常規(guī)QIAampDNABloodMini試劑盒提取DNA。

1.8.2PCR擴增 COL11A1引物(正向5′-GACTAT-CCCCTCTTCAGAACTGTTAAC-3′；反向5′-CTTCTAT-CAAGTGGTTTCGTGGTTT-3′)[7]；HBOX4引物(5′-AC-TACAATCGCTACCTGACGC-3′；反向5′-TTGGGCAA-CTTGTGGTCTT-3′)。PCR反應體系：Premix ExTaq 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 4 μL，滅菌三蒸水17 μL，總體積50 μL。初始變性為5 min/95 ℃[8]；6個接地時間分別是30 s/95 ℃，45 s/62 ℃或64 ℃(初始退火溫度)，每個周期降低1 ℃，并降低45 s/72 ℃；另外30個周期分別是30 s/95 ℃，45 s/56 ℃或58 ℃(最終目標退火溫度)和45 s/72 ℃；最后延長7 min/72 ℃。然后使用核酸外切酶Ⅰ和蝦堿性磷酸酶(GE Healthcare，Piscataway，美國新澤西州)純化PCR產(chǎn)物[9]，所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8.3PCR擴增產(chǎn)物酶切 COL11A1基因6p21.3位點PCR擴增產(chǎn)物在37 ℃溫水放置30 min。COL11A1基因6q21.3位點酶切產(chǎn)物：將配置完成的1.5%瓊脂糖凝膠和5 μL DL500 DNA 標記物分別加入樣品槽中，標記號為1。取10×QuickCut Green Buffer直接進行電泳檢測，另取5 μL酶切產(chǎn)物依次加入瓊脂凝膠板的其他樣品槽中，用1×TEB緩沖液進行稀釋。而后設定125 V，電流保持在80 mA以上進行電泳分離。當溴酚藍條帶距離前沿2 cm，5 μL DL500 DNA 標記物條帶分散則可停止電泳，用拍照系統(tǒng)拍照觀察。COL11A1基因6p21.3位點G被T取代，形成GT、GG、TT 3種等位基因。用同上方法HBOX4基因17q21位點T被C取代，形成TT、CT、CC 3種等位基因。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。用χ2檢驗分析各基因型及等位基因分布差異，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

納入研究的患者共80例，簽署知情同意書，其中對照組年齡40～70歲，中位數(shù)58歲；病程6～22個月，中位數(shù)15個月；病例組年齡40～70歲，中位數(shù)59歲；病程7～26個月，中位數(shù)14個月。兩組患者的一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。疾病分型：病例組與對照組分別分為風寒痹阻型、肝腎虧虛型、氣虛血瘀型。兩組數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2，證實腰椎管狹窄癥患者與肝腎陰虛型患者具有一定相關性。

表1 腰椎管狹窄癥與非腰椎管狹窄癥患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較

表2 腰椎管狹窄癥與非腰椎管狹窄癥三種中醫(yī)證型比較(例)

2.2 兩組患者COL11A1基因多態(tài)性比較

選擇COL11A1基因位點rs14637185基因型頻率和等位基因型頻率，在兩組患者中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3，提示COL11A1基因多態(tài)性與腰椎管狹窄的患病率存在一定的關聯(lián)性。

表3 對照組與病例組6p21.3 C/G基因型和等位基因頻率比較[例(%)]

將病例組COL11A1基因與6p21.3 GG、CG、C、G基因頻率肝腎虧虛型、非肝腎虧虛型與對照組進行比較，其中肝腎虧虛型、非肝腎虧虛型與對照組的COL11A1各基因型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4；肝腎虧虛型、非肝腎虧虛型和對照組等位基因差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 COL11A1基因與6p21.3 GG、CG、C、G基因頻率在腰椎管狹窄證中不同證候的分布[例(%)]

將病例組HBOX4位于17q21的rs520540位點TT、CT、CC 3種基因型與對照組進行比較(P<0.05)見表5，病例組C、T 2種等位基因與對照組比較(P<0.05)見表5。將病例組HBOX4基因與17q21的rs520540位點GG、CG、C、G基因頻率肝腎虧虛型、非肝腎虧虛型與對照組進行比較，其中肝腎虧虛型、非肝腎虧虛型與對照組的HBOX4各基因型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6；肝腎虧虛型、非肝腎虧虛型與對照組等位基因差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6。

表5 對照組與病例組HBOX4位于17q21的rs520540位點TT、CT、CC、C、T基因型和等位基因頻率比較[例(%)]

表6 HBOX4基因與17q21的rs520540位點GG、CG、C、G基因頻率在腰椎管狹窄癥中不同證候的分布[例(%)]

3 討論

腰椎管狹窄癥最常見的類型是由脊柱并發(fā)疾病，例如小關節(jié)骨關節(jié)炎和椎間盤退變疾病引起的，高發(fā)人群主要集中在50～70歲年齡段，男性多于女性。Deer等[10]發(fā)現(xiàn)腰椎管狹窄癥患者有95%出現(xiàn)腰痛、背痛和坐骨神經(jīng)痛，并出現(xiàn)間歇性神經(jīng)源性跛行，也稱為假性跛行，即患者行走一段時間后雙下肢疼痛比腰背部疼痛更為嚴重，但休息后疼痛可迅速緩解。91%的人群出現(xiàn)雙下肢痿軟、無力，生活不便，甚至會出現(xiàn)截癱及大小便失禁等情況[10-12]。目前，多數(shù)研究者認為退行性腰椎管狹窄癥為復雜疾病，又稱為多因子病，其遺傳模式屬于多基因效應。遺傳因素可能通過多種機制影響椎間盤退變，如影響脊柱結(jié)構(gòu)的大小和形態(tài)，進而影響脊柱的力學結(jié)構(gòu)，導致對外力作用的不耐受等。為分析基因變異及多態(tài)性對退行性腰椎管狹窄癥的影響，大量研究關注于對脊柱穩(wěn)定性具有重要作用的結(jié)構(gòu)軟骨蛋白編碼基因?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有聚集蛋白聚糖的突變及功能多態(tài)性，維生素D受體和膠原蛋白基因影響Ⅸ型膠原蛋白合成。實驗研究顯示在動物模型中Ⅸ型及Ⅱ型膠原蛋白改變與臨床表型具有關聯(lián)性。近期的研究主要集中在Ⅸ型膠原蛋白編碼在a2及a3鏈上的膠原蛋白基因COL9A2和COL9A3。1999年Annunen首次對COL9A2等位基因突變體與椎間盤退變疾患的關聯(lián)性進行研究，并證實COL9A2基因突變是導致椎間盤退變的重要因素，COL9A2基因Trp2突變占腰椎退行性疾患的芬蘭人群的3.8%，而正常組未見有此等位基因。這一結(jié)果同樣得到Wu等[13]的證實[13]，他們發(fā)現(xiàn)在有臨床癥狀及放射學表現(xiàn)的腰椎退行性疾患的患者中等位基因?qū)Ρ冗z傳模型下，COL9A2與亞洲人群的腰椎退行性疾患風險相關。Higashino等[14]觀察到COL9A2基因Trp2等位基因發(fā)生率在芬蘭人群中相對較高，并且進一步探討基因突變對疾病臨床表型的影響，發(fā)現(xiàn)在控制組中有很高的自由性。除此之外，Wang等[15]通過轉(zhuǎn)基因大鼠模型研究，顯示Ⅸ型膠原蛋白的缺失將導致椎間盤的退變及椎間盤突出。

膠原蛋白(Collagen)為人和哺乳動物體內(nèi)含量最為豐富的蛋白質(zhì)(占人體蛋白質(zhì)總量的25%)，是細胞外基質(zhì)中最重要的纖維蛋白。已有不少研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白家族基因與退行性腰椎管狹窄癥發(fā)病可能有關聯(lián)性。膠原11A2(COL11A2)基因定位于6p21.3，表達于軟骨中。在某些退行性腰椎管狹窄癥術(shù)后樣本的組化分析中，曾發(fā)現(xiàn)COL11A2過表達。Koga等研究了53個日本退行性腰椎管狹窄癥家系的124例患病同胞對(affected sib-pair)和212例健康對照個體，發(fā)現(xiàn)COL11A2基因的4個SNP：啟動子第-182位的A>C，第6內(nèi)含子第636位的T>A，第43外顯子的A>G，第46外顯子的C>T，均與退行性腰椎管狹窄癥強烈關聯(lián)。有研究者研究了COL11A2 第43外顯子的A>G與第46外顯子的C>T兩個SNP位點rs712702754和rs377233986。2003年，Tanaka等分析了70個日本退行性腰椎管狹窄癥家系的142例患病同胞對和298例健康對照個體，發(fā)現(xiàn)3個與退行性腰椎管狹窄癥發(fā)病相關的SNP：第2 內(nèi)含子的+18、第32內(nèi)含子的-29以及第33內(nèi)含子的+20。COL6A1基因多態(tài)性可能有增加骨量的功能。COL6A1第21內(nèi)含子的+18(rs143695871)是本研究進行檢測的SNP位點之一，并未發(fā)現(xiàn)與退行性腰椎管狹窄癥有顯著的關聯(lián)性。通過之前研究發(fā)現(xiàn)關于COL11A1基因與6p21.3的rs14637185，發(fā)現(xiàn)C等位基因與腰椎管狹窄癥存在一定的相關性，由此可表明C的等位基因?qū)е卵甸g盤突出癥的風險因素更高[16-17]。以上分析可推理COL11A1的位點6p21.3 rs14637185與腰椎管狹窄癥存在一定的相關性。

本研究結(jié)果顯示COL11A1基因與6p21.3 G/T位點多態(tài)性與腰椎管狹窄癥之間存在一定關聯(lián)性。本研究選取了COL11A1的一個SNP位點rs14637185，發(fā)現(xiàn)腰椎管狹窄患者的COL11A1基因型頻率和等位基因型頻率均高于非腰椎疾患的患者，但從中繼續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn)COL11A1基因的多態(tài)性與肝腎虧虛型腰椎管狹窄癥患者均有明顯的相關性。由此則可證明腰椎椎管狹窄癥患者犯病率高有可能與COL11A1基因GG、GT、TT等位基因多態(tài)性有密切關系，可推測出藥物抑制其細胞內(nèi)的基因(如COL11A1等類似基因)，可延緩甚至治療腰椎管狹窄癥患者，以避免手術(shù)，從而減輕患者的痛苦及經(jīng)濟負擔。又根據(jù)研究證實HBOX4基因的表達可防治腰椎退行性病變，本次實驗對HBOX4基因17q21的rs520540位點等位基因頻率和基因型頻率進行檢測，再次證實其具有一定相關性。通過研究發(fā)現(xiàn)HBOX4等位基因C、T基因表達頻率高低與患有腰椎管狹窄癥的概率存在一定的相關性，則患有腰椎管狹窄癥患者HBOX4等位基因C、T的表達量低于非腰椎管狹窄癥患者。對COL11A1、HBOX4兩種基因分別觀察其與肝腎虧虛型之間的關系，發(fā)現(xiàn)肝腎虧虛型與兩種基因的表達量均存在相關性。由此可推測運用補肝腎、強筋骨的中藥，可通過調(diào)控兩種基因的表達頻率，一定程度上可防治腰椎管狹窄癥。目前本團隊根據(jù)此實驗結(jié)果，針對肝腎虧虛型腰椎管狹窄癥患者研制相關院內(nèi)制劑，以期望對防治腰椎管狹窄癥有一定臨床療效，切實發(fā)揮中醫(yī)藥獨特優(yōu)勢。

有研究證實有2個可能的新脊柱退行性疾病易感基因PTCH1和COL17A1[18]，2006年Seppane 等報道COL17A1蛋白存在于人的大腦神經(jīng)元中，可能涉及各種影響神經(jīng)元的遷移或突觸可塑性疾病[19]。2007年Murrell等發(fā)現(xiàn)COL17A1 突變雜合子有牙釉質(zhì)缺乏，提示COL17A1蛋白合成量降低或發(fā)生突變的蛋白雖然可以維持真皮-表皮的穩(wěn)定性，但會引起牙齒發(fā)育的異常[20]。COL6A1基因多態(tài)性可能與胸椎后縱韌帶骨化的發(fā)病有關[21]。隨著科研水平的提高，基因研究也在不斷深入，本團隊將繼續(xù)圍繞膠原蛋白家族，探索其與腰椎管狹窄癥等骨科常見病間的關聯(lián)性，擴充病例數(shù)，增加樣本量，深入剖析其分子生物學機制，尋找治療相關疾病的新靶點，從而服務于臨床，應用于臨床，切實為患者減輕痛苦。