謝宇宙， 付偉， 閆超杰， 王智， 朱鵬宇， 任永超， 張永， 相寧*

1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100176；2.中華人民共和國(guó)錦州海關(guān)，遼寧錦州121013；3.貴州省黔南布依族苗族自治州檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州都勻558000

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因貿(mào)易安全和有序進(jìn)行的重要保障。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸分子檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)最為直接、有效的方法。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸分子檢測(cè)技術(shù)的不斷創(chuàng)新與進(jìn)步是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全監(jiān)管的重要支撐。目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸檢測(cè)技術(shù)主要分為PCR 檢測(cè)技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)兩大類(lèi)，這兩類(lèi)技術(shù)存在依賴(lài)儀器、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等局限，一定程度上阻礙了口岸對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管工作。因此，開(kāi)發(fā)出無(wú)需儀器、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)有利于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管工作質(zhì)量的進(jìn)一步提升。

基因組編輯技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一類(lèi)遺傳修飾技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因敲入和引入精細(xì)突變[1]，而基因編輯技術(shù)的代表技術(shù)——CRISPR/Cas 技術(shù)，自問(wèn)世以來(lái)，掀起了生物學(xué)界的一場(chǎng)技術(shù)革命，對(duì)生物技術(shù)發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫防御系統(tǒng)，用來(lái)對(duì)抗入侵細(xì)菌的外源DNA、質(zhì)粒和噬菌體[2]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)除了被應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域，也逐漸被應(yīng)用于核酸分子檢測(cè)領(lǐng)域，不斷展現(xiàn)出高特異性、高靈敏度、無(wú)需儀器、快速準(zhǔn)確等突出優(yōu)勢(shì)[3]。本文總結(jié)了近年來(lái)CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢測(cè)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展，并介紹了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀，同時(shí)對(duì)CRISPR/Cas 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上的前景加以展望，旨在為相關(guān)人員將CRISPR/Cas 技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域而進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出適合于口岸現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的新型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸檢測(cè)技術(shù)提供參考。

1 CRISPR/Cas檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

細(xì)菌體內(nèi)的CRISPR/Cas 系統(tǒng)在對(duì)抗外源DNA、質(zhì)粒和噬菌體等入侵時(shí)，首先將入侵者DNA 整合到自身CRISPR 序列中，然后將CRISPR序列轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng) RNA 前體（pre-crispr RNA，pre-crRNA），并進(jìn)一步切割成短RNA（CRISPR RNA，crRNA），最后形成導(dǎo)向 RNA（single-guide RNA，sgRNA）[4]。sgRNA 能夠在細(xì)菌下次受到入侵時(shí)識(shí)別入侵者的核酸，并引導(dǎo)Cas 核酸酶切割入侵者的核酸[5]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為兩類(lèi)，第1類(lèi)CRISPR/Cas 系統(tǒng)Cas 核酸酶由多個(gè)Cas 蛋白組成，分為Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ3 種亞型，第2 類(lèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)Cas 核酸酶為單個(gè)Cas 蛋白，分為Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ3 種亞型[6]。張鋒團(tuán)隊(duì)于2015 年發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)新的2類(lèi)效應(yīng)蛋白（C2c1、C2c2 和 C2c3）[7]，同年發(fā)現(xiàn)C2c2-crRNA 在匹配到靶RNA 后，除剪切匹配的靶RNA 外，還能非特異性地剪切環(huán)境中的單鏈RNA[3]，這個(gè)發(fā)現(xiàn)為其他研究人員利用Cas 蛋白體外非特異性切割核酸特性進(jìn)行檢測(cè)提供了基礎(chǔ)[8]。截至目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)里有三類(lèi)單一效應(yīng)蛋白（Cas12、Cas13 和 Cas14）被報(bào)道具有非特異性切割核酸特性，并被用于檢測(cè)，加上原本的Cas9 蛋白，目前已經(jīng)有4 種Cas 蛋白被用于檢測(cè)領(lǐng)域。

1.1 基于Cas9的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)屬于 2 類(lèi) Cas 系統(tǒng)Ⅱ型，能夠由RNA 引導(dǎo)精準(zhǔn)切割特定序列的DNA。利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性切割的特性，可以作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的“開(kāi)關(guān)”，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸序列的檢測(cè)。Pardee 等[9]于2016 年首次將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)運(yùn)用到檢測(cè)中，他們將等溫toehold 生物傳感技術(shù)與CRISPR/Cas9 結(jié)合，通過(guò)觀察紙盤(pán)顏色的變化可以實(shí)現(xiàn)在3 h 內(nèi)對(duì)寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）美 洲 株 和 非 洲 株 的 分型（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9體外分型寨卡病毒流程圖[9]Fig.1 Flow chart of CRISPR/Cas9 in vitro typing of Zika virus[9]

在邁出第一步后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與其他技術(shù)結(jié)合，被更廣泛的用于檢測(cè)領(lǐng)域。CRISDA（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplifi cation method）技術(shù)是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在分子檢測(cè)領(lǐng)域的又一進(jìn)步，該技術(shù)利用CRISPR/Cas系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas9在與靶核酸分子結(jié)合過(guò)程中獨(dú)特的構(gòu)象變化，作為鏈取代等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的“開(kāi)關(guān)”，高效啟動(dòng)針對(duì)靶核酸分子的指數(shù)倍擴(kuò)增，成功檢測(cè)出人基因組中乳腺癌相關(guān)的單核苷酸位點(diǎn)突變，并在野生型大豆中成功檢測(cè)出萬(wàn)分之三的轉(zhuǎn)基因大豆。相比于傳統(tǒng)PCR 和其他等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)有以下幾大優(yōu)勢(shì)：①能夠?qū)崿F(xiàn)aM（10-18mol·L-1）水平的高靈敏度；②達(dá)到了區(qū)分單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的特異性；③其引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，對(duì)新位點(diǎn)的檢測(cè)反應(yīng)體系開(kāi)發(fā)迅速；④在90 min 內(nèi)無(wú)需儀器、無(wú)需溫度變化即可完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程[10]。Huang 等[11]也將 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction）技術(shù)，成功用于達(dá)到單堿基分辨率的DNA 甲基化和單核細(xì)胞增生李斯特菌總RNA 檢測(cè)。除核酸檢測(cè)技術(shù)外，將CRISPR/dCas9 系統(tǒng)和石墨烯膜場(chǎng)效應(yīng)晶體管技術(shù)結(jié)合起來(lái)也可用于檢測(cè)。以石墨烯膜為基礎(chǔ)的晶體管上載有dCas9（只有識(shí)別功能，沒(méi)有剪切功能）和sgRNA 的復(fù)合體，當(dāng)樣品滴加到膜上，一旦dCas9-sgRNA 識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的靶DNA 分子，晶體管就發(fā)出一個(gè)電信號(hào)，不需要擴(kuò)增樣本DNA 便能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)，但檢測(cè)過(guò)程需要特定的儀器，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[12]。

1.2 基于Cas13的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

Cas13a 蛋白屬于 2 類(lèi)系統(tǒng)Ⅵ型，由 RNA 引導(dǎo)并切割RNA，由張鋒團(tuán)隊(duì)于2015 年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被命名為C2c2 蛋白[7]。張鋒團(tuán)隊(duì)于2016 年發(fā)現(xiàn)，C2c2/Cas13a 蛋白在crRNA 的指導(dǎo)下匹配到靶標(biāo)RNA 后，不僅可以切割靶標(biāo)RNA，還可以非特異性地剪切環(huán)境中的其他單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）（圖 2）[8]。Doudna 團(tuán)隊(duì)于 2016 年首次將C2c2/Cas13a 蛋白非特異性切割RNA 特性與熒光報(bào)告RNA 結(jié)合，利用C2c2/Cas13a 蛋白在匹配到靶標(biāo)RNA 后非特異性切割環(huán)境中的熒光報(bào)告RNA 分子進(jìn)而釋放出熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的觀察實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)RNA 的檢測(cè)，并采用該技術(shù)成功檢測(cè)了噬菌體RNA，靈敏度能夠達(dá)到0.01 nM（10-9mol·L-1）[8]。

圖2 Cas13a蛋白非特異性切割RNA模型[8]Fig.2 Cas13a protein non-specific cleavage of RNA model[8]

張鋒團(tuán)隊(duì)于2017 年將Cas13a 系統(tǒng)非特異性切割核酸原理與重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)相結(jié)合設(shè)計(jì)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）技術(shù)，該技術(shù)首先采用RPA 擴(kuò)增DNA 或逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）技術(shù)擴(kuò)增RNA，然后對(duì)DNA 產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，最后采用Cas13a-crRNA與熒光報(bào)告RNA檢測(cè)轉(zhuǎn)錄得到的RNA（圖3），并利用SHERLOCK 技術(shù)成功檢測(cè)出了待測(cè)尿液樣本中濃度低至每微升含單一拷貝的寨卡病毒[13]。通過(guò)引入RPA 技術(shù)，SHERLOCK 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核酸的等溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)大幅提高了靈敏度，最低能夠檢測(cè)到aM 水平的核酸。隨后，張鋒團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步改善了SHERLOCK 技術(shù)，在多重化方面，他們挑選了來(lái)自2個(gè)不同菌株的Cas13a 和來(lái)自2 個(gè)不同菌株的Cas13b，構(gòu)建出一個(gè)單管體系擁有4 個(gè)通道的多重分析方法。在定量化方面，他們將引物系列稀釋?zhuān)业搅撕线m的引物濃度（240 nmol·L-1），改進(jìn)后的 SHERLOCK技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)低至2 aM 的靶標(biāo)核酸定量檢測(cè)。在去熒光方面，張鋒團(tuán)隊(duì)將金標(biāo)免疫層析技術(shù)與SHERLOCK 技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)試紙條顏色的變化來(lái)獲取結(jié)果[14]。Myhrvold 等[15]在 SHERLOCK技術(shù)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）技術(shù)，該技術(shù)先通過(guò)加熱滅活了核酸酶與病毒，然后通過(guò)熒光顯色或金標(biāo)免疫層析的顏色變化實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者的血清、唾液或尿樣中的塞卡病毒RNA 的高靈敏度與即時(shí)檢測(cè)。在新冠病毒爆發(fā)后，張鋒團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了針對(duì)新冠病毒的檢測(cè)技術(shù)STOPCovid.V2，該技術(shù)采用LAMP 技術(shù)擴(kuò)增RNA，并找到了在LAMP 溫度下仍能保持足夠切割活性的Aap-Cas12b（Alicyclobacillus acidophilus Cas12b）酶，使得整個(gè)反應(yīng)能在同一溫度（60 ℃）、同一管內(nèi)完成，檢測(cè)下限低至100 個(gè)新冠病毒RNA 分子，靈敏度達(dá)到了93.1%，特異性達(dá)到了98.5%，整個(gè)流程只需15～45 min[16]。

圖3 SHERLOCK檢測(cè)原理[17]Fig.3 SHERLOCK detection principle[17]

1.3 基于Cas12的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

Cas12a（舊稱(chēng) Cpf1）屬于 2 類(lèi)系統(tǒng)Ⅴ型，由RNA 引導(dǎo)并負(fù)責(zé)切割單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），由張鋒團(tuán)隊(duì)于 2015 年發(fā)現(xiàn)[18]。Doudna 團(tuán)隊(duì)于2018 年發(fā)現(xiàn)了Cas12a 非特異性切割活性，Cas12a-crRNA 復(fù)合體在識(shí)別單鏈或雙鏈靶標(biāo)DNA 后，能夠剪切靶DNA 和非特異性地剪切環(huán)境中的ssDNA。隨后，該團(tuán)隊(duì)將RPA 技術(shù)與Cas12a 相結(jié)合，設(shè)計(jì)了新的CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)，命名為DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）。與 SHERLOCK 相比，DETECTR 減少了從擴(kuò)增后的DNA 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄到RNA這一步，直接采用RPA 等溫?cái)U(kuò)增待測(cè)DNA，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a-crRNA 復(fù)合體混合，識(shí)別并匹配靶標(biāo)DNA，并啟動(dòng)Cas12a 的非特異核酸酶活性，對(duì)反應(yīng)體系中的熒光報(bào)告DNA 探針進(jìn)行切割，釋放出熒光信號(hào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)DNA 的檢測(cè)（圖 4）[17]。DETECTR 技術(shù)同時(shí)能夠達(dá)到 aM 水平的靈敏度和小于等于7 個(gè)堿基的特異性，Doudna 團(tuán)隊(duì)采用DETECTR 技術(shù)在1 h 內(nèi)便準(zhǔn)確地檢測(cè)出了臨床患者樣本中的HPV16和HPV18并成功對(duì)其進(jìn)行分型[19]。

圖4 DETECTR檢測(cè)原理[17]Fig.4 DETECTR detection principle[17]

與此同時(shí)，Li 等[20]也開(kāi)發(fā)了與RPA 技術(shù)結(jié)合的Cas12a 檢測(cè)方法，命名為HOLMES（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system），該方法可靈敏、特異、快速的實(shí)現(xiàn)SNP 分型、DNA 病毒和 RNA 病毒的檢測(cè)。Li 等[21]發(fā)現(xiàn) 2 類(lèi)Ⅴ型的Cas12b（C2c1）蛋白也具有非特異性切割能力，通過(guò)將其與LAMP 技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了HOLMESv2檢測(cè)技術(shù)，統(tǒng)一了二者的反應(yīng)溫度，實(shí)現(xiàn)了快速一體化檢測(cè)。Broughton等[22]將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技術(shù)、側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)技術(shù)與DETECTR 技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)出采用試紙條從呼吸拭子RNA 提取物中檢測(cè)新冠病毒的方法，可在40 min內(nèi)完成整個(gè)流程，特異性達(dá)到了95%，為當(dāng)前基于實(shí)驗(yàn)室儀器的熒光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）新冠病毒檢測(cè)方法提供了更為直觀、快速的替代方法。

1.4 基于Cas14的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

Doudna 團(tuán)隊(duì)在Cas12a 之后找到的新的Cas蛋白——Cas14，屬于2 類(lèi)系統(tǒng)Ⅴ型，靶向ssDNA，在激活后剪切靶ssDNA 和非特異性地剪切環(huán)境中的ssDNA。Cas14 蛋白的大小大約只有其他2類(lèi)CRISPR 效應(yīng)蛋白的一半，靶標(biāo)序列沒(méi)有前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的限制，所以可以靶向任何序列，并且對(duì)識(shí)別序列中間的堿基的要求很?chē)?yán)格，有1 個(gè)錯(cuò)配就不能結(jié)合，特異性能達(dá)到單堿基。Doudna 團(tuán)隊(duì)仿照DETECTR 技術(shù)設(shè)計(jì)了 Cas14-DETECTR 檢測(cè)技術(shù)，但由于 Cas14-sgRNA 只識(shí)別 ssDNA，因此在 RPA 擴(kuò)增時(shí)，需要對(duì)引物進(jìn)行修飾，降解雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）中的一條鏈，得到ssDNA。Doudna 團(tuán)隊(duì)通過(guò)從藍(lán)眼和棕眼人類(lèi)的唾液中提取DNA 并擴(kuò)增，然后采用Cas14-DETECTR檢測(cè)技術(shù)成功區(qū)分出藍(lán)眼和棕眼的基因型，特異性達(dá)到單堿基（控制2種顏色眼睛的基因序列中只有1個(gè)堿基差異），同時(shí)實(shí)現(xiàn)了aM水平的靈敏度[23]。

綜上所述，基于不同效應(yīng)蛋白研發(fā)的CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)具有不同特性，具體見(jiàn)表1，可在實(shí)際應(yīng)用中根據(jù)需求進(jìn)行選擇。

表1 CRISPR/Cas檢測(cè)技術(shù)比較分析Table 1 Comparative analysis of CRISPR/Cas detection technologies

2 CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)展

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指通過(guò)體外重組DNA 技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入到生物體的細(xì)胞或組織中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)引起生物體性狀的可遺傳性修飾，從而使再生生物體獲得新的遺傳特性。截止到2019年，轉(zhuǎn)基因作物種植面積比1996年增加了約112 倍，累計(jì)種植面積達(dá) 27 億 hm2[24]。然而，隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化，其對(duì)生態(tài)環(huán)境與人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)尚存在疑問(wèn)，因此需要對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)管[25]。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)與管理的重要技術(shù)保障。

2.1 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同主要分為兩類(lèi)，即針對(duì)外源核酸特定序列的檢測(cè)技術(shù)與針對(duì)外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)。

針對(duì)外源核酸特定序列的檢測(cè)技術(shù)是檢測(cè)植物外源插入序列最直接、最有效的方法[26]，可分為PCR 檢測(cè)技術(shù)與LAMP 技術(shù)兩大類(lèi)。PCR 檢測(cè)技術(shù)包括定性PCR 和定量PCR，定性PCR 中常用的有普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定性PCR、巢式和半巢式PCR 與多重PCR[27]，定量PCR 中常用的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR 與數(shù)字PCR[28]。PCR 檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性或定量檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。LAMP 技術(shù)是Notomi等[29]在2000年開(kāi)發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，其擴(kuò)增過(guò)程不需要特殊儀器和溫度循環(huán)，且兼具成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高與產(chǎn)物易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適合用于現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)。

針對(duì)外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源蛋白表達(dá)情況的直接方法，其基本原理是將表達(dá)的外源蛋白作為抗原，利用其與抗體特異性結(jié)合以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測(cè)，主要包括蛋白免疫印跡雜交技術(shù)（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）與免疫試紙條檢測(cè)技術(shù)。相比于核酸檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)可以更加直接的檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)情況，其中，免疫試紙條技術(shù)還可以作為現(xiàn)場(chǎng)初篩技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、迅速，成本低廉[30]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)一步商業(yè)化，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)逐漸成為全球轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易的重要支撐。盡管目前針對(duì)核酸的檢測(cè)技術(shù)與針對(duì)外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中，但這些技術(shù)都有自身的局限性。PCR檢測(cè)技術(shù)受到反應(yīng)過(guò)程中溫度循環(huán)的限制，需要特定的儀器才可以完成檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[31]。LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)十分復(fù)雜，并且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物處理不當(dāng)容易造成DNA 污染，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[32]。針對(duì)外源蛋白的檢測(cè)技術(shù)，除免疫試紙條技術(shù)外，均需要依賴(lài)特定的儀器，操作復(fù)雜，同樣難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而免疫試紙條技術(shù)只能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中表達(dá)的外源蛋白，無(wú)法針對(duì)核酸，并且靈敏度較低，對(duì)于深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（如大豆油等），因其外源蛋白含量低、抗原性差，采用免疫試紙條技術(shù)檢測(cè)時(shí)的準(zhǔn)確性較低[30]。因此，亟待開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)核酸的快速、高效、成本低廉的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)，彌補(bǔ)當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)體系中現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)的不足。

2.2 CRISPR/Cas 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上的應(yīng)用

近幾年，CRISPR/Cas 技術(shù)在檢測(cè)領(lǐng)域中迅速發(fā)展，也被逐漸應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域。Wu等[33]利用Cas12a 系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了一套針對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子的可視化檢測(cè)方法，該方法以轉(zhuǎn)基因大豆（RoundupReady?）粉中的CaMV35S 啟動(dòng)子作為檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的crRNA，首先通過(guò)LAMP 技術(shù)擴(kuò)增靶序列，然后將CRISPR/Cas12a 熒光系統(tǒng)與擴(kuò)增產(chǎn)物在37 ℃下混合5 min，在紫外光（254 nm）下就可以用肉眼清楚地識(shí)別出檢測(cè)結(jié)果，成功檢測(cè)到大豆粉中低至0.05%的轉(zhuǎn)基因含量。Zhang等[34]結(jié)合了Cas12a系統(tǒng)、濾紙條基因組提取技術(shù)、RPA 技術(shù)、側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)出針對(duì)水稻葉片Cry1C基因的檢測(cè)方法，該方法使用濾紙條制備基因組DNA，在體溫下通過(guò)RPA 擴(kuò)增目標(biāo)基因，使用Cas12a 檢測(cè)RPA 產(chǎn)物，并使用側(cè)向?qū)游黾垪l讀取測(cè)試結(jié)果，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)需儀器、常溫、30 min 內(nèi)通過(guò)觀察側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的顏色變化完成對(duì)轉(zhuǎn)Cry1C基因水稻的鑒定。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展是保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易安全有序進(jìn)行的重要支撐，新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)有利于進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)主要有LAMP 技術(shù)與免疫試紙條技術(shù)，這2 種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)均有其局限性。CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)相比于LAMP 技術(shù)，只需設(shè)計(jì)出RPA 或LAMP引物與crRNA，技術(shù)開(kāi)發(fā)過(guò)程更加簡(jiǎn)單。相比于免疫試紙條技術(shù)，CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)以核酸為檢測(cè)靶標(biāo)，擁有更高的特異性與靈敏度，針對(duì)核酸的檢測(cè)也更加直接、有效。

3 展望

目前，應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上的CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)主要是基于Cas12 蛋白，其特異性、靈敏度、便捷性得到了證明[33-34]。隨著CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上的進(jìn)一步應(yīng)用，除了基于Cas12 蛋白的檢測(cè)技術(shù)，Cas9 蛋白、Cas13 蛋白、Cas14 蛋白等理論上都可以設(shè)計(jì)出相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)。但是，相比于基于Cas13蛋白的檢測(cè)技術(shù)所使用的RNA 熒光報(bào)告基團(tuán)，基于Cas12 蛋白的檢測(cè)技術(shù)使用的是DNA 熒光報(bào)告基團(tuán)，更為穩(wěn)定，假陽(yáng)性率較低，檢測(cè)結(jié)果更加可靠。此外，基于Cas12 蛋白的檢測(cè)技術(shù)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄便可直接檢測(cè)，操作更加便捷。相比于基于Cas14 蛋白的檢測(cè)技術(shù)需要使用修飾的引物和T7 核酸外切酶進(jìn)而生成ss-DNA 產(chǎn)物，基于Cas12 蛋白的檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)操作更加簡(jiǎn)單。但由于CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程都無(wú)需儀器，而只依據(jù)熒光反應(yīng)或肉眼可見(jiàn)的顏色變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，因此依據(jù)熒光值強(qiáng)弱或顏色變化難以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

總體來(lái)說(shuō)，CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)時(shí)兼具以下優(yōu)點(diǎn)：①等溫?cái)U(kuò)增無(wú)需儀器，可以通過(guò)試紙條的顏色變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)；②檢測(cè)快速，整套檢測(cè)流程可在30 min以?xún)?nèi)完成；③操作簡(jiǎn)便，普通工作者也可完成檢測(cè)；④成本低廉，一套CRISPR/Cas 檢測(cè)流程的成本約為4.1 美元[35]；⑤設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，針對(duì)不同的檢測(cè)序列只需重新設(shè)計(jì)RPA 或LAMP 引物和crRNA 序列；⑥高特異性，crRNA 與靶DNA 完全匹配后才能激活Cas 蛋白的非特異性切割活性；⑦高靈敏度，檢測(cè)低限可達(dá)aM 水平。但目前CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中的應(yīng)用仍有一些局限性，如依賴(lài)核酸擴(kuò)增和富集、靶標(biāo)序列受PAM 序列限制、核酸提取純度低、Cas 蛋白的脫靶效應(yīng)造成的假陽(yáng)性等。但這些問(wèn)題可以通過(guò)相應(yīng)的改進(jìn)措施來(lái)解決，如尋找Cas 蛋白的變體擴(kuò)大PAM 序列識(shí)別范圍[36-37]、采用高保真Cas蛋白減少假陽(yáng)性[38]、采用磁性顆粒純化DNA[39]等。

除了在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中應(yīng)用前景廣闊，CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)同樣在基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)、轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)以及轉(zhuǎn)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中展現(xiàn)出了巨大的潛力。在基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)中，可以將基因編輯位點(diǎn)的特異性序列作為靶序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的crRNA或sgRNA，若crRNA或sgRNA與特異性序列成功匹配則可啟動(dòng)Cas 酶的核酸切割活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)。在轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)和轉(zhuǎn)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中，也可根據(jù)外源基因以及內(nèi)參照基因的特異性序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的crRNA 或sgRNA，若crRNA 或sgRNA 與特異性序列成功匹配即可啟動(dòng)Cas 酶活性進(jìn)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特異性檢測(cè)。隨著CRISPR/Cas 檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中的進(jìn)一步應(yīng)用，將會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。