張鳳， 賀曉云，2， 黃昆侖，2， 汪其懷

1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京100083；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京100176

田間雜草會影響作物生長和產(chǎn)量，傳統(tǒng)的物理除草方法雖然安全，但是費時費力?；瘜W除草可以更加高效地除掉雜草，并降低成本，然而化學除草劑的過量使用或不當選擇會造成環(huán)境污染、無法完全治理雜草等問題[1]。利用轉基因技術將抗除草劑基因轉移至作物，使其具有耐受除草劑的特性，在減少除草劑使用的同時，提高產(chǎn)量。轉基因大豆是目前世界上種植面積最廣的轉基因作物，其中，大多數(shù)種植品種為轉基因耐除草劑大豆[2]。盡管轉基因耐除草劑大豆已經(jīng)被大量應用于食品，其食用安全性仍然受到質(zhì)疑。本文對轉基因耐除草劑大豆進行了概述，分析了其存在的安全性問題，并詳細闡述了食用安全性評價方法，以期為轉基因耐除草劑大豆建立安全評價體系提供理論基礎。

1 轉基因耐除草劑大豆概況

1996 年，美國孟山都公司研發(fā)的轉基因抗草甘膦大豆（GTS）40-3-2 品系被第一個批準用于商業(yè)化種植[3]。至2017 年，全球轉基因大豆種植面積已超過9 000 萬hm2，占所有轉基因作物種植面積的50%，美國、巴西等作為轉基因大豆的種植大國，其種植應用率在90%以上[4]。截至目前，轉基因耐除草劑大豆已有超過30 個品種用于商業(yè)化種植，種植面積居轉基因大豆的首位。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織（the International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Application,ISAAA）統(tǒng)計信息顯示，用于種植的轉基因耐除草劑大豆主要有耐有機磷除草劑、耐激素除草劑以及耐多類除草劑的轉基因大豆類型。

耐草甘膦轉基因大豆作為最早種植的品種，也是當前應用最廣的耐有機磷除草劑的轉基因大豆[5]。農(nóng)桿菌菌株CP46的Cp4 epsps基因是其主要插入的外源基因，該基因通過在植物體內(nèi)表達并合成5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶賦予植物高水平的草甘膦耐受性[6]。耐草銨膦轉基因大豆則是另一種廣泛應用的耐有機磷除草劑的轉基因大豆，表達吸水鏈霉菌的bar基因[7]。耐麥草畏轉基因大豆是轉入土壤嗜麥芽窄食單胞菌DI-6菌株中合成麥草畏單加氧酶（DMO）基因的一種耐激素除草劑轉基因大豆[8]。DMO 可快速催化麥草畏氧化脫甲基生成3,6-二氯水楊酸（DCSA）和甲醛，發(fā)揮抗性。為滿足更加高效的田間管理和作物生產(chǎn)，還出現(xiàn)了耐多種除草劑的轉基因大豆。MON87708×MON89788品系大豆可耐受麥草畏和草甘膦，DAS-444O6-6 品系可同時耐受草甘膦、草銨膦和2,4-二氯苯氧乙酸[9-10]。除此之外，還有如MON87701×MON89788 品系大豆兼具耐草甘膦和抗鱗翅目害蟲的特點[11]。

表1 已批準商業(yè)種植的轉基因耐除草劑大豆Table 1 Genetically modified herbicide tolerant soybeans approved for commercial cultivation

雖然國際上轉基因大豆種植面積日益擴大，但是我國尚未批準商業(yè)化種植轉基因大豆[12]。盡管如此，早在20 世紀我國便開始轉基因作物的相關研究，現(xiàn)已擁有了一批具有自主知識產(chǎn)權的轉基因耐除草劑大豆。例如轉G2-EPSPS 和GAT 基因的ZH10-6 耐草甘膦大豆、轉AM79-EPSPS 基因的耐草甘膦大豆及轉G10-EPSPS基因的抗除草劑轉基因大豆SHZD32-01 等，都具有良好的性狀[13-15]。這些品系一些已進入我國轉基因植物研究的中間試驗階段或環(huán)境釋放階段，但還需要進行一系列嚴格的安全評價才能被批準應用。

2 轉基因耐除草劑大豆的安全性問題

轉基因耐除草劑大豆以及其他轉基因作物已經(jīng)生產(chǎn)種植了二十多年，其制作的飼料、食物在世界范圍內(nèi)應用廣泛[16]。盡管每一種轉基因耐除草劑大豆上市前都經(jīng)過系列安全評估，但是公眾對轉基因耐除草劑大豆生產(chǎn)的食品和飼料仍然爭議不斷，爭論的焦點主要集中在轉入基因后是否產(chǎn)生毒性、過敏性及大豆的營養(yǎng)成分是否改變等方面。

2.1 外源基因和蛋白的毒性

轉基因耐除草劑大豆通常是利用現(xiàn)代生物技術將外源DNA 轉入受體細胞中，經(jīng)培育得到。這個過程的變量是外源DNA，因此，首先被考慮的便是轉入的DNA 對人體是否有毒性。人體每天攝入來自植物性和動物性食物的DNA 在0.1～1 g左右，這個攝入量對人體不具有毒性[17]。同時，DNA 進入人體后會被消化系統(tǒng)水解，不會產(chǎn)生直接毒性。根據(jù)美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）相關政策，核酸存在于每個生物體內(nèi)，作為食物的成分來說不存在安全風險，被認為是安全的[16]。對于一些質(zhì)疑，如DNA可能在消化吸收時轉入人體內(nèi)或腸道微生物中，目前尚沒有確鑿的證據(jù)證明這種現(xiàn)象存在。

轉入的外源DNA 在轉基因耐除草劑大豆作物內(nèi)表達相應的蛋白，使其獲得耐受除草劑的特性，外源蛋白是否具有毒性也是被關注的焦點。轉入的DNA 本身可能與大豆內(nèi)的其他基因發(fā)生相互作用或受環(huán)境等影響發(fā)生變異，導致基因斷裂、缺失等突變發(fā)生，使得其表達的蛋白數(shù)量與性狀發(fā)生改變[18]。因此，證實外源蛋白的安全性和是否有其他有毒物質(zhì)產(chǎn)生十分重要。在轉基因耐除草劑大豆中表達的外源蛋白還未發(fā)現(xiàn)對人體有毒性，但也需要謹慎對待。

2.2 過敏性

表達的新蛋白是否會引發(fā)過敏反應也是人們關注的重點問題。1994 年，美國先鋒種子公司曾嘗試在大豆中轉入巴西堅果中編碼蛋白質(zhì)2S albumin的基因，但在測試階段發(fā)現(xiàn)對巴西堅果過敏的人群同樣也對這種轉基因大豆過敏，項目不得不終止[19]。但是在研究耐除草劑轉基因大豆過程中，尚未發(fā)現(xiàn)人群對相關蛋白的過敏現(xiàn)象[20]。1992 年，F(xiàn)DA 給出了第一種評估食物蛋白質(zhì)過敏性潛在風險的系統(tǒng)方法，2010 年由歐洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）轉基因生物小組（genetically modified organism, GMO）起草并于2011 年更新的轉基因生物過敏性風險評估指南中建議使用證據(jù)權重方法，用于轉基因飼料和食品中新表達蛋白質(zhì)的過敏性風險評估[21]。

2.3 營養(yǎng)成分改變

大豆通常由35%～40%的蛋白質(zhì)、20%左右的脂類、9%的膳食纖維和8.5%左右的水組成，不含膽固醇，富含異黃酮、皂甙等多種生物活性成分，具有調(diào)節(jié)生理功能和預防慢性病的作用[22]。轉入外源DNA 后，大豆內(nèi)的營養(yǎng)組成可能發(fā)生變化，或者引入的基因與大豆中其他營養(yǎng)素基因發(fā)生相互作用，使蛋白質(zhì)表達發(fā)生改變[18]。由于耐除草劑的基因對大豆的營養(yǎng)成分改變不能完全預知，人體如果攝入營養(yǎng)價值改變的大豆可能會影響自身健康。實際上，還沒有證據(jù)表明食用轉基因耐除草劑大豆會對人體和動物的健康或者營養(yǎng)狀況有不良影響。

2.4 抗營養(yǎng)因子

除了作為蛋白和油料資源外，大豆本身還含有胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、脲酶、植酸等多種抗營養(yǎng)因子，會影響動物和人的健康。與外源DNA 對營養(yǎng)成分的影響類似，轉入的基因可能改變大豆的抗營養(yǎng)因子組成和含量。因此，對于轉基因大豆還需要把握抗營養(yǎng)因子的變化情況。現(xiàn)有研究表明，耐除草劑轉基因大豆的抗營養(yǎng)因子與非轉基因大豆之間沒有顯著差異，具有等同性[23]。

3 轉基因耐除草劑大豆的食用安全性評價方法

所有應用于食品的轉基因作物上市前都要經(jīng)過系列食用安全性評估，轉基因耐除草劑大豆也不例外。目前，食用安全性評估主要采用經(jīng)濟發(fā)展合作組織（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）在 1993 年提出的實質(zhì)等同原則，即利用生物技術產(chǎn)生的食品及成分與當前市售的食品具有實質(zhì)等同性即視為安全[24]。評價方法主要有毒理學評價、過敏性評價和營養(yǎng)學評價等。

3.1 毒理學評價

耐除草劑轉基因大豆的毒理學評價首先是針對外源基因表達的蛋白質(zhì)與已知有毒性的蛋白質(zhì)和抗營養(yǎng)因子在氨基酸序列相似性上的特征比較；其次，若與已知有安全食用歷史的蛋白不相似時，應進行經(jīng)口毒理學試驗[25]。而蛋白質(zhì)以外無安全食用歷史的其他成分的潛在毒性評價應參照傳統(tǒng)毒理學方法進行，包括亞慢性毒性、慢性毒性、遺傳毒性和生殖發(fā)育毒性等毒性評價；同時，因轉入外源基因引起的大豆特性改變需要進行喂養(yǎng)實驗和其他必要的毒理學實驗進行評價[25]。

2016 年，一項對轉基因耐麥草畏大豆的研究中發(fā)現(xiàn)該轉基因大豆表達的DMO 與野生型DMO的氨基酸序列同源性為91.6%～97.1%，且所有DMO 形式都保持了Rieske 加氧酶的特性，而這些酶具有安全使用的歷史[26]。多個國家都曾采用轉基因抗除草劑大豆進行動物亞慢性毒性實驗和生殖能力檢測。日本研究人員在大鼠基礎日糧中添加30%濃度的轉基因大豆或非轉基因大豆，分別進行52 周和104 周兩項慢性喂養(yǎng)實驗，同時為了評估大豆本身的影響，還將喂養(yǎng)轉基因和非轉基因大豆的大鼠組與喂養(yǎng)商業(yè)飲食的大鼠組進行了比較，血液學、血清生化和病理學檢查、動物生長情況等結果表明，長期攝入30%的轉基因大豆對大鼠沒有明顯的不良影響[27-28]。我國研究人員Zhu 等[29]使用轉基因耐草甘膦大豆飼喂大鼠13周，監(jiān)測了體重、進行了血液學指標、尿常規(guī)和病理學檢查，發(fā)現(xiàn)動物沒有出現(xiàn)亞慢性中毒現(xiàn)象。在生殖毒性方面，我國研究人員在飼料中添加20%（質(zhì)量分數(shù)）加工好的轉基因耐草甘膦大豆豆粕或近等基因非轉基因豆粕，喂食雄性SD 大鼠90 d，每日監(jiān)測體重和行為，檢測血清酶、睪丸組織學和電鏡表現(xiàn)，以及精子形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，飼喂轉基因大豆的大鼠未觀察到任何不良反應[30]。美國研究人員也曾對小鼠進行類似的實驗，得出轉基因耐草甘膦大豆對小鼠無生殖毒性的結論[31]。意大利研究人員曾經(jīng)進行了轉基因大豆喂養(yǎng)小鼠240 d的傳代試驗，檢測結果顯示小鼠臟器中核酸轉錄活性改變，作者認為是由于大豆中的抗草甘膦基因引起的。但是，這些檢測指標不是毒理學的常用指標，并且也沒有動物相關指標自然范圍的數(shù)據(jù)支持。因此，EFSA認為這些發(fā)現(xiàn)的毒理學相關性尚不清楚[32-37]。類似的，也有一些試驗認為轉基因大豆可能與肝臟老化和胰腺病變有關，但這些試驗的科學性尚有待探討[38-39]。

3.2 過敏性評價

針對外源基因表達蛋白質(zhì)的過敏性評價應當遵循整體、分步和個案分析的原則，實現(xiàn)綜合評價。主要包括根據(jù)供體生物過敏性的信息確定評價方法、外源基因表達蛋白質(zhì)與已知過敏原氨基酸序列同源性比較、外源基因表達蛋白質(zhì)在加工和胃腸消化過程的穩(wěn)定性三個方面[25]。

一項對轉基因耐麥草畏大豆中DMO 的過敏性評價結果表明，DMO 序列中沒有一個與任何已知的過敏原或毒素相似，并采用證據(jù)權重法進一步評價DMO 蛋白的安全性，純化的DMO 蛋白在體外55℃及以上的溫度下加熱活性完全喪失，并且分別可在30 s 或5 min 內(nèi)被胃蛋白酶和胰酶完全消化；小鼠經(jīng)口灌注DMO 蛋白喂養(yǎng)實驗未顯示出任何不良反應，這些結果表明各種形式的DMO蛋白質(zhì)對于食物和飼料消費是安全的，并且DMO活性位點之外的小氨基酸序列差異不會引起任何額外的安全問題[26]。對轉基因耐草甘膦大豆中CP4 EPSPS 蛋白的過敏性分析表明，該基因的供體土壤農(nóng)桿菌不是一種已知的過敏原，該蛋白與公共數(shù)據(jù)庫（GenBank、EMBL、PIR 和SwissProt）中的已知過敏原沒有高度的氨基酸序列同源性。該蛋白可以在模擬胃液和模擬腸液中被迅速消化。截至2020 年，美洲、歐洲以及亞洲都有研究使用易過敏兒童和成年人的血清與轉基因耐草甘膦大豆提取物和CP4 EPSPS 蛋白進行的特異性IgE 結合試驗，結果未發(fā)現(xiàn)該蛋白與任一過敏血清結合，而轉基因大豆提取物和非轉基因大豆提取物的內(nèi)源性過敏原的種類和數(shù)量沒有明顯差異[40-45]。采用SD 大鼠所做的動物體內(nèi)體外致敏刺激試驗也證實了CP4 EPSPS蛋白注射或灌胃都不會引起動物的過敏反應[46]。2010 年，一項對耐異惡唑酮和草甘膦的FG72 大豆進行的過敏性評價實驗中，F(xiàn)G72 大豆種子中的過敏原水平?jīng)]有顯著增加[47]。因此，大豆中轉入DMO、CP4 EPSPS 等外源蛋白沒有增加新的過敏性風險。

3.3 營養(yǎng)學評價

耐除草劑轉基因大豆的營養(yǎng)學評價應考慮大豆中營養(yǎng)成分、抗營養(yǎng)因子等相關成分的自然變異范圍等因素的影響，以及加工條件下對大豆中這些成分的含量、結構、功能和生物利用率的影響[25]。

歷史上在不同時間、不同地點對轉基因耐除草劑大豆已經(jīng)進行了多次獨立的營養(yǎng)成分分析，如美國 1992—2011 年多個地點，歐洲 2005 年 5 個地點，巴西2007—2009 年多個地點[48-53]的分析試驗。在2000—2002 年美國和加拿大兩地持續(xù)對多種遺傳背景的轉基因耐草甘膦大豆和它的親本大豆的營養(yǎng)成分分析均表明，二者在大部分營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子含量和組成方面無明顯差異，均在相應范圍內(nèi)[54]。2017年一項對于耐受多種除草劑的轉基因大豆的評價中，將收獲的具有耐麥草畏和草甘膦的大豆中重要營養(yǎng)素和抗營養(yǎng)素的水平與親本非轉基因大豆及普通大豆進行比較，結果表明基因修飾對相關成分沒有影響[55]。因此，插入耐除草劑基因對大豆的營養(yǎng)成分沒有顯著影響。

動物喂養(yǎng)試驗常用來評價轉基因作物營養(yǎng)成分的生物利用率。使用轉基因耐草甘膦大豆和非轉基因大豆飼喂鵪鶉、大鼠、牛、雞等動物后，檢測它們的體重、飼料轉化率、肌肉和脂肪組成（雞）、牛奶產(chǎn)量和牛奶成分等，發(fā)現(xiàn)兩種大豆對動物的營養(yǎng)價值沒有差別，這些動物試驗中大豆的飼喂量達到人體攝入量的100 倍，也足以說明轉基因大豆對動物和人體的安全性[56]。2017 年，一項研究以朝鮮鵪鶉作為實驗動物，隨機分成5 個處理組，用含有28%和70%的轉基因耐草甘膦大豆和非轉基因對照大豆以及常規(guī)基礎日糧飼喂鵪鶉90 d，觀察其對鵪鶉健康狀況和生理指標的影響，記錄各組動物體重和攝食量，并在實驗末期收集血液解剖動物進行病理觀察，計算臟器系數(shù)，90 d亞慢性毒性實驗表明，轉基因大豆對鵪鶉沒有產(chǎn)生不良反應[57]。

4 展望

轉基因耐除草劑大豆已經(jīng)商業(yè)化種植了二十多年，迄今為止還沒有觀察到任何不良反應。盡管種植轉基因耐除草劑大豆的優(yōu)勢非常明顯，但仍有一部分人存在懷疑。隨著生物技術的不斷發(fā)展，采用新技術研發(fā)的新一代轉基因作物可能會涉及更復雜的安全評估。因此，需要建立完整的轉基因作物食用安全性評估體系并不斷完善才能更好地評價轉基因耐除草劑大豆的安全性，減少公眾的顧慮，促進更多優(yōu)勢轉基因作物的商業(yè)化應用。