權(quán)春菊， 鄭忠亮

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430027

隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，遺傳疾病的診斷效率不斷上升，然而目前缺乏相應(yīng)的治療手段，亟需發(fā)展新型治療選擇?；蛑委熓侵咐没蚓庉嫾夹g(shù)糾正或補償細胞致病基因而達到治療的目的。基因編輯技術(shù)是對目的基因進行定點突變、插入或敲除的一種有效方法[1]?；蚓庉嫾夹g(shù)的核心機制是通過引入靶向DNA雙鏈斷裂（doublestrand break，DSB）來刺激基因編輯過程，然后激活細胞DNA 修復(fù)通路[2-3]，進而利用該通路實現(xiàn)對目的基因的定點突變、插入或敲除。雖然已經(jīng)開發(fā)出第一代鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[4]技術(shù)和第二代類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[5]技術(shù)，但由于 CRISPR 系統(tǒng)功能多樣、高效且易于使用，來源于自然發(fā)生的CRISPR 系統(tǒng)的技術(shù)已成為大多數(shù)基因組工程師的首選方法[6-8]。CRISPR/Cas系統(tǒng)通常包括Cas蛋白以及結(jié)合在Cas 蛋白上的單鏈引導(dǎo)RNA（single guiding RNA，sgRNA），前者負責(zé)剪切核酸，后者負責(zé)指引Cas蛋白結(jié)合到特定的核酸序列上[9]。

傳統(tǒng)的CRISPR/Cas 雖然可以相對輕松地改變多種生物的基因組，但也容易出現(xiàn)脫靶效應(yīng)等情況[10]。為更好地控制基因編輯的進行，科學(xué)家們開發(fā)了基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的新型編輯技術(shù)，包括堿基編輯器（base editors，BE）、Prime Editors（PE）和Cas13 效應(yīng)器，這些衍生編輯技術(shù)既具有CRISPR核酸酶的可編程性和靈活性，又具有擴展功能，使基因編輯不依賴傳統(tǒng)的DSB[11]。CRISPR/Cas 及其衍生編輯技術(shù)現(xiàn)已成為實驗生物學(xué)的支柱，并因日漸成熟而成為臨床應(yīng)用的工具。基因治療的對象也已經(jīng)由單基因遺傳病逐步拓展到惡性腫瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病等[11-13]?；诖?，本文簡要介紹了CRISPR/Cas 及其衍生編輯技術(shù)，綜述了其在單基因遺傳病、腫瘤和其他疾病的基因治療中的應(yīng)用進展，并分析了其在當下面臨的挑戰(zhàn)，以期為CRISPR/Cas 及其衍生編輯技術(shù)在各類疾病的臨床治療中的應(yīng)用提供理論參考。

1 CRISPR/Cas及其衍生編輯技術(shù)

CRISPR/Cas 系 統(tǒng) 包 括 crRNA（CRISPR-derived RNA）和反向激活 crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）以及 Cas 蛋白 3 個部分。根據(jù)Cas基因的全序列以及Cas 蛋白之間的序列相似性和位點結(jié)構(gòu)，目前將CRISPR-Cas 系統(tǒng)分為兩類，包括 6 個類型和 19 個亞型[9,14]。 1 類 CRISPR-Cas 系統(tǒng)（包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型）存在于細菌和古生菌中，并且包含由4～7個Cas蛋白亞基組成的效應(yīng)復(fù)合物；2 類CRISPR-Cas 系統(tǒng)（Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型）幾乎完全局限于細菌，其效應(yīng)復(fù)合物由單個多域蛋白質(zhì)組成[9]。廣泛用于基因編輯的CRISPR/Cas9 是Ⅱ型 CRISPR 系統(tǒng)，是由 1 個 Cas蛋白結(jié)合向?qū)NA（guide RNA）到特異位點，識別并剪切靶向序列，造成DNA 損傷（圖1A）。其中，Cas9 是一種 RNA 依賴性內(nèi)切酶，包含 2 個不相關(guān)的核酸酶域（HNH 和 RuvC）[10]。2012 年 Jennifer Doudna 團隊首次證明了CRISPR/Cas 系統(tǒng)可在體外對DNA進行切割[14]。

CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫包括3 個階段：第一個階段為適應(yīng)，來自入侵分子的外源DNA 片段（稱為原間隔區(qū)）被處理并作為新的間隔區(qū)插入CRISPR 陣列中；第二個階段為表達，包括CRISPR陣列的轉(zhuǎn)錄，隨后將前體轉(zhuǎn)錄物加工成成熟的crRNA，crRNA 與 1 個 或多 個 Cas 蛋 白組 裝 成CRISPR 核糖核蛋白（crRNA ribonucleoprotein，crRNP）復(fù)合物；第三個階段為干擾，包括在crRNP復(fù)合物內(nèi)用Cas 核酸酶對入侵的同源病毒或質(zhì)粒核酸進行crRNA定向切割[14]。

與ZFN 技術(shù)和TALENs 技術(shù)相比，CRISPR/Cas 系統(tǒng)只需要設(shè)計一段與目標序列互補的sgRNA 即可發(fā)揮作用，這極大提高了核酸酶的特異性，也避免了復(fù)雜蛋白質(zhì)設(shè)計和組裝的需要。然而，傳統(tǒng)的CRISPR 技術(shù)是通過激活DSB 修復(fù)通路來激活基因編輯，這可能會對細胞產(chǎn)生不良影響，限制了該技術(shù)在某些疾病治療中的應(yīng)用。為此，基于 CRISPR/Cas 的新型技術(shù)，如 BE、PE 和Cas13 效應(yīng)器，被相繼開發(fā)出來，它們能夠不依賴DSB而啟動編輯。

1.1 堿基編輯器

BE由具有單鏈切割活性的Cas9蛋白（nCas9）和具有靶向催化脫氨反應(yīng)的堿基脫氨酶融合而成，實現(xiàn)對靶點的堿基替換。目前，根據(jù)融合的堿基修飾酶，可將BE 分為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editors，CBE）[15-16]和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editors，ABE）[17]。以CBE 為例，主要過程包括nCas9-堿基脫氨酶-sgRNA 三元復(fù)合體的形成，此復(fù)合體可催化目標DNA 序列，CBE 作用時，胞嘧啶（C）在靶點直接脫氨基變成尿嘧啶(U），接著 DNA 進行復(fù)制，U 被胸腺嘧啶（T）取代。隨著DNA 復(fù)制，同一時間，腺嘌呤（A）將會替換互補鏈上原來與C 互補的鳥嘌呤（G），最終實現(xiàn)了在編輯窗口內(nèi)C 到T 和G 到A 的單堿基精準編輯（圖1B）[11]。

圖1 CRISPR/Cas9、CBE、PE和Cas13效應(yīng)器生物的結(jié)構(gòu)[11]Fig.1 The structure of CRISPR/Cas9，CBE，PE and Cas13 effectors[11]

盡管BE擴大了基因編輯的應(yīng)用范圍，但由于受到堿基脫氨酶結(jié)構(gòu)域功能的部分限制，不能插入或刪除DNA序列。

1.2 Prime Editors

2019 年 10 月 21 日，美國哈佛大學(xué) David Liu實驗室發(fā)表了一種新的基因編輯方法——Prime Editors[18]，其可不依賴于DSB和供體DNA 模板，而實現(xiàn)目標位點的插入/缺失和所有12 種類型點突變。

PE 由主編輯引導(dǎo)RNA（prime editing guide RNA，pegRNA）和連接到逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）結(jié)構(gòu)域的nCas9 融合而成。pegRNA中包含sgRNAs，其3'端包含一段引物結(jié)合位點（primer binding site，PBS）和轉(zhuǎn)錄模板序列（RT template）。在催化編輯過程中，由pegRNA 指導(dǎo)，PE 首先與特定的目標DNA 序列結(jié)合，然后促進nCas9 切割 DNA 單鏈，pegRNA 3'端的 PBS 識別切割斷點前的互補序列并雜交，RT催化合成一個新的DNA 鏈，該DNA 鏈根據(jù)pegRNA 指定的模板對目的基因進行編碼。在DNA 修復(fù)后，這條新鏈被引入目標位點（圖1C）[11]。

與BE 相比，PE 具有更加廣闊的應(yīng)用前景，但PE系統(tǒng)及其應(yīng)用仍有亟待改進之處：如sgRNA 依賴性或非依賴性的脫靶效應(yīng)尚且未知、PE 介導(dǎo)的高堿基插入/缺失率以及PE 系統(tǒng)在成體動物中的遞送等問題[18-23]。

1.3 Cas13效應(yīng)子

與CRISPR 家族蛋白（如Cas9）對DNA 進行編輯來修改基因/調(diào)控基因表達不同，Cas13 酶通過與crRNA 結(jié)合而激活內(nèi)源RNase活性來切割目標RNA，促進了一種靈活的和可編程的技術(shù)發(fā)展[24-28]。

Cas13 效應(yīng)子系統(tǒng)包括crRNA 分子和Cas13蛋白，其復(fù)合體結(jié)構(gòu)靶向目標RNA 位點，該位點刺激Cas13的HEPN 結(jié)構(gòu)域的RNase 催化活性，從而觸發(fā)其切割。Cas13 效應(yīng)子可以作為支架使靶向RNA 編輯成為可能。RNA 編輯器包括dCas13與RNA 腺苷脫氨酶（adenosine deaminase acting on RNA，ADAR）的融合，以刺激A 到I 的編輯，胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)C到U的轉(zhuǎn)換（圖1D）[11]。

Cas13 效應(yīng)子不涉及編碼基因DNA 的改變，而是通過對基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）進行編輯，為改變基因功能和調(diào)控表達提供了新的方法和思路，這對于疾病的研究和治療均具有深遠的意義。

2 CRISPR/Cas 及其衍生編輯技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用

隨著基因組測序成本的降低以及人類基因組序列比較分析、高通量基因組篩查應(yīng)用的增加，診斷遺傳疾病的能力得到了迅速發(fā)展，CRISPR技術(shù)的高效性和精確性在基因調(diào)控、模式生物構(gòu)建、植物育種等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景，更是對基因治療的發(fā)展具有重要作用。

2.1 在單基因遺傳病中的應(yīng)用

雖然人類遺傳學(xué)疾病通常很復(fù)雜，但一些最常見的遺傳疾病是由單個基因的突變引起的，如血友病、囊性纖維化、亨廷頓舞蹈病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）和鐮狀細胞貧血（sickle cell disease，SCD）等都是由人類基因組中單個基因缺陷引起的疾病。

SCD發(fā)生在β-珠蛋白（hemoglobin-beta，HBB）基因有2 個缺陷拷貝的個體中，其為成人血細胞中形成攜氧血紅蛋白所必需的蛋白質(zhì)。研究表明，利用一個短單鏈寡核苷酸模板融合CRISPR/Cas9 技術(shù)來糾正SCD 患者外周血或骨髓造血干/祖 細 胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）中的HBB基因，基因編輯細胞中紅細胞鐮化顯著減少[29]。Kalkan 等[30]發(fā)現(xiàn)使用較長的gRNA 對靶標DNA 具有較高的親和性，這為高效和高親和力靶向HBB基因提供了更有效的方法。上述研究結(jié)果對于基因治療在SCD 的臨床應(yīng)用至關(guān)重要[29-31]。然而，靶標DNA 雙鏈斷裂可能會導(dǎo)致大量缺失和復(fù)雜的基因組重排，這可能會致病[32]，因此需通過靶向Cas9 切割來降低SCD 患者誘發(fā)地中海貧血的風(fēng)險，gRNA/Cas9 RNP 的最佳劑量和半衰期都需要進一步研究。2019 年，David Liu 研究團隊利用 PE3 糾正了HBB突變，增加了人類遺傳病的治療手段[18]。

BE 的開發(fā)為精準基因治療提供了更加強有力的手段，其不依賴于DSB 修復(fù)，可更有效地避免大量隨機插入和缺失。在DMD 小鼠模型中，利用腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editors，ABEs）技術(shù)修正DMD 基因，進而恢復(fù)抗肌萎縮蛋白的表達[33]。NPC1介導(dǎo)細胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的缺失會導(dǎo)致尼曼-匹克病C 型疾病，此外，Levy 等[21]利用CBEs 糾正了小鼠腦組織中的缺失，減緩了神經(jīng)退化，延長了動物的壽命。

目前基因編輯技術(shù)應(yīng)用于基因治療的主要手段是在目的細胞內(nèi)強制表達外源基因或抑制表達內(nèi)源基因，但強制表達時效有限，表達劑量也難以控制，而外源基因載體多為整合型病毒，人體免疫反應(yīng)的問題也不容忽視。

2.2 在腫瘤治療中的應(yīng)用

基因編輯在治療方面的應(yīng)用也延伸到癌癥免疫治療領(lǐng)域，主要集中在嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T 細胞的過繼免疫治療[34]。近年來，基因編輯技術(shù)對難治性腫瘤、白血病、淋巴瘤等疾病的治療研究進展迅速[34-37]。

2016 年，我國四川大學(xué)華西醫(yī)院盧鈾團隊將利用CRISPR 技術(shù)敲除PD-1基因編輯T 細胞導(dǎo)入患者體內(nèi)，以治療經(jīng)化療、放療以及其他療法治療無效的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者[38-39]。2020 年該團隊公布了Ⅰ期臨床試驗結(jié)果，證明了靶向PD-1的CRISPR 基因編輯T 細胞在一個晚期肺癌患者隊列中的安全性和可行性[36]。Stadtmauer 等[40]從3例癌癥患者（2例晚期難治性骨髓瘤患者和1例轉(zhuǎn)移性肉瘤患者）身上提取T 細胞，然后使用CRISPR 技術(shù)敲除了 T 細胞的 3 個基因：TCRα、TCRβ、PD-1，利用慢病毒插入一個親和力增強的T 細胞受體基因，使得被基因編輯的T 細胞可靶向癌細胞上名為NY-ESO-1 的抗原（正常組織很少表達該抗原）。最后，經(jīng)多重改造的T細胞被回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。研究顯示，上述3 例患者均對治療耐受良好，脫靶效應(yīng)也較為罕見。這些試驗成果無疑為進一步開展基于CRISPR 技術(shù)的癌癥免疫療法提供了數(shù)據(jù)支持。Zafra等[41]使用密碼子優(yōu)化的第三代堿基編輯器（base editor 3，BE3）共轉(zhuǎn)染，在小鼠肝臟細胞中糾正了與癌癥相關(guān)的Ctnnb1S45F突變，能夠抵抗Tankyrase 抑制劑對上游WNT 的抑制。KRAS 突變體是胰腺癌的驅(qū)動癌基因，Zhao 等[42]利用 CRISPR-Cas13a 系統(tǒng)靶向治療胰腺癌中的突變KRAS，研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas13a介導(dǎo)的KRASG12D mRNA 敲低可在體外誘導(dǎo)小鼠腫瘤細胞凋亡，并引起顯著的腫瘤收縮。

同時，CRISPR/Cas 技術(shù)也可用于癌癥功能性靶點的篩選。Wang 等[43]利用整合型細胞表面抗原介導(dǎo)的CRISPR 平臺對參與維持白血病細胞未分化狀態(tài)的基因進行篩查，發(fā)現(xiàn)了維持和分化白血病的重要調(diào)節(jié)因子ZFP36L2。

2.3 在其他疾病中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)在其他疾病治療方面也取得了初步進展，如肝臟疾病、心血管疾病、視網(wǎng)膜損傷等。

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的肝感染，存在引起肝硬化和肝癌的風(fēng)險。而采用CRISPR/Cas9 技術(shù)根據(jù)HBVS和X基因的2 個同源序列構(gòu)建pCas9 表達載體，可能介導(dǎo)體外和體內(nèi)系統(tǒng)的抗HBV作用[44]。

已有研究在母鼠子宮內(nèi)進行基因編輯，來治療子鼠致命性的代謝障礙，提示有可能在人類出生前對致病性的基因進行編輯[45]。Rossodis 團隊利用CRISPR-Cas9 和BE3，靶向性地在子宮內(nèi)編輯了健康小鼠中調(diào)節(jié)膽固醇水平和降低膽固醇水平的基因，導(dǎo)致小鼠出生后1 個月和3 個月的PCSK9 蛋白水平和總膽固醇水平下降[45-46]；Chadwick團隊也通過BE 技術(shù)實現(xiàn)PCSK9基因的敲除，降低了血漿膽固醇的水平[47]。

中科院上海生命科學(xué)研究院的研究人員利用CRISPR-CasRx 技術(shù)下調(diào)單一RNA 結(jié)合蛋白——多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1（polyrimidine tract binding protein 1，Ptbp1），其或能導(dǎo)致 Muller 膠質(zhì)細胞高效轉(zhuǎn)化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs），從而減緩與RGC 缺失相關(guān)的疾病癥狀[48]，為未來治療神經(jīng)退行性疾病提供了有前景的方案。

3 CRISPR/Cas 及衍生編輯技術(shù)在基因治療中面臨的挑戰(zhàn)

盡管已證實CRISPR/Cas 及其衍生編輯技術(shù)在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大的科研和實踐價值，發(fā)展前景十分廣闊，但在臨床應(yīng)用中必須克服許多障礙，特別是在準確性、安全性和體內(nèi)有效性方面。

在準確性方面，相比ZFN 技術(shù)、TALENs 技術(shù)，CRISPR/Cas 編輯技術(shù)極大提高了基因編輯的效率，但有效率仍無法達到100%。因此，若想提高基因編輯技術(shù)的臨床應(yīng)用率，編輯效率的進一步提升是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。BE 的表達水平與編輯效率十分相關(guān)，Koblan 等[49]通過增加核定位信號（nuclear localization signal，NLS）以及使用優(yōu)化的密碼子序列，增加了BE在哺乳動物細胞中的編輯效率。

其次是安全性，主要集中在脫靶效應(yīng)，尤其值得注意的是，除 DNA 中 Cas9∶sgRNA 依賴[15]和獨立[50-51]的脫靶效應(yīng)外，BE 也可以非特異性地修飾RNA[52]。研究人員利用工程化的脫氨酶變體，即通過改造脫氨酶與RNA 的活性結(jié)合位點從而來降低對RNA 的編輯效率[53-55]。在未來的發(fā)展過程中，解決基因編輯的脫靶問題是研究人員所面臨的挑戰(zhàn)。

在體內(nèi)有效性方面，基因編輯技術(shù)在臨床應(yīng)用中需要將核酸酶系統(tǒng)輸送至人體細胞內(nèi)，現(xiàn)在已有的運輸系統(tǒng)包括病毒載體、納米顆粒以及蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物等[1,56]。腺相關(guān)病毒載體AAV、AAV2 和AAV9 型載體已經(jīng)被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administraton，F(xiàn)DA）批準用于治療視網(wǎng)膜退行性疾病和脊髓性肌萎縮癥[57-58]。但是AAV 有限的承載能力和體液免疫反應(yīng)需要科學(xué)家繼續(xù)尋找解決方案。未來可以嘗試一些新型基因組編輯材料遞送方式，如磁納米顆粒轉(zhuǎn)化法、碳納米管轉(zhuǎn)化法、病毒載體轉(zhuǎn)化法等。

基因編輯技術(shù)在其他物種的成功應(yīng)用，必然會應(yīng)用于人類自身。在人類胚胎細胞中進行基因編輯，不僅可以治療遺傳性疾病，還可以使修復(fù)后的基因遺傳給后代，完全消除致病基因的影響。但是尚在發(fā)展的基因編輯技術(shù)也會對后代造成安全性的風(fēng)險，這些對人類的繁衍和生活方式等都將會產(chǎn)生一定的影響。英國的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)用CRISPR/Cas9 在對胚胎發(fā)育非常重要的POU5F1基因中引入突變，在被編輯的18 個胚胎中，約22%的胚胎在POU5F1 周圍出現(xiàn)了大量的變異，這遠超出了研究人員的預(yù)期[59]。哥倫比亞大學(xué)的研究人員使用CRIPR/Cas9 對EYS基因的變異進行了修正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約半數(shù)的胚胎失去了大量的染色體片段，甚至失去了EYS基因所在的整個染色體[60]。這些研究結(jié)果表明人類對于基因編輯技術(shù)以及DNA 修復(fù)機制了解甚少，在推進科學(xué)研究的同時，應(yīng)建立起相應(yīng)完善的有效監(jiān)管體系，兩者協(xié)調(diào)發(fā)展，從而保障基因編輯技術(shù)在人類疾病治療中的應(yīng)用[61]。

4 展望

CRISPR/Cas 及其衍生編輯技術(shù)作為生命科學(xué)領(lǐng)域革命性的工具，將來可能會徹底改變生物學(xué)研究并影響個性化醫(yī)療。這些高精度、高頻率編輯DNA 或RNA 的新興技術(shù)極大地擴展了操縱和研究模式生物的能力，并給予治療許多遺傳疾病的希望。然而，也應(yīng)看到這些技術(shù)的功能許多是相似的。例如，堿基編輯器和Prime Editors 都能夠創(chuàng)建C ＞T 和A＞G 轉(zhuǎn)換。因此，在基因治療過程中，應(yīng)綜合考慮目標編輯效率和非目標編輯副產(chǎn)物等多種因素，選擇最優(yōu)方案。

此外，不僅要開發(fā)新型的堿基編輯系統(tǒng)，還應(yīng)注意編輯系統(tǒng)的傳遞，尤其是需要進行大型動物研究，以確定基于AAV 的雙重策略對BE 和PE 的整體效果。有效實施新型的CRISPR 技術(shù)還需要廣泛評估其免疫原性，在大型動物模型中進行研究對于幫助確定連續(xù)表達Cas13 或任何其他新型CRISPR技術(shù)是否會導(dǎo)致長期不利影響非常重要。

總之，人類科學(xué)和生物技術(shù)不斷進步，CRISPR 技術(shù)不斷發(fā)展，不斷發(fā)現(xiàn)新的疾病靶點、提高編輯效率、降低脫靶效應(yīng)，使其在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。但還需要科學(xué)、醫(yī)學(xué)、人類學(xué)及監(jiān)管部門的相互合作，進一步促進基因編輯技術(shù)向臨床治療的轉(zhuǎn)化，促進其在人類生產(chǎn)的應(yīng)用，提升其應(yīng)用價值。