柯楊， 馬瑜，*， 朱海云， 張育輝

1.陜西省微生物研究所，西安710043；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710119

水域是地球環(huán)境的重要組成部分，也是最易受污染的生態(tài)系統(tǒng)之一，其變化影響著整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)及人類(lèi)的生存。水生態(tài)系統(tǒng)中不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)別的水生生物，如甲殼類(lèi)、魚(yú)類(lèi)及兩棲類(lèi)等，均可通過(guò)攝食、接觸等多種途徑攝入水體中的污染物；同時(shí)，水域污染物也可通過(guò)直接毒性（短/長(zhǎng)期暴露）和間接毒性（如生殖生理毒性及環(huán)境適應(yīng)性）等多種途徑影響水生生物的生存[1]。因此，研究水生生物對(duì)水域環(huán)境污染的響應(yīng)有助于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)環(huán)境污染水平、評(píng)價(jià)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及尋求新的生物標(biāo)志物。此外，人口增長(zhǎng)和化學(xué)工業(yè)的發(fā)展導(dǎo)致許多污染物和毒素釋放到環(huán)境中，這些污染物和毒素在環(huán)境中的降解、蓄積、遷移和轉(zhuǎn)化過(guò)程會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康造成威脅。因此，監(jiān)測(cè)這些污染物和毒素對(duì)生物體和生態(tài)系統(tǒng)的影響是生態(tài)毒理學(xué)的研究重點(diǎn)，而敏感、有效的生物標(biāo)志物對(duì)生態(tài)毒理學(xué)研究和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義[2]。

水生生物生態(tài)毒理學(xué)可從不同層面闡明有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)水生生物以及生態(tài)環(huán)境的影響，預(yù)測(cè)并減少或防止水生污染物對(duì)環(huán)境的有害影響[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)以動(dòng)物為基礎(chǔ)的個(gè)體、組織和器官水平的毒理學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)了向細(xì)胞和分子水平的跨越。此前，基于微陣列和RNA 測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)的基因表達(dá)分析已經(jīng)應(yīng)用于水生物種的生態(tài)毒理學(xué)研究中[4]。而基于雜交基礎(chǔ)的微陣列技術(shù)只限用于已知序列，且雜交技術(shù)靈敏度有限，難以檢測(cè)低豐度的目標(biāo)、重復(fù)序列及異常的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因而逐步被RNA-seq技術(shù)所替代。

RNA-seq技術(shù)是基于二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的方法，應(yīng)用該方法對(duì)特定生理?xiàng)l件下，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或所有mRNA的集合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，可全面快速地獲得特定狀態(tài)下的特定組織或器官幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本序列信息，從整體水平上分析基因的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控規(guī)律，精確檢出特定基因的表達(dá)水平、差異剪接及轉(zhuǎn)錄本的等位基因特異性表達(dá)[5]。與傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序相比較，RNA-seq 技術(shù)具有所需樣品量少、背景信號(hào)低、成本較低等優(yōu)勢(shì)[6]。此外，在水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究中，RNA-seq 技術(shù)可用于分析缺乏基因表達(dá)數(shù)據(jù)和參考基因組（reference genome）信息的非模式生物的毒理分子機(jī)制。傳統(tǒng)的研究方法受樣本量及檢測(cè)尺度的限制，不能在整體水平上反映細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及調(diào)控規(guī)律，從而限制了對(duì)污染物毒理機(jī)制的深入分析；而RNA-seq 技術(shù)所需樣品量少，可在整體水平上鑒別因環(huán)境因子改變而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄組水平差異變化，成為鑒別環(huán)境污染物脅迫下機(jī)體基因差異表達(dá)變化的可靠手段。同時(shí)，RNA-seq 技術(shù)在尋找新的生物標(biāo)志物、發(fā)現(xiàn)新的毒性通路中也扮演著重要角色。因此，RNA-seq 技術(shù)成為水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究的最佳方法之一。

目前，已有許多水生生物作為水生態(tài)毒理學(xué)研究的指示物種被用于研究污染物對(duì)不同生態(tài)位水生生物的毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制[7]。本文介紹了RNA-seq 技術(shù)的基本流程與數(shù)據(jù)分析過(guò)程，同時(shí)也對(duì)該技術(shù)在不同生態(tài)位的水生毒理學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展、優(yōu)勢(shì)、挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了探討，以期為該技術(shù)在水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，尤其是水生態(tài)環(huán)境中污染物脅迫水生生物機(jī)制的闡明及污染水域生態(tài)環(huán)境恢復(fù)提供參考。

1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的步驟主要包括文庫(kù)構(gòu)建、平臺(tái)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。平臺(tái)測(cè)序中，目前商業(yè)應(yīng)用的主要有454 FLX SOLiD?（Roche）、SOLiD?（Applied Biosystems）、Solexa GA（Illumina Life Technologies）這 3 個(gè)二代高通量測(cè)序平臺(tái)。該平臺(tái)依賴(lài)于體外克隆步驟（克隆擴(kuò)增）來(lái)擴(kuò)增無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中每個(gè)片段化的cDNA分子[8-9]。

盡管RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用使獲取轉(zhuǎn)錄組序列更便捷，但會(huì)產(chǎn)生大量的原始序列，這些序列必須經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件和工具處理才能獲得有效的信息，因此，對(duì)于測(cè)序數(shù)據(jù)的分析處理尤其重要。利用RNA-seq 得到的海量原始序列需進(jìn)行過(guò)濾、剪切和校正，從而去除低質(zhì)量序列、短序列、銜接子序列及污染序列，然后再進(jìn)行讀段定位、轉(zhuǎn)錄本組裝、轉(zhuǎn)錄本定量及差異表達(dá)分析。常用的RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)處理工具見(jiàn)表1。

表1 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)處理軟件Table 1 Processing tools of RNA-seq sequencing data

2 RNAA--sseeqq 技術(shù)在水生生物生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，RNA-seq 技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用于水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究中。利用該技術(shù)對(duì)暴露于污染水體中不同生態(tài)位的水生生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，可獲得差異表達(dá)基因，進(jìn)而了解基因的表達(dá)情況及其調(diào)控機(jī)理。同時(shí)，RNA-seq 技術(shù)的應(yīng)用，有利于深入研究不同污染物脅迫水生生物的分子毒性機(jī)制。此外，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選獲得的分子生物標(biāo)志物，可用于水域環(huán)境污染物的評(píng)估及預(yù)測(cè)，對(duì)水域環(huán)境污染進(jìn)行預(yù)警。

2.1 RNAA--sseeqq 技術(shù)在魚(yú)類(lèi)生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

魚(yú)類(lèi)作為水生食物鏈的頂端生物，是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究中具有重要作用。目前，斑馬魚(yú)（Danio rerio）是水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究通用的模式生物。汞是水環(huán)境中一種廣泛的有毒物質(zhì)，會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)造成有害影響。采用RNA-seq技術(shù)對(duì)低濃度氯化汞（24～120 hpf HgCl2）暴露下斑馬魚(yú)幼體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，分別獲得391 個(gè)上調(diào)基因和87 個(gè)下調(diào)基因，包括補(bǔ)體激活（cfb、c3a、c3b和c3c）、化學(xué)刺激響應(yīng)（keap1a、keap1b）、蛋白酶體通路（psme1、psme2）、核受體信號(hào)傳導(dǎo)通路（nr1d1、nr4a1和nr1d2a）及蛋白激酶（sgk1、sgk2b）等與汞調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，上述這些基因可作為潛在的生物標(biāo)志物，與汞的分析化學(xué)檢測(cè)結(jié)合起來(lái)，用于檢查和評(píng)估汞污染的嚴(yán)重程度。此外，還表征了一種新的汞誘導(dǎo) ABCB（ATP-binding cassette B subfamily）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因abcb5，該基因的過(guò)表達(dá)可顯著降低汞對(duì)細(xì)胞的毒性。上述研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)急性接觸汞后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和解毒能力[25]。氯氰菊酯（beta-cypermethrin，BCP）和毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用引起的水環(huán)境污染問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注。對(duì)暴露在BCP、CPF及這2種農(nóng)藥混合物下的斑馬魚(yú)幼體進(jìn)行RNA-seq，結(jié)果顯示，與單一農(nóng)藥暴露組相比，農(nóng)藥混合暴露組對(duì)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組的影響更大，獲得的差異表達(dá)基因數(shù)量更多[26]。

目前，關(guān)于污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)幼體全轉(zhuǎn)錄特征和分子機(jī)制的研究主要集中于斑馬魚(yú)上，而將RNA-seq 技術(shù)用于研究更多魚(yú)類(lèi)發(fā)育中污染物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄特征，以確定用于監(jiān)測(cè)水生環(huán)境中污染物的生物標(biāo)記物，對(duì)于水域生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有非常重要的意義。利用RNA-seq 技術(shù)對(duì)暴露于8.0 mg·kg-1甲基毒死蜱（chlorpyrifos-methyl）前后的大西洋鮭魚(yú)（Salmo salar）腦、肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，暴露30 d后，在腦組織中有98個(gè)顯著差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEGs），而在暴露 67 d 時(shí)僅發(fā)現(xiàn)了 2 個(gè)；相較之下，在肝組織中分別獲得239、258 個(gè)DEGs，DEGs累積效應(yīng)與暴露時(shí)間正相關(guān)。這說(shuō)明甲基毒死蜱可影響其腦組織中與神經(jīng)疾病和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[27]。水環(huán)境中鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]可通過(guò)食物鏈在水生生物體內(nèi)積累。通過(guò)研究DEHP對(duì)羅非魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組的影響，分別獲得3 217個(gè)上調(diào)基因和1 791 個(gè)下調(diào)基因。這些差異表達(dá)基因主要與機(jī)體免疫、生殖內(nèi)分泌以及脂類(lèi)代謝相關(guān)，可為在轉(zhuǎn)錄組水平篩選DEHP 生物標(biāo)志物、解析DEHP 對(duì)羅非魚(yú)毒性作用的分子機(jī)制提供科學(xué)參考[28]。

在水環(huán)境中，污染物通常以復(fù)雜化合物的混合物形式存在，與單一污染物相比，可能對(duì)生物體產(chǎn)生更為復(fù)雜的影響。如石油泄露可影響?hù)~(yú)類(lèi)種群數(shù)量和多樣性。通過(guò)RNA-seq技術(shù)分析重質(zhì)原油（Iranian heavy crude oil，IHCO）對(duì)胚胎發(fā)育期的野生牙鲆（Paralichthys olivaceus）及花鱸（Lateolabrax maculates）的發(fā)育毒性作用表明，IHCO 暴露可使這2種魚(yú)的基因表達(dá)發(fā)生改變，其中，具有解毒代謝功能的CYP1A1、CYP1B1、AHR 2等基因顯著上調(diào)，而發(fā)育相關(guān)ORG基因則顯著下調(diào)。此外，牙鲆胚胎對(duì)新鮮重質(zhì)原油和風(fēng)化的重質(zhì)原油均敏感，而花鱸胚胎對(duì)風(fēng)化的重質(zhì)原油比對(duì)新鮮的重質(zhì)原油表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明物種特異性差異很可能反映在漏油事件后的種群水平中[29]。

早前的研究大多集中在單一污染物的毒性上，較少關(guān)注多種毒物的綜合毒性以及它們之間相互作用，采用RNA-seq技術(shù)，可鑒定不同物種中對(duì)混合污染物有特異性反應(yīng)的基因，用作環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的潛在分子標(biāo)記。因此，RNA-seq 技術(shù)是研究污染環(huán)境對(duì)魚(yú)類(lèi)生態(tài)毒理效應(yīng)的有效方法，有助于闡明污染物暴露下魚(yú)類(lèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，篩選差異表達(dá)基因及生物標(biāo)志物，為水域環(huán)境污染評(píng)估提供依據(jù)。

2.2 RNAA--sseeqq 技術(shù)在兩棲類(lèi)生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

兩棲動(dòng)物的胚胎及幼體發(fā)育過(guò)程均在水域中進(jìn)行，其皮膚對(duì)水體中的化學(xué)物質(zhì)具有較高的滲透性，也是檢測(cè)水域環(huán)境化學(xué)污染的理想物種。利用RNA-seq 技術(shù)研究有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑敵百蟲(chóng)（trichlorfon）對(duì)中國(guó)林蛙（Rana chensinensis）成體肝臟的毒性作用機(jī)制，共獲得3 329 個(gè)DEGs，其中，與機(jī)體代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平顯著改變。如外源毒性物質(zhì)對(duì)CYP3A具有調(diào)節(jié)作用，毒性物質(zhì)敵百蟲(chóng)在機(jī)體內(nèi)的蓄積可抑制CYP3A1基因表達(dá)；此外，外源毒性物質(zhì)可通過(guò)轉(zhuǎn)錄或有機(jī)體體內(nèi)的不完全降解來(lái)影響GST基因的表達(dá)，GST基因表達(dá)的下調(diào)說(shuō)明它對(duì)敵百蟲(chóng)在林蛙體內(nèi)的毒性降解等生理學(xué)過(guò)程具有重要作用[30]。水生環(huán)境中普遍存在的硝酸鹽成分可能對(duì)兩棲動(dòng)物的生存、發(fā)育和變態(tài)有不利影響。利用RNA-seq 技術(shù)對(duì)硝酸鹽（nitrate）暴露前后的中華蟾蜍（Bufo gargarizans）蝌蚪的肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，硝酸鹽暴露可引起膽汁分泌和氧化應(yīng)激等相關(guān)基因在mRNA水平上的表達(dá)顯著改變，進(jìn)而導(dǎo)致肝組織病理變化[31]。過(guò)量氟會(huì)對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的骨骼發(fā)育產(chǎn)生損害。應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)持續(xù)暴露在1、5、10和20 mg·L-1的氟化鈉4周后各處理組中G40 和G42 期B.gargarizans蝌蚪后肢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果表明，高濃度的氟化物會(huì)影響骨化相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而抑制軟骨內(nèi)骨化[32]。

上述研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù)獲得了污染物暴露下中國(guó)林蛙和中華蟾蜍的轉(zhuǎn)錄組信息，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，有助于探究環(huán)境污染物對(duì)兩棲動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的毒理機(jī)制及組織病理變化機(jī)制，對(duì)了解非模式物種的毒性機(jī)制具有重要價(jià)值，可為兩棲物種的保護(hù)提供理論支持。同時(shí)，RNA-seq 技術(shù)的應(yīng)用也為兩棲物種環(huán)境暴露的分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，可作為水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管理以及水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究的依據(jù)。

2.3 RNAA--sseeqq 技術(shù)在貝類(lèi)生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

貝類(lèi)可通過(guò)濾食方式攝食環(huán)境中的污染物，也是水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究的理想指示物種。采用RNA-seq 技術(shù)分析多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）對(duì)扇貝（Chlamys farreri）消化腺轉(zhuǎn)錄組的影響發(fā)現(xiàn)，PAHs 可顯著改變應(yīng)激反應(yīng)、解毒、抗氧化等基因的表達(dá)[33]。其中，細(xì)胞色素P450（CYP4503A2、CYP4502P1）基因、醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase，QO）基因和谷 胱 甘 肽-S-轉(zhuǎn) 移 酶（glutathione-S-transferase，GST）基因等上調(diào)基因可能作為PAHs 污染的潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究雙殼類(lèi)對(duì)PAHs 污染響應(yīng)的分子機(jī)制及生物標(biāo)志物的選擇提供依據(jù)。利用RNA-seq 技術(shù)對(duì)暴露于敵草?。╠iuron）的太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）子代幼體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄變化研究發(fā)現(xiàn)，將親代暴露于污染物中會(huì)導(dǎo)致子代機(jī)體中與能量、蛋白質(zhì)合成及有絲分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，并且會(huì)在不同代際間傳遞[34]。此外，RNA-seq 技術(shù)也可用于研究水污染對(duì)貝類(lèi)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，結(jié)果顯示，多瑙河沿岸垃圾傾倒點(diǎn)上下游貽貝（Margaritifera margaritifera）樣本轉(zhuǎn)錄組信息僅存在細(xì)微差異，老齡貽貝的初級(jí)代謝和生理機(jī)能受到影響，而幼齡個(gè)體對(duì)暴露于環(huán)境中的污染物則具有更好的恢復(fù)及適應(yīng)能力[35]。這一研究表明，年齡相關(guān)的個(gè)體之間的變異性可對(duì)污染物導(dǎo)致的影響產(chǎn)生掩蓋或偏差，因此，對(duì)于長(zhǎng)壽命雙殼動(dòng)物的生態(tài)毒理學(xué)研究應(yīng)限制在一個(gè)年齡范圍內(nèi)，有利于對(duì)研究結(jié)果做出正確的判斷并對(duì)物種采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施。另一項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期暴露于污水和城市徑流中的河蜆（Corbicula fluminea）參與排毒的基因顯著上調(diào)，說(shuō)明這2 個(gè)位點(diǎn)都存在有機(jī)污染。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果表明，接觸有機(jī)污染物可干擾細(xì)胞信號(hào)通路，從而導(dǎo)致能量障礙、細(xì)胞損傷、免疫紊亂和內(nèi)分泌紊亂。RNA-seq 技術(shù)的應(yīng)用可在整體水平上觀察到對(duì)生物體的有害后果之前，對(duì)水質(zhì)污染做出預(yù)警[36]。

2.4 RNAA--sseeqq 技術(shù)在甲殼類(lèi)生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

水域環(huán)境或養(yǎng)殖系統(tǒng)的污染也會(huì)對(duì)甲殼類(lèi)水生生物產(chǎn)生毒性作用。利用RNA-seq技術(shù)對(duì)暴露于原油的綠尾蝦（Metapenaeus bennettae）肝胰腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，獲得了參與生物體解毒及氧化應(yīng)激的多種生物標(biāo)志物，如細(xì)胞色素p450（cytochrome P450s）、甲殼類(lèi)高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)蛋白和熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)，用于判斷原油污染的存在[37]。對(duì)不同濃度Cd 處理后淡水蟹(Sinopotamon henanense)的肝胰腺進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序和基因表達(dá)分析的結(jié)果表明，Cd 暴露以濃度依賴(lài)的方式改變基因表達(dá)，參與大分子代謝、氧化磷酸化、解毒和抗氧化防御的基因上調(diào)，而除參與吞噬作用外的其他免疫相關(guān)基因下調(diào)，提示淡水蟹可能通過(guò)增加代謝、排毒和抗氧化防御相關(guān)基因的表達(dá)水平而在轉(zhuǎn)錄組水平上降低Cd 的毒性[38]。應(yīng)用RNA-seq技術(shù)考察了大型溞在攝食經(jīng)納米銀和銀離子暴露的斜生柵藻細(xì)胞后的基因毒性作用，結(jié)果表明，編碼磷脂酶PLA2G和磷脂酶D基因的表達(dá)量均下調(diào)，導(dǎo)致磷脂酶的合成量下降，進(jìn)而影響到大型溞小腸正常的消化功能及磷脂類(lèi)脂質(zhì)的代謝過(guò)程[39]。集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)和環(huán)境污染產(chǎn)生的高濃度氨會(huì)對(duì)對(duì)蝦類(lèi)產(chǎn)生脅迫作用。然而，目前對(duì)于該脅迫相關(guān)的分子機(jī)制知之甚少。應(yīng)用RNA-seq 技術(shù)分析凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的抗氨氮脅迫關(guān)鍵基因和代謝途徑，結(jié)果顯示，14 個(gè) GO 功能注釋和 6 個(gè) KEGG 通路顯著改變，在獲得的3 145 個(gè)DEGs 中有136 個(gè)與水生物種中已知的基因具有較高的同源性，有94 個(gè)與免疫功能相關(guān)，其余的基因參與細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)、蛻皮和滲透調(diào)節(jié)。此外，與凋亡和氨氮代謝有關(guān)基因表達(dá)的改變?cè)跍p少氨的毒性中起重要作用[40]。上述結(jié)果反映了急性氨脅迫早期對(duì)基因表達(dá)和代謝通路的影響。氨脅迫可抑制免疫系統(tǒng)，增加蝦對(duì)病原體的易感性，該研究將為進(jìn)一步研究氨脅迫引起對(duì)蝦免疫抑制的分子機(jī)制提供重要信息。

綜上，RNA-seq 技術(shù)研究有助于在分子水平上開(kāi)展污染物毒性作用機(jī)理及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)早期評(píng)價(jià)方面的研究。通過(guò)對(duì)外源污染物脅迫下基因表達(dá)動(dòng)態(tài)（上調(diào)或下調(diào)）和代謝途徑變化的分析，可為污染暴露脅迫下機(jī)體的代謝反應(yīng)機(jī)理研究提供分子基礎(chǔ)，同時(shí)也可篩選水生環(huán)境重金屬污染檢測(cè)的生物標(biāo)記物，為水生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

3 展望

水域是水生生物賴(lài)以生存的環(huán)境，隨著工業(yè)化、城市化進(jìn)程的加速，水污染不僅嚴(yán)重威脅著水域生態(tài)系統(tǒng)平衡，影響水生生物的生存、繁衍，還可通過(guò)食物鏈傳遞，危害人類(lèi)健康[41]。而RNA-seq 技術(shù)在水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，對(duì)于闡明有毒化學(xué)物對(duì)水生生物的影響、預(yù)測(cè)并減少水體污染物對(duì)水生生物和環(huán)境的影響等均具有優(yōu)勢(shì)。目前，水生生物中僅有模式生物斑馬魚(yú)和少量水生生物的基因組可作為參考序列，而RNA-seq 技術(shù)的應(yīng)用不需要參考基因組，可直接將得到的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)、基因功能分類(lèi)與注釋。

與傳統(tǒng)的文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序技術(shù)相較，RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用具有一定的優(yōu)勢(shì)，如所需樣品量少、背景信號(hào)低、成本較低。但其技術(shù)本身仍存在不足。首先，RNA 提取過(guò)程需去除rRNA 會(huì)帶來(lái)改變其他RNA 濃度的潛在風(fēng)險(xiǎn)，有可能使檢測(cè)到的RNA 發(fā)生偏差。其次，測(cè)序平臺(tái)需要在測(cè)序之前進(jìn)行擴(kuò)增，這一步驟會(huì)根據(jù)GC 含量和長(zhǎng)度引入偏差[42]。與此同時(shí)，RNA-seq 技術(shù)也面臨著一些挑戰(zhàn)：①測(cè)序所產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)的高效快捷處理，需要研究開(kāi)發(fā)更好的數(shù)據(jù)處理方法和軟件；②如何通過(guò)理論與技術(shù)的系統(tǒng)結(jié)合，將RNA-seq數(shù)據(jù)分析、綜合、存儲(chǔ)與傳統(tǒng)生物學(xué)、化學(xué)、毒理學(xué)研究有效結(jié)合起來(lái)，使其更好地在水生生物毒理學(xué)研究中發(fā)揮作用，有待更深入的研究；③由于基因組中轉(zhuǎn)錄活性變化很大，如何選擇合適的測(cè)序深度以達(dá)到足夠的覆蓋度并降低檢測(cè)成本，還需要進(jìn)一步考量[5]。

在過(guò)去的十幾年里，RNA-seq 技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于水生生物對(duì)環(huán)境污染物的反應(yīng)所涉及的分子機(jī)制的研究起到了很好的推動(dòng)作用?，F(xiàn)有的研究主要是應(yīng)用RNA-seq技術(shù)來(lái)研究有毒物質(zhì)對(duì)某一個(gè)特定時(shí)期的水生生物的影響，而低劑量或?qū)嶋H環(huán)境濃度的水域污染對(duì)處于不同發(fā)育階段水生生物的毒性作用機(jī)制的動(dòng)態(tài)研究尚欠缺，后續(xù)需加強(qiáng)這方面的研究[43]。RNA-seq 技術(shù)在水生生物生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，不僅為研究污染物脅迫下水生生物機(jī)體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了便利，而且也為特定藥物毒理學(xué)研究提供了平臺(tái)，同時(shí)其所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也可為不同水生生物的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。